Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Abstract

Источник: Merenda, A. et al., A Protocol for Multiple Gene Knockout in Thin Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer. J. Vis. Exp. (2017).

В этом видео описывается техника нокаута генов с использованием CRISPR-конкатемера для одновременного нокаутирования нескольких генов в культивируемых органоидных клетках кишечника мыши. Этот метод используется для того, чтобы нокаутировать больной ген и выяснить функцию гена и его паралогов.

Protocol

1. Дизайн гРНК для вектора CRISPR-конкатемер

ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этого раздела – объяснить, как выбрать наилучшую стратегию нацеливания и как спроектировать гРНК, содержащие определенные выступы для вектора CRISPR-конкатемера.

1. Проектируйте гРНК против интересующих генов с помощью выбранного инструмента дизайна гРНК CRISPR. Пример см. в Таблице материалов.
   заметка: При нацеливании на пару паралогичных генов, хотя возможно сконструировать одну гРНК на ген, рекомендуется сконструировать две гРНК на ген, чтобы увеличить шансы на достижение двойного нокаута (рис. 1).
2. Убедитесь, что гРНК не содержат сайт распознавания BbsI, с помощью инструмента отображения рестрикции (см. пример в Таблице материалов).
3. Добавьте к каждому олигопласту определенные векторные свесы CRISPR-concatemer, как показано в таблице 1.

2. Клонирование гРНК в вектор CRISPR-конкатемер

1. Фосфорилирование и отжиг олиго
   заметка: На этом этапе показано, как отжигать верхнюю и нижнюю нити для каждого олиго гРНК и как фосфорилировать их концы в одной реакции.
   1. Приготовьте реакционную смесь для фосфорилирования олигонов и отжига верхних и нижних нитей на льду, следуя приведен><ным ниже инструкциям. заметка: Все олигопласты могут быть объединены в одну реакцию; Например, в случае вектора-конкатемера из 4 гРНК, объедините 8 олигону.
   2. Для 3 конкатемеров используйте верхнюю цепь 3,0 мкл гРНК (1,0 мкл от каждой гРНК; 10 мкМ, 1 мкл/гРНК), 3,0 мкл нижней цепи гРНК (1,0 мкл от каждой гРНК; 10 мкМ, 1 мкл/гРНК), 2,0 мкл буфера ДНК-лигазы T4 (10x), 1,0 мкл T4 PNK и добавьте H₂O до общего объема 20,0 μл.
   3. Хорошо перемешайте с помощью пипетирования и запустите его в амплификаторе со следующими настройками: 37 °C в течение 30 минут, 95 °C в течение 5 минут, уменьшите температуру до 25 °C при 0,3 °C/мин, держите при 4 °C.
2. BbsЯ перетасовываю реакцию
   заметка: В этом разделе предварительно отожженные олигоины гРНК встраиваются в соответствующее положение конкатемерного вектора за один этап путем чередования циклов расщепления и лигирования.
   1. Разбавьте реакционную смесь в соотношении 1:100 в воде, не содержащей ДНКазы/РНКазы, для получения векторов конкатемера 3 и 4 гРНК.
      заметка: При клонировании 2 гРНК-конкатемеров этот шаг не нужен.
   2. Соберите BbsI перетасовка реакции на льду, следуя приведенным ниже инструкциям. Включите отрицательный элемент управления, который содержит только вектор.
   3. Используйте 100 нг вектора CRISPR-конкатемера, 10,0 мкл смеси олиго, 1,0 мкл буфера фермента рестрикции, содержащего 1,0 мкл (10x), 1,0 мкл DTT (10 мМ), 1,0 мкл АТФ (10 мМ), 1,0 мкл BbsI, 1,0 мкл Т7 лигазы и H₂O до общего объема 20,0 мкл.
   4. Хорошо перемешайте с помощью пипетирования и запустите его в термоамплификаторе со следующими настройками: Запустите 50 циклов для клонирования 3 и 4 конкатемеров гРНК и 25 циклов для 2 конкатемеров гРНК, оба при 37 °C в течение 5 минут, 21 °C в течение 5 минут, держите при 37 °C в течение 15 минут, затем 4 °C навсегда.
3. Лечение экзонуклеазами
   заметка: Этот шаг настоятельно рекомендуется, так как он повышает эффективность клонирования за счет удаления любых следов линеаризованной ДНК.
   1. Обрабатывайте реакцию перетасовки BbsI с помощью ДНК-экзонуклеазы (см. Таблицу материалов) следующим образом.
   2. Возьмите 11,0 мкл смеси для лигирования на предыдущем этапе (2.2.3), добавьте 1,5 мкл экзонуклеазного буфера (10x), 1,5 мкл АТФ (10 мМ), 1,0 мкл экзонуклеазы ДНК и доведите общий объем до 15,0 мкл с водой. Инкубировать при 37 °C в течение 30 мин, затем при 70 °C в течение 30 мин.
      заметка: На этом этапе удаляется любая остаточная линеаризованная ДНК в смеси и, таким образом, повышается эффективность клонирования.
   3. Используйте 2 мкл реакционной смеси для превращения в химически компетентные бактерии E. coli путем теплового шока.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы реакцию можно хранить до одной недели при температуре -20 °C.

