Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Abstract

Источник: Tirumalai, V., et al. Анализ РНК-блотов для обнаружения и количественной оценки растительных микроРНК. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео мы демонстрируем северный блот, метод гибридизации для обнаружения и количественного определения микроРНК (микроРНК) из общего количества РНК, извлеченных из растительных тканей.

Protocol

1. Гель-электрофорез

1. Остановите предварительный запуск и промойте лунки перед загрузкой проб.
2. Нагрейте образцы при температуре 98 °C в течение 1 минуты и загрузите образцы горячими в лунку с помощью капиллярных наконечников. Вставьте наконечник на дно лунки так, чтобы проба занимала в лунке один тонкий слой.
3. Полная загрузка всех образцов. Включите загрузку маркера десятилетия РНК.
4. Запустите гель при напряжении 80 В до тех пор, пока бромофенольный синий краситель не закончится почти полностью. Бромфеноловый синий работает при 10.н. в 15% денатурирующем акриламидном геле.

2. Подготовка к электроблоттингу

1. Разрежьте нейлоновую мембрану N+Nylon до размеров стеклянной пластины и пометьте мембрану в правом верхнем углу карандашом HB.
2. Аккуратно поместите мембрану на поверхность стерильной воды лицевой стороной с маркировкой к поверхности воды. Предварительно замочите мембрану на 15 минут.
3. Разрежьте 4 листа промокательной бумаги I по размерам волокнистой подушечки.
4. Приготовьте гелевый бутерброд, поместив серой стороной кассеты вниз в чистый лоток.
5. Предварительно намочите волокнистую прокладку и поместите ее над кассетой. Удалите пузырьки воздуха.
6. Предварительно намочите один лист промокательной бумаги в 1x TBE и положите его на волокнистую подушечку. Удалите пузырьки воздуха, прокатав пластиковой пипеткой по бумаге. Постелите еще один кусок предварительно влажной промокательной бумаги и удалите пузырьки воздуха.
7. Осторожно извлеките гель из рабочей кассеты и поместите его на сэндвич-установку таким образом, чтобы первый загруженный образец РНК находился справа.
8. Аккуратно окуните предварительно смоченную мембрану в 1x TBE и поместите ее поверх геля меченой стороной вниз. Раскатайте, чтобы удалить пузырьки воздуха.
9. Обмакните кусок промокательной бумаги, положите его на мембрану и удалите пузырьки воздуха. Окуните еще один лист промокательной бумаги, положите его на установку для бутербродов и удалите пузырьки воздуха.
10. Завершите сэндвич, положив предварительно смоченную волоконную прокладку на установку и плотно закрыв кассету.
11. Поместите кассету с трансблотом в модуль и заполните 1x TBE, pH 8,2, до марки блоттинга.
12. Перенос при 10 В, ночь при 4 °C.
13. После переноса поместите влажную мембрану на бумажный лист и немедленно свяжите РНК с мембраной путем облучения ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм (120 000 μджоулей/см²). Сшитый блот можно хранить при температуре 4 °C для дальнейшей гибридизации.

3. Подготовка радиоактивного зонда

1. Спроектируйте зонд, который полностью комплементарен малой РНК, которую необходимо обнаружить.
2. Пометьте зонд с помощью ƳP32ATP (полученного от BRIT) на его 5′-конце, объединив компоненты в соответствии с рецептом, приведенным в таблице 1.
3. Инкубировать вышеуказанную реакционную смесь при 37 °C в течение 30 минут.
4. Отделите немаркированный ƳP32ATP от зонда с помощью колонки Sephadex G-25 в соответствии с протоколом производителя.

4.Гибридизация блоттинга

1. Поместите сшитый блоттинг стороной РНК вверх внутрь бутылки для гибридизации.
2. Энергично перемешайте сверхчувствительный буфер для гибридизации, добавьте 10 мл и инкубируйте блот в гибридизационной печи, поддерживаемой при температуре 35 °C, с вращением.
3. Проведите предварительную гибридизацию в течение 20 мин.
4. Выньте бутылку из духовки и аккуратно добавьте промаркированный щуп в буфер для гибридизации.
5. Гибридизируйте блоттинг при 35 °C, с вращением в течение 12 часов.
6. После гибридизации осторожно переложите раствор для гибридизации в пробирку объемом 15 мл. Этот раствор можно хранить при температуре 4 °C до повторного использования.
7. Проведите быструю промывку блоттинга в течение 2 минут, чтобы удалить излишки гибридизационного раствора, добавив 2x буфер SSC плюс 0,5% SDS. Выбросьте раствор.
8. Инкубируйте блот с 2x буфером SSC плюс 0,5% SDS при 35 °C, вращая в течение 30 минут.
9. Промойте промокашку еще раз с 0,5x SSC буфером плюс 0,5% SDS для 35°C, вращая в течение 30 минут.
10. Поместите блоттинг внутрь крышки для гибридизации, удалите излишки буфера и закройте его.
11. Подвергните его воздействию безрадиационно-люминофорного экрана тепловизора на ночь внутри кассеты.
12. Определите сигнал гибридизации с помощью биомолекулярного имидж-сканера и проанализируйте результаты с помощью подходящего программного обеспечения.

Таблица 1: Таблица рецептов

Буфер и раствор	рецепт	Комментарии
10 X TBE	0,89 млн Трис буфер	pH следует установить на 8,2 с использованием уксусной кислоты
	0,89М борной кислоты
	30 мМ ЭДТА
Гелевая смесь	15% акриламид-бисакриламид золь, 19:1	Гелевая смесь не должна содержать кристаллы мочевины
	8М карбамида
	1X TBE
Гель-загружающий краситель	0,05 %(w/v) бромфеноловый синий	Следует соблюдать осторожность при работе с деионизированным формамидом
	0,05 %(w/v) ксилолксианол
	100 % деионизированный формамид
Маркировка пробника	Буфер PNK (10X, 2 μL)	Эта смесь содержит радиоактивные молекулы, этот этап должен быть выполнен обученным персоналом внутри радиоактивной лаборатории.
	Фермент PNK (1 μл)
	Олиго (100 мкМ, 0,1 мкл)
	ƳP32 АТФ (4 μл)
Буфер промывки – I	2X SSC
	0,5% (w/v) SDS
Буфер для промывки – II	0,5X SSC
	0,5% (w/v) SDS
Буфер зачистки – I	0,5X SSC
	0,1% (по сравнению с об.) паспорта безопасности
Буфер для снятия изоляции – II	0,1X SSC
	0,1% (по сравнению с об.) паспорта безопасности

Materials

40% Acrylamide-bisacