Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Abstract

Источник: Jia, Z. et al., a 5-mC Dot Blot Analysis, количественно определяющий уровень метилирования ДНК дедифференцировки хондроцитов in vitro.J. Vis. Exp.(2017)

Это видео описывает технику дот-блоттинга для определения уровня метилирования ДНК в хондроцитах человека in vitro путем блоттинга образцов ДНК на нейлоновой мембране и последующей визуализации с использованием моноклональных антител. Это помогает определить фенотип хондроцитов на различных этапах культивирования.

Protocol

1. Сбор ткани суставного хряща человека и культура хондроцитов

1. Подготовка материалов
   1. Приготовьте модифицированную среду Dulbecco Eagle Medium (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицина. Приготовьте 1 мг/мл коллагеназы II, 0,25% трипсин-ЭДТА, фосфатно-солевой буфер (PBS) и клеточное ситечко (нейлон 40 мкм).
2. Забор ткани суставного хряща человека
   1. Изолировать суставной хрящ из коленных суставов у донорских пациентов после травмы. Получите информированное согласие всех участников.
   2. Нарежьте хрящ на^{1-2 мм 3} части с помощью стерильного скальпеля и расщепите хондроциты из измельченного хряща с 1 мг/мл коллагеназы II в DMEM при 37 °C в течение 12-16 часов.
   3. Полученную клеточную суспензию профильтровать через клеточное ситечко (40 мкм) и дважды промыть PBS.
   4. Подсчитывают клетки с помощью гемоцитометра и затравки при плотности 20 000-30 000 клеток/^см2 в DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина.
   5. Выращивание в инкубаторе при 37 °С.
3. Расширение монослойных хондроцитов
   1. Соберите субконфлюентные клетки, используя 0,25% трипсина-ЭДТА, и повторно очистите при плотности 6600 клеток/^см2. Меняйте среду два раза в неделю.
   2. Культивируйте хондроциты в монослоях до шести пассажей и оценивайте в пассажах 1, 2, 3, 4 и 5.

2. Экстракция геномной ДНК (гДНК)

1. Соберите клетки и ресуспендируйте в буфере для лизиса 500 мкл (15 мМ Tris pH 8,0, 10 мМ EDTA pH 8,0, 0,5% SDS, 200 мкг/мл РНКазы А) на 10 миллионов клеток. Ресуспендировать клетки с помощью пипетирования и быстрой инверсии, а затем инкубировать в течение 1 ч при 37 °C.
2. Добавьте протеиназу К в концентрации 160 мкг/мл клеточного лизата и энергично инвертируйте смесь. Инкубировать 6 ч при 55 °C.
3. Добавьте в образец один объем насыщенного фенола:хлороформа:изоамилового спирта (25:24:1) по шкале Трис рН 7,9. Тщательно встряхните образец вручную в течение примерно 20 с.
4. Центрифугируйте образец при комнатной температуре в течение 5 мин при 13 000 × г. Удалите верхнюю водную фазу и переложите слой в свежую трубку.
5. Экстракт с равным объемом хлороформа удалить фенол и перенести верхнюю водную фазу в свежую пробирку.
6. Осаждение ДНК путем добавления 0,1 объема образца 3 М ацетата натрия pH 8,0 и 2 объема 100% этанола.
7. Храните пробирку при температуре -20 °C в течение ночи, чтобы выпасть в осадок гДНК.
8. Центрифугируйте образец при 4 °C в течение 10 мин при 16 000 x g до гранулирования гДНК.
9. Промойте образец три раза с 70% этанолом и центрифугируйте при 4 °C в течение 2 минут при 13 000 x g.
10. Осторожно удалите надосадочную жидкость, а затем высушите на воздухе. Ресуспендировать ДНК в 10 мМ Tris pH 8,0, 0,1 мМ ЭДТА.

3. Профилирование метилирования ДНК

1. Используйте набор для метилирования ДНК для проведения реакции конверсии бисульфита с использованием в общей сложности 500 нг геномной ДНК в соответствии с протоколом производителя. Разбавьте 10 мкл элюирующего буфера (50 нг/мкл).
2. Профилирование метилирования ДНК с помощью коммерческого набора в соответствии с протоколом производителя.

4. Анализ точечных блоттингов

1. Денатурируйте выделенную ДНК (1 мг на образец) в 0,1 М NaOH в течение 10 мин при 95 °С. Нейтрализуйте ДНК 1 М NH₄OAc на льду, а затем разбавьте в два раза. Обнаружите 2 мкл серийной разбавленной геномной ДНК на мембране N⁺.
2. Промокните мембрану при температуре 80 °C в течение 30 минут.
3. Блокируйте неспецифические сайты связывания антител путем замачивания N⁺ мембраны в 5% BSA в TBS-T в течение 1 ч. Используйте чашку Петри диаметром 10 см в качестве реакционной камеры при комнатной температуре.
4. После 5 мин трехкратной промывки в TBST инкубируйте мембрану с мышиным моноклональным антителом против 5-метилцитозина (5-mC) (1:1000) в TBS-T при 4 °C в течение ночи.
5. Промыть мембрану в течение 5 мин трижды в TBS-T, а затем инкубировать с вторичным антителом, HRP-конъюгированным овечьим антимышиным иммуноглобулином G (IgG) (1:5000) в TBS-T в течение 1 ч при комнатной температуре.
6. Промойте мембрану в течение 5 мин трижды в TBS-T.
7. Добавьте ферментный субстрат в мембрану и инкубируйте в течение 5-10 мин. Визуализируйте вторичный сигнал антитела с помощью набора для хемилюминесценции в соответствии с инструкциями производителя.

Materials

<strong>Reagents</strong>
DMEM&nbsp;&nbsp;	Gibco Inc.	11965&ndash;092	Warm in 37 &deg;C water bath before use
Phosphate-Buffered Saline(PBS)	HyClone Inc.	SH30256.01B	D-PBS, free of&nbsp;Ca2+/Mg2+
FBS	Gibco Inc.	10099-141
0.25%Trypsin/EDTA	Gibco Inc.	25200-056
1%Penicillin-Streptomycin	Gibco Inc.	15140-122
Chloroform	Mallinckrodt	4440
Isoamyl Alcohol	Sigma	I-3643
Phenol	Gibco BRL	15513-039
Proteinase K	Gibco BRL	24568-2
TAE buffer&nbsp;	Bio Whittaker	16-011V
Distilled Water	Gibco BRL	15230-170
1 M Tris-HCl	Biosharp Inc.	BL514A
Tween20	Biotopped Inc.	C58H114O26
BSA	Proliant Inc.	68700
Collagenase, Type II	Sigma-Aldrich	C6885
<strong>Equipment</strong>
Cell Strainer (40&mu;m nylon)	FALCON Inc.	352340
Hemocytometer	ISOLAB Inc.	075.03.001
Falcon 100 mm&nbsp; dish	Corning	353003
Centrifuge Tubes	TPP AG	91050	Gamma-sterilized
High-speed centrifuge	Eppendorf	5804R
ThermoMixer	MIULAB	MTH-100
Carbon dioxide cell incubator	Thermo scientific	3111
Chemi-imaging Analyse System	UVITEC Cambridge	ALLIANCE