3. Трансфекция кишечных органоидов методом электропорации

ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, что эта процедура основана на протоколе, опубликованном Fujii et al. в 2015 году, с адаптацией для культур органоидов тонкого кишечника мышей.

1. Предварительная электропорация
   заметка: В этом разделе описывается, как получить кишечные органоиды мыши перед электропорацией путем удаления всех антибиотиков и кондиционированных сред из их питательной среды. Это предотвратит возможные токсические эффекты во время электропорации.
   1. На 0-й день процедуры трансфекции расщепляют органоиды в соотношении 1:2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Культуры кишечных органоидов могут быть получены путем проведения изоляции крипты в соответствии с ранее установленными протоколами. Пожалуйста, обратитесь к таблице 2 для всех композиций носителей.
      1. При расщеплении органоидов для электропорации засейте минимум 6 лунок 48-луночного планшета за одну трансфекцию.
      2. Засейте органоиды в капли матрицы объемом 20 мкл и вырастите их в среде WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + R-спондин + никотинамид) при 37 °C, 5%_CO2 в увлажненном инкубаторе (как описано ранее).
   2. На 2-й день смените среду, заменив WENR+Nic на 250 мкл EN (EGF + Noggin) + CHIR99021 (ингибитор гликогенсинтазы киназы-3) + Y-27632 (ингибитор ROCK), без антибиотиков (см. таблицу 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: На всех этапах количество среды, добавляемой в каждую лунку 48-луночного планшета, составляет 250 мкл.
   3. На 3-й день смените органоидную среду на EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1,25% v/v диметилсульфоксида (ДМСО), без антибиотиков.
2. Подготовка клеток
   заметка: В этой статье мы опишем, как фрагментировать органоиды на мелкие клеточные кластеры путем механической и химической диссоциации. Эти шаги имеют решающее значение для успеха процедуры.
   1. На 4-й день разрушьте купола матрицы основания с помощью наконечника для пипетки объемом 1 мл и перенесите органоиды в пробирку объемом 1,5 мл. Бассейн содержимого четырех лунок 48-луночной пластины в трубку.
   2. Механически разбивайте органоиды на мелкие фрагменты, пипетируя пипеткой вверх и вниз с помощью пипетки P200 примерно 200 раз. Центрифуга при комнатной температуре, 5 мин при 600 x g.
   3. Удалите среду и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл рекомбинантной протеазы клеточной культуры (см. таблицу материалов). Инкубируйте при температуре 37 °C в течение максимум 5 минут, а затем проверьте каплю образца объемом 50 мкл под микроскопом с инвертированным светом с объективом 4x.
      заметка: Желательны кластеры по 10-15 клеток, так как это повышает выживаемость клеток после электропорации.
   4. Перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл с низким связыванием и остановите диссоциацию, добавив 9 мл базальной среды без антибиотиков (см. таблицу 2). Центрифугируйте при комнатной температуре, 5 мин при 600 x g, затем выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл восстановленной сывороточной среды (см. Таблицу материалов).
   5. Подсчитайте количество ячеек с камерой Бюркера и используйте минимум 1 x 10⁵ ячеек на одну реакцию электропорации. Добавьте 9 мл восстановленной сывороточной среды в пробирку объемом 15 мл и центрифугуйте при комнатной температуре, 3 мин при 400 х г.
3. Электропорация заметка: В следующих разделах приведены инструкции по проведению электропорации и последующему восстановлению органоидов.
   1. Удалите всю надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в растворе для электропорации (см. Таблицу материалов). Добавьте в суспензию клетки в общей сложности 10 г ДНК и добавьте раствор электропорации до конечного объема 100 μл и держите смесь клетки и ДНК на льду. Используйте векторы-конкатамеры CRISPR в сочетании с плазмидой экспрессии Cas9 (например, Addgene #41815) в соотношении 1:1.
      заметка: Общий объем добавляемой ДНК должен быть меньше или равен 10% от общего объема реакции.
   2. Включите отдельную трансфекционную смесь, содержащую GFP-плазмиду для оценки эффективности трансфекции (например, pCMV-GFP, Addgene #11153 или любую генерическую GFP-экспрессирующую плазмиду).
   3. Добавьте смесь клетки-ДНК в кювету для электропорации и поместите ее в камеру электропоратора. Измерьте импеданс, нажав соответствующую кнопку на электропораторе, и убедитесь, что он составляет 0,030-0,055 кОм. Проводите электропорацию в соответствии с настройками, приведенными в таблице 3.
      заметка: Если значение импеданса выходит за пределы допустимого диапазона, отрегулируйте объем раствора в кювете.
   4. Добавьте в кювету 400 мкл буфера для электропорации + Y-27632, а затем переложите все в пробирку объемом 1,5 мл. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы дать клеткам восстановиться, а затем вращать их при комнатной температуре в течение 3 минут при 400 x g.
   5. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 20 мкл/лунку матрицы фундамента. Засейте примерно от 1 x 104 до 1 x 105 клеток на лунку в 48-луночный планшет и добавьте EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1,25% v/v среды DMSO. Инкубировать при 37 °C.
   6. На 5-й день измените среду на EN + CHIR99021 + Y-27632 и проверьте эффективность трансфекции, наблюдая за экспрессией GFP (рис. 2). Храните органоиды при температуре 37 °C и обновите среду EN + CHIR99021 + Y-27632 через 2 дня.
   7. На 9 день смените среду на WENR + Nic + Y-27632 и инкубируйте при 37 °C.
      заметка: Y-27632 можно удалить через 7-10 дней (на 16-19 день).

