Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Abstract

Источник: Li, J., et al. Идентификация гомологичных рекомбинационных событий в эмбриональных стволовых клетках мыши с использованием южного блоттинга и полимеразной цепной реакции. J. Vis. Exp. (2018).

В этом видео мы описываем метод Саузерн-блоттинга для идентификации гомологичных рекомбинационных событий в геноме эмбриональных стволовых клеток мыши с помощью радиоактивно меченых зондов. Участки ДНК, содержащие гомологичные события рекомбинации, проявляются в виде отдельных полос, когда мембрана, содержащая зонд-связанную ДНК, подвергается воздействию рентгеновских лучей.

Protocol

1. Подготовка геномных ДНК и переваривание с помощью фермента (ферментов) рестрикции.

1. Получение гДНК из эмбриональных стволовых клеток (ES-клеток) с помощью коммерческого набора (genomic DNA purification kit) с незначительными изменениями.
   1. Удалите среду из культуры клеток ЭС и добавьте 500 мкл раствора для лизиса ядер, включая РНКазу, непосредственно в лунки для лизиса клеток.
      заметка: Лизат клеток можно хранить при температуре -80 °C или обрабатывать немедленно.
   2. Пипетируйте вверх и вниз несколько раз, чтобы полностью лизировать клетки и перенести их в чистую пробирку объемом 1,5 мл.
   3. Добавьте одну треть объема раствора для осаждения белка в пробирку объемом 1,5 мл, энергично перемешайте в течение 20 с, охладите образцы на льду в течение 5 мин, а затем центрифугируйте с силой 2000 x g в течение 5 мин. Перенесите надосадочную жидкость в другую чистую пробирку объемом 1,5 мл, содержащую такой же объем изопропанола; аккуратно перемешайте раствор. (Обратите внимание, что в этот момент можно увидеть белые нити, похожие на нити.) Центрифуга с усилием 2 000 x g в течение 1 мин; Затем выбросьте надосадочную жидкость.
   4. Промойте гранулу гДНК 1 мл 70% этанола при комнатной температуре, центрифугируйте с усилием 2 000 х г в течение 1 минуты, тщательно отасуньте надосадочную жидкость, а затем высушите гранулу гДНК на воздухе в течение 3 минут.
   5. Растворите гДНК в 100 мкл раствора для регидратации ДНК, а затем инкубируйте при 65 °C в течение 1 ч или при 4 °C в течение ночи.
   6. Храните гДНК при температуре 2–8 °C.
2. Расщепляйте гДНК с помощью предварительно разработанного RE Dra I. Запустите реакцию разложения объемом 30 мкл путем смешивания 3 мкл 10-кратного буфера для Dra I, 3 мкл Dra I, 10 мкг гДНК на образец и H₂O до 30 мкл, и инкубируйте при 37 °C в течение ночи.
3. Проверьте полноту расщепления с помощью геля ДНК, анализируя 5 мкл переваренной реакции, а затем добавьте 3 мкл 10-кратного буфера для загрузки ДНК для следующего этапа.

