Северный блот для обнаружения и количественного определения специфической микроРНК в экстракте общей РНК растительной ткани

Published: May 31, 2023
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Abstract

Источник: Tirumalai, V., et al. Анализ РНК-блотов для обнаружения и количественной оценки растительных микроРНК. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео мы демонстрируем северный блот, метод гибридизации для обнаружения и количественного определения микроРНК (микроРНК) из общего количества РНК, извлеченных из растительных тканей.

Protocol

1. Гель-электрофорез

  1. Остановите предварительный запуск и промойте лунки перед загрузкой проб.
  2. Нагрейте образцы при температуре 98 °C в течение 1 минуты и загрузите образцы горячими в лунку с помощью капиллярных наконечников. Вставьте наконечник на дно лунки так, чтобы проба занимала в лунке один тонкий слой.
  3. Полная загрузка всех образцов. Включите загрузку маркера десятилетия РНК.
  4. Запустите гель при напряжении 80 В до тех пор, пока бромофенольный синий краситель не закончится почти полностью. Бромфеноловый синий работает при 10.н. в 15% денатурирующем акриламидном геле.

2. Подготовка к электроблоттингу

  1. Разрежьте нейлоновую мембрану N+Nylon до размеров стеклянной пластины и пометьте мембрану в правом верхнем углу карандашом HB.
  2. Аккуратно поместите мембрану на поверхность стерильной воды лицевой стороной с маркировкой к поверхности воды. Предварительно замочите мембрану на 15 минут.
  3. Разрежьте 4 листа промокательной бумаги I по размерам волокнистой подушечки.
  4. Приготовьте гелевый бутерброд, поместив серой стороной кассеты вниз в чистый лоток.
  5. Предварительно намочите волокнистую прокладку и поместите ее над кассетой. Удалите пузырьки воздуха.
  6. Предварительно намочите один лист промокательной бумаги в 1x TBE и положите его на волокнистую подушечку. Удалите пузырьки воздуха, прокатав пластиковой пипеткой по бумаге. Постелите еще один кусок предварительно влажной промокательной бумаги и удалите пузырьки воздуха.
  7. Осторожно извлеките гель из рабочей кассеты и поместите его на сэндвич-установку таким образом, чтобы первый загруженный образец РНК находился справа.
  8. Аккуратно окуните предварительно смоченную мембрану в 1x TBE и поместите ее поверх геля меченой стороной вниз. Раскатайте, чтобы удалить пузырьки воздуха.
  9. Обмакните кусок промокательной бумаги, положите его на мембрану и удалите пузырьки воздуха. Окуните еще один лист промокательной бумаги, положите его на установку для бутербродов и удалите пузырьки воздуха.
  10. Завершите сэндвич, положив предварительно смоченную волоконную прокладку на установку и плотно закрыв кассету.
  11. Поместите кассету с трансблотом в модуль и заполните 1x TBE, pH 8,2, до марки блоттинга.
  12. Перенос при 10 В, ночь при 4 °C.
  13. После переноса поместите влажную мембрану на бумажный лист и немедленно свяжите РНК с мембраной путем облучения ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм (120 000 μджоулей/см²). Сшитый блот можно хранить при температуре 4 °C для дальнейшей гибридизации.

3. Подготовка радиоактивного зонда

  1. Спроектируйте зонд, который полностью комплементарен малой РНК, которую необходимо обнаружить.
  2. Пометьте зонд с помощью ƳP32ATP (полученного от BRIT) на его 5′-конце, объединив компоненты в соответствии с рецептом, приведенным в таблице 1.
  3. Инкубировать вышеуказанную реакционную смесь при 37 °C в течение 30 минут.
  4. Отделите немаркированный ƳP32ATP от зонда с помощью колонки Sephadex G-25 в соответствии с протоколом производителя.