	Кассета 1	Кассета 2	Кассета 3	Кассета 4
Последовательность (5′-3′)	CACCGG[gRNA1]GT	ACCGG[gRNA2]G	КГГ[гРНК3]	ACACCGG[gRNA4]GTT
Последовательность (5′-3′)	TAAAAC[RC-gRNA1]CC	AAAAC[RC-gRNA2]C	AAAC[RC-gRNA3]	CTAAAAC[RC-gRNA4]CCG

Таблица 1: Выступы для каждой кассеты вектора CRISPR-конкатемера.

Базальная среда		Комментарии
Хранить при температуре 4 °C в течение 4 недель
Среда для культивирования клеток	500 мл	Посмотреть таблицу материалов
L-глютамин	100x 5 мл
Буферизатор 1 М	5 мл	Посмотреть таблицу материалов
Пенициллин стрептомицин	100x 5 мл
WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + Rspondin + Nicotinamide)
Хранить при температуре 4 °C в течение 2 недель
Базальная среда	до 50 мл
Добавка без сыворотки нейрональных клеток (50x)	1 мл	Посмотреть таблицу материалов
Добавка без сыворотки нейрональных клеток (100x)	500 мкл	Посмотреть таблицу материалов
н-ацетилцистеин (500 мМ)	125 μл
ЭФР мыши (100 мкг/мл)	25 мкл
мышиный Noggin (100 мкг/мл)	50 μл
Кондиционированная среда R-Spondin	5 мл
Wnt3a кондиционированная среда	25 мл
Никотинамид (1 М)	250 мкл
EN + CHIR + Y-27632 (ЭФР + Noggin + CHIR + Y-27632)
Хранить при температуре 4 °C в течение 2 недель
Базальная среда без пенициллина стрептомицина	до 20 мл
Добавка без сыворотки нейрональных клеток (50x)	400 мкл	Посмотреть таблицу материалов
Добавка без сыворотки нейрональных клеток (100x)	200 μл	Посмотреть таблицу материалов
н-ацетилцистеин (500 мМ)	50 μл
ЭФР мыши (100 мкг/мл)	10 μл
мышиный Noggin (100 мкг/мл)	20 μл
Y-27632 (10 мкМ)	20 μл
CHIR99021 (8 мкМ)	10 μл
EN (EGF + Noggin)
Хранить при температуре 4 °C в течение 4 недель
Базальная среда	до 50 мл
Добавка без сыворотки нейрональных клеток (50x)	1 мл	Смотрите таблицу материалов
Добавка без сыворотки нейрональных клеток (100x)	500 мкл	Смотрите таблицу материалов
н-ацетилцистеин (500 мМ)	125 μл
ЭФР мыши (100 мкг/мл)	25 мкл
мышиный Noggin (100 мкг/мл)	50 μл

