Источник: Jia, Z. et al., a 5-mC Dot Blot Analysis, количественно определяющий уровень метилирования ДНК дедифференцировки хондроцитов in vitro.J. Vis. Exp.(2017)
Это видео описывает технику дот-блоттинга для определения уровня метилирования ДНК в хондроцитах человека in vitro путем блоттинга образцов ДНК на нейлоновой мембране и последующей визуализации с использованием моноклональных антител. Это помогает определить фенотип хондроцитов на различных этапах культивирования.
1. Сбор ткани суставного хряща человека и культура хондроцитов
2. Экстракция геномной ДНК (гДНК)
3. Профилирование метилирования ДНК
4. Анализ точечных блоттингов
The authors have nothing to disclose.
<strong>Reagents</strong> | |||
DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
Phosphate-Buffered Saline(PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
0.25%Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
1%Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
<strong>Equipment</strong> | |||
Cell Strainer (40μm nylon) | FALCON Inc. | 352340 | |
Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |