Источник: Tirumalai, V., et al. Анализ РНК-блотов для обнаружения и количественной оценки растительных микроРНК. J. Vis. Exp. (2020)
В этом видео мы демонстрируем северный блот, метод гибридизации для обнаружения и количественного определения микроРНК (микроРНК) из общего количества РНК, извлеченных из растительных тканей.
1. Гель-электрофорез
2. Подготовка к электроблоттингу
3. Подготовка радиоактивного зонда
4.Гибридизация блоттинга
Таблица 1: Таблица рецептов
Буфер и раствор | рецепт | Комментарии |
10 X TBE | 0,89 млн Трис буфер | pH следует установить на 8,2 с использованием уксусной кислоты |
0,89М борной кислоты | ||
30 мМ ЭДТА | ||
Гелевая смесь | 15% акриламид-бисакриламид золь, 19:1 | Гелевая смесь не должна содержать кристаллы мочевины |
8М карбамида | ||
1X TBE | ||
Гель-загружающий краситель | 0,05 %(w/v) бромфеноловый синий | Следует соблюдать осторожность при работе с деионизированным формамидом |
0,05 %(w/v) ксилолксианол | ||
100 % деионизированный формамид | ||
Маркировка пробника | Буфер PNK (10X, 2 μL) | Эта смесь содержит радиоактивные молекулы, этот этап должен быть выполнен обученным персоналом внутри радиоактивной лаборатории. |
Фермент PNK (1 μл) | ||
Олиго (100 мкМ, 0,1 мкл) | ||
ƳP32 АТФ (4 μл) | ||
Буфер промывки – I | 2X SSC | |
0,5% (w/v) SDS | ||
Буфер для промывки – II | 0,5X SSC | |
0,5% (w/v) SDS | ||
Буфер зачистки – I | 0,5X SSC | |
0,1% (по сравнению с об.) паспорта безопасности | ||
Буфер для снятия изоляции – II | 0,1X SSC | |
0,1% (по сравнению с об.) паспорта безопасности |
The authors have nothing to disclose.
40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | Chemical |
Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | Chemical |
Blotting paper | Whatman blotting paper I | 1001-125 | Assay |
Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | Chemical |
Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | Plastic ware |
Deionized formamide | Ambion | AM9342 | Chemical |
Heating block | Eppendorf | 5350 | Device |
Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | Assay |
Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | Plastic ware |
Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | Device |
N,N,N',N'- Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | Chemical |
PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | Device |
PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | Device |
Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | Plastic ware |
Plastic pipette | Falcon | 357550 | Plastic ware |
Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | Device |
Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | Device |
Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | Device |
Spinwin | Tarsons | 1010 | Device |
T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | Assay |
Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | Device |
ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | Assay |
Urea | Fischer Scientific | 15985 | Chemical |
UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | Device |
Vortex | Tarsons | 3020 | Device |
Water bath | NEOLAB | D-8810 | Device |
Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G | Assay |