Источник: Merenda, A. et al., A Protocol for Multiple Gene Knockout in Thin Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer. J. Vis. Exp. (2017).
В этом видео описывается техника нокаута генов с использованием CRISPR-конкатемера для одновременного нокаутирования нескольких генов в культивируемых органоидных клетках кишечника мыши. Этот метод используется для того, чтобы нокаутировать больной ген и выяснить функцию гена и его паралогов.
1. Дизайн гРНК для вектора CRISPR-конкатемер
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этого раздела – объяснить, как выбрать наилучшую стратегию нацеливания и как спроектировать гРНК, содержащие определенные выступы для вектора CRISPR-конкатемера.
2. Клонирование гРНК в вектор CRISPR-конкатемер
3. Трансфекция кишечных органоидов методом электропорации
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, что эта процедура основана на протоколе, опубликованном Fujii et al. в 2015 году, с адаптацией для культур органоидов тонкого кишечника мышей.
Кассета 1 | Кассета 2 | Кассета 3 | Кассета 4 | |
Последовательность (5′-3′) | CACCGG[gRNA1]GT | ACCGG[gRNA2]G | КГГ[гРНК3] | ACACCGG[gRNA4]GTT |
Последовательность (5′-3′) | TAAAAC[RC-gRNA1]CC | AAAAC[RC-gRNA2]C | AAAC[RC-gRNA3] | CTAAAAC[RC-gRNA4]CCG |
Таблица 1: Выступы для каждой кассеты вектора CRISPR-конкатемера.
Базальная среда | Комментарии | |
Хранить при температуре 4 °C в течение 4 недель | ||
Среда для культивирования клеток | 500 мл | Посмотреть таблицу материалов |
L-глютамин | 100x 5 мл | |
Буферизатор 1 М | 5 мл | Посмотреть таблицу материалов |
Пенициллин стрептомицин | 100x 5 мл | |
WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + Rspondin + Nicotinamide) | ||
Хранить при температуре 4 °C в течение 2 недель | ||
Базальная среда | до 50 мл | |
Добавка без сыворотки нейрональных клеток (50x) | 1 мл | Посмотреть таблицу материалов |
Добавка без сыворотки нейрональных клеток (100x) | 500 мкл | Посмотреть таблицу материалов |
н-ацетилцистеин (500 мМ) | 125 μл | |
ЭФР мыши (100 мкг/мл) | 25 мкл | |
мышиный Noggin (100 мкг/мл) | 50 μл | |
Кондиционированная среда R-Spondin | 5 мл | |
Wnt3a кондиционированная среда | 25 мл | |
Никотинамид (1 М) | 250 мкл | |
EN + CHIR + Y-27632 (ЭФР + Noggin + CHIR + Y-27632) | ||
Хранить при температуре 4 °C в течение 2 недель | ||
Базальная среда без пенициллина стрептомицина | до 20 мл | |
Добавка без сыворотки нейрональных клеток (50x) | 400 мкл | Посмотреть таблицу материалов |
Добавка без сыворотки нейрональных клеток (100x) | 200 μл | Посмотреть таблицу материалов |
н-ацетилцистеин (500 мМ) | 50 μл | |
ЭФР мыши (100 мкг/мл) | 10 μл | |
мышиный Noggin (100 мкг/мл) | 20 μл | |
Y-27632 (10 мкМ) | 20 μл | |
CHIR99021 (8 мкМ) | 10 μл | |
EN (EGF + Noggin) | ||
Хранить при температуре 4 °C в течение 4 недель | ||
Базальная среда | до 50 мл | |
Добавка без сыворотки нейрональных клеток (50x) | 1 мл | Смотрите таблицу материалов |
Добавка без сыворотки нейрональных клеток (100x) | 500 мкл | Смотрите таблицу материалов |
н-ацетилцистеин (500 мМ) | 125 μл | |
ЭФР мыши (100 мкг/мл) | 25 мкл | |
мышиный Noggin (100 мкг/мл) | 50 μл |
Таблица 2: Состав органоидной среды.
Поринг пульса | Передаточный импульс | |
напряжение | 175 В | 20 В |
Длина импульса | 5 мсек | 50 мсс |
Интервал между импульсами | 50 мсс | 50 мсс |
Количество импульсов | 2 | 5 |
скорость разложения | 10% | 40% |
полярность | + | T+/- |
Таблица 3: Настройки электропорации.
The authors have nothing to disclose.
Optimized CRISPR Design Tool | Feng Zhang group | CRISPR gRNA design tool; http://crispr.mit.edu/ | |
Webcutter 2.0 | restriction mapping tool; http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/ | ||
T4 PNK (Polynucleotide Kinase) | New England Biolabs | M0201L | |
T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | M0202S | |
T7 DNA Ligase | New England Biolabs | M0318L | |
DTT (dithiothreitol) | Promega | P1171 | |
ATP (adenosine triphosphate) | New England Biolabs | P0756S | |
FastDigest BbsI (BpiI) | Thermo Fisher | FD1014 | |
Tango buffer (BSA-containing restriction enzyme buffer) | Thermo Fisher | BY5 | |
BglII | New England Biolabs | R0144 | |
EcoRI | New England Biolabs | R0101 | |
Plasmid-safe exonuclease | Cambio | E3101K | |
Thermal cycler | Applied biosystems | 4359659 | |
10G competent E. coli bacteria | Cambridge Bioscience | 60108-1 | |
Advanced DMEM/F12(cell culture medium) | Invitrogen | 12634-034 | |
Glutamax (L-Glutamine) | 100x Invitrogen | 35050-068 | |
HEPES 1 M (buffering agent) | Invitrogen | 15630-056 | |
Penicillin-streptomycin 100x | Invitrogen | 15140-122 | |
B27 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
N2 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
n-Acetylcysteine 500 mM | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
Mouse EGF 500 μg/mL | Invitrogen Biosource | PMG8043 | |
Mouse Noggin 100 μg/mL | Peprotech | 250-38 | |
Nicotinamide 1 M | Sigma | N0636 | |
R-Spondin conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 |
Wnt conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2014 |
Y-27632 10 μM | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
Standard BD Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | |
48-well Plate | Greiner Bio One | 677980 | |
CHIR99021 | Sigma-Aldrich | A3734-1MG | |
IWP-2 | Cell Guidance Systems | SM39-10 | |
TrypLE (recombinant protease) | Invitrogen | 12605-010 | |
Opti-MEM (reduced serum medium) | Life technologies | 51985-034 | |
Electroporation Cuvettes 2 mm gap | NepaGene | EC-002S | |
Low binding 15 mL tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
Bürker’s chamber | Sigma-Aldrich | BR719520-1EA | |
NEPA21 Super Electroporator | NepaGene | contact supplier | |
Protein LoBind tubes low binding | Thermo Fisher | 10708704 | |
BTXpress electroporation buffer | Harvard Apparatus | 45-0805 | |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | AppliChem | A3672 |