2. Южный блоттинг

1. Скрининг южного блоттинга
   1. Разделите расщепленные гДНК с помощью электрофореза и перенесите их на мембрану.
      1. Приготовьте 1% агарозный гель для электрофореза с бромидом этидия (EB), загрузите расщепленные образцы гДНК и лестницу объемом 1 kb, а затем запустите гель с низким напряжением (30–40 В) в течение ночи.
      2. После электрофореза выньте гель и сделайте снимок с помощью системы визуализации геля ДНК. Проверьте, отображается ли на расщепленных и отделенных гДНК изображение, похожее на мазок.
      3. Смочите гель в лотке с 0,2 Н раствором HCl и осторожно встряхивайте в течение 20 минут при комнатной температуре.
      4. Переведите гель в раствор ДНК-денатурирующего и осторожно встряхните его в течение 20 минут при комнатной температуре.
      5. Превратите гель в нейтрализующий ДНК раствор и осторожно встряхните его в течение 20 минут при комнатной температуре.
         заметка: Гель склонен к поломке после этого этапа, поэтому обращаться с ним нужно аккуратно.
      6. Используйте систему быстрого нисходящего переноса для переноса ДНК из геля на мембрану. Соберите TurboBlotter и промокательный стек в соответствии с инструкциями, предоставленными производителем.
         ПРИМЕЧАНИЕ: 10x или 20x раствор цитрата натрия (SSC) используется в качестве буфера для переноса. В целом, 3 ч переноса достаточно для переноса 95% гДНК от геля к мембране; Тем не менее, более длительное время переноса безвредно.
      7. Выньте мембрану и промойте ее 2x SSC в течение 1 минуты, впитайте жидкость с тканями, а затем сшите ДНК с мембраной с помощью УФ-сшивателя.
         заметка: Мембрану можно хранить при температуре 4 °C в течение одной недели.
2. Пометьте зонды ДНК радиоактивностью.
   1. Очистите зондовые плазмиды с помощью набора miniprep в соответствии с протоколом, предоставленным производителем.
   2. Высвобождают фрагменты ДНК зондов из плазмидного вектора путем расщепления EcoR I в реакционном растворе, включающем 5 мкл буфера для EcoR I, 2 мкл фермента EcoR I, 20 мкг плазмидной ДНК и H₂O до 50 мкл, в течение 2 ч.
   3. Запустите 1% ДНК-гель для отделения фрагментов ДНК зонда от вектора и очистите фрагменты ДНК зондов с помощью набора для экстракции ДНК-геля в соответствии с протоколом, предоставленным производителем.
   4. Используя 1 мкл раствора ДНК, измерить концентрацию ДНК фрагментов ДНК зонда с помощью спектрофотометра на длине волны 260/280 нм.
   5. Приготовьте 40 нг ДНК зонда в пробирке объемом 1,5 мл с 45 мкл TE-буфера, кипятите 3 минуты, коротко вращайте, а затем поместите пробирку (пробирки) на лед на 2 минуты.
   6. Добавьте термоденатурированные ДНК зонда в пробирку, содержащую готовые к использованию шарики для мечения ДНК (-dCTP), перемешайте пипеткой вверх и вниз, добавьте 5 μL [α³²P]dCTP, а затем инкубируйте при 37 °C в течение 15 минут.
   7. Очистите маркированные зонды с помощью микроколонок G-50 в соответствии с инструкциями, предоставленными производителем, а затем измерьте радиоактивность с помощью сцинтилляционного счетчика (опционально).
3. Гибридизуйте мембрану (мембраны) с мечеными зондами.
   1. Предварительно гибридизируйте мембрану.
      1. Подогрейте гибридизационный раствор при 42 °C в течение 30 мин. Смешайте 20 мл предварительно подогретого гибридизационного раствора с 200 мкг ДНК вареной спермы лосося в пробирке объемом 50 мл.
      2. Поместите мембрану в гибридизационную трубку. Добавьте смешанный раствор для предварительной гибридизации в пробирку для гибридизации. Поместите его в печь для гибридизации (установите раскатку и температуру 42 °C) и дайте предварительной гибридизации продолжаться в течение 30 минут.
   2. Гибридизуйте мембрану с меченым зондом (зондами).
      1. Выньте пробирку для гибридизации и налейте раствор для предварительной гибридизации в пробирку объемом 50 мл; добавьте в эту пробирку денатурированный зонд (нагретый до 100 °C в течение 3 минут) с шага 2.1.2.7 и аккуратно перемешайте.
         заметка: Уменьшите количество пузырьков.
      2. Верните смешанный раствор в пробирку для гибридизации и проведите гибридизацию при температуре 42 °C в течение ночи.
4. Промойте мембрану (мембраны) для удаления негибридизованных зондов.
   1. Поместите мембрану (мембраны) в лоток с 1x SSC + 0,1% SDS и осторожно встряхните при температуре 55–60 °C в течение 10 минут.
   2. Переложите мембрану (мембраны) в лоток с 0,5x SSC + 0,1% SDS и осторожно встряхните при температуре 55–60 °C в течение 10 минут.
   3. Проверьте радиоактивность мембраны (мембран) с помощью портативного счетчика Гейгера, чтобы решить, требуется ли третья промывка.
5. Подвергайте радиоактивность на мембране воздействию рентгеновских пленок.
   1. Удалите жидкость с промытой мембраны (мембран).
   2. Оберните мембрану (мембраны) полиэтиленовой пленкой и закрепите ее/их в кассете для экспонирования.
   3. Подвергните мембрану воздействию двух листов рентгеновской пленки в темном помещении.
   4. Поместите кассету с экспозицией при температуре -80 °C на ночь или дольше.
6. Проявляйте пленки для визуализации результатов. Оцените, является ли соответствующий клон ЭС желаемым с целевой рекомбинацией или нет, в соответствии с размерами полос ДНК, обнаруженных зондами.
7. Регибридизируйте ту же мембрану другим зондом после снятия использованного зонда в соответствии со следующей процедурой: извлеките использованную мембрану, промойте ее 1 раз чистым H₂O, а затем инкубируйте в растворе для стрипинга (55% формамид, 2% SSPE, 1% SDS, H₂O) при температуре 65 °C с легким встряхиванием в течение 1–2 часов.

Materials

QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28704
DNA Denaturing Solution	VWR	351-013-131
DNA Neutralizing Solution	VWR	351-014-131
EcoR I	Thermo Scientific	ER0271
Dra I	Thermo Scientific	ER0221
ProbeQuan G-50 Micro Columns	GE Healthcare	28-9034-08
Hybrisol I Hybridization Solution	Millipore	S4040
Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP)	VWR	27-9240-01
UltraPure SSC, 20x	Thermo Fisher	15557036
Salmon Sperm DNA Solution	Thermo Fisher	15632011
Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits	Fisher Scientific	09-301-188
[α32P] dCTP	PerkinElmer	NEG013H100UC
Kodak X-Ray Film	Z&Z Medical	844 5702
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27104
Nuclei Lysis Solution	Promega	A7941
Protein Precipitation Solution	Promega	A7951