4.Гибридизация блоттинга

  1. Поместите сшитый блоттинг стороной РНК вверх внутрь бутылки для гибридизации.
  2. Энергично перемешайте сверхчувствительный буфер для гибридизации, добавьте 10 мл и инкубируйте блот в гибридизационной печи, поддерживаемой при температуре 35 °C, с вращением.
  3. Проведите предварительную гибридизацию в течение 20 мин.
  4. Выньте бутылку из духовки и аккуратно добавьте промаркированный щуп в буфер для гибридизации.
  5. Гибридизируйте блоттинг при 35 °C, с вращением в течение 12 часов.
  6. После гибридизации осторожно переложите раствор для гибридизации в пробирку объемом 15 мл. Этот раствор можно хранить при температуре 4 °C до повторного использования.
  7. Проведите быструю промывку блоттинга в течение 2 минут, чтобы удалить излишки гибридизационного раствора, добавив 2x буфер SSC плюс 0,5% SDS. Выбросьте раствор.
  8. Инкубируйте блот с 2x буфером SSC плюс 0,5% SDS при 35 °C, вращая в течение 30 минут.
  9. Промойте промокашку еще раз с 0,5x SSC буфером плюс 0,5% SDS для 35°C, вращая в течение 30 минут.
  10. Поместите блоттинг внутрь крышки для гибридизации, удалите излишки буфера и закройте его.
  11. Подвергните его воздействию безрадиационно-люминофорного экрана тепловизора на ночь внутри кассеты.
  12. Определите сигнал гибридизации с помощью биомолекулярного имидж-сканера и проанализируйте результаты с помощью подходящего программного обеспечения.

Таблица 1: Таблица рецептов

Буфер и раствор рецепт Комментарии
10 X TBE 0,89 млн Трис буфер pH следует установить на 8,2 с использованием уксусной кислоты
0,89М борной кислоты
30 мМ ЭДТА
Гелевая смесь 15% акриламид-бисакриламид золь, 19:1 Гелевая смесь не должна содержать кристаллы мочевины
8М карбамида
1X TBE
Гель-загружающий краситель 0,05 %(w/v) бромфеноловый синий Следует соблюдать осторожность при работе с деионизированным формамидом
0,05 %(w/v) ксилолксианол
100 % деионизированный формамид
Маркировка пробника Буфер PNK (10X, 2 μL) Эта смесь содержит радиоактивные молекулы, этот этап должен быть выполнен обученным персоналом внутри радиоактивной лаборатории.
Фермент PNK (1 μл)
Олиго (100 мкМ, 0,1 мкл)
ƳP32 АТФ (4 μл)
Буфер промывки – I 2X SSC
0,5% (w/v) SDS
Буфер для промывки – II 0,5X SSC
0,5% (w/v) SDS
Буфер зачистки – I 0,5X SSC
0,1% (по сравнению с об.) паспорта безопасности
Буфер для снятия изоляции – II 0,1X SSC
0,1% (по сравнению с об.) паспорта безопасности

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

40% Acrylamide-bisacrylamide solution Sigma A9926Chemical
Ammonium persulphate (APS)BioRad1610700Chemical
Blotting paperWhatman blotting paper I1001-125Assay
Bromophenol blueSigmaB5525-5GChemical
Capillary loading tipsBioRad2239915Plastic ware
Deionized formamideAmbionAM9342Chemical
Heating block Eppendorf5350Device
Hybond N+nylon membraneGERPN203BAssay
Hybridization bottleSigmaZ374792-1EAPlastic ware
Hybridization OvenThermo Scientific1211V79Device
N,N,N',N'- Tetramethylethylenediamine (TEMED)SigmaT7024-25mlChemical
PhosphorImagerGE- Typhoon scanner29187194Device
PhosphorImager screen and cassetteGE healthcareGE28-9564-75Device
PipettesGilson, models: P20 and P10FA10002M, FA10003MPlastic ware
Plastic pipetteFalcon357550Plastic ware
Polyacrylamide gel apparatusBioRad1658003EDUDevice
Sephadex G-25 columnGE healthcare27532501Device
Speed Vac ConcentratorThermo Scientific20-548-130Device
SpinwinTarsons1010Device
T4 Polynucleotide Kinase (PNK)NEBM0201SAssay
Transblot apparatusBioRad1703946Device
ULTRAHyb hybridization bufferAmbionAM8670Assay
UreaFischer Scientific15985Chemical
UV-crosslinkerUVPCL-1000LDevice
VortexTarsons3020Device
Water bathNEOLABD-8810Device
Xylene cyanolSigmaX4126-10GAssay

Tags

Northern Blot to Detect and Quantify Specific MicroRNA in Total RNA Extract of Plant Tissue

Play Video

Cite This Article
Northern Blot to Detect and Quantify Specific MicroRNA in Total RNA Extract of Plant Tissue. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e21371, doi: (2025).

View Video