Таблица 2: Состав органоидной среды.

T

	Поринг пульса	Передаточный импульс
напряжение	175 В	20 В
Длина импульса	5 мсек	50 мсс
Интервал между импульсами	50 мсс	50 мсс
Количество импульсов	2	5
скорость разложения	10%	40%
полярность	+	+/-

Таблица 3: Настройки электропорации.

Representative Results

Materials

Optimized CRISPR Design Tool 	Feng Zhang group 		CRISPR gRNA design tool; http://crispr.mit.edu/
Webcutter 2.0 			restriction mapping tool; http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/
T4 PNK (Polynucleotide Kinase) 	New England Biolabs 	M0201L
T4 DNA ligase buffer 	New England Biolabs 	M0202S
T7 DNA Ligase 	New England Biolabs	 M0318L
DTT (dithiothreitol) 	Promega 	P1171
ATP (adenosine triphosphate) 	New England Biolabs 	P0756S
FastDigest BbsI (BpiI) 	Thermo Fisher 	FD1014
Tango buffer (BSA-containing restriction enzyme buffer)	Thermo Fisher 	BY5
BglII 	New England Biolabs 	R0144
EcoRI 	New England Biolabs 	R0101
Plasmid-safe exonuclease 	Cambio 	E3101K
Thermal cycler 	Applied biosystems 	4359659
10G competent E. coli bacteria 	Cambridge Bioscience 	60108-1
Advanced DMEM/F12(cell culture medium)	Invitrogen 	12634-034
Glutamax (L-Glutamine) 	100x Invitrogen 	35050-068
HEPES 1 M (buffering agent) 	Invitrogen 	15630-056
Penicillin-streptomycin 100x 	Invitrogen 	15140-122
B27 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 50x	Invitrogen 	17504-044
N2 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 100x	Invitrogen 	17502-048
n-Acetylcysteine 500 mM 	Sigma-Aldrich 	A9165-5G
Mouse EGF 500 μg/mL 	Invitrogen Biosource 	PMG8043
Mouse Noggin 100 μg/mL 	Peprotech	 250-38
Nicotinamide 1 M 	Sigma 	N0636
R-Spondin conditioned medium 	n.a. 	n.a. 	Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013
Wnt conditioned medium	n.a. 	n.a. 	Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2014
Y-27632 10 μM 	Sigma-Aldrich 	Y0503-1MG
Standard BD Matrigel matrix 	BD Biosciences	356231
48-well Plate 	Greiner Bio One 	677980
CHIR99021 	Sigma-Aldrich 	A3734-1MG
IWP-2 	Cell Guidance Systems 	SM39-10
TrypLE (recombinant protease)	 Invitrogen 	12605-010
Opti-MEM (reduced serum medium)	Life technologies	 51985-034
Electroporation Cuvettes 2 mm gap 	NepaGene 	EC-002S
Low binding 15 mL tubes 	Sigma-Aldrich 	CLS430791
Bürker’s chamber 	Sigma-Aldrich	 BR719520-1EA
NEPA21 Super Electroporator 	NepaGene 	contact supplier
Protein LoBind tubes low binding	Thermo Fisher 	10708704
BTXpress electroporation buffer 	Harvard Apparatus 	45-0805
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	 AppliChem	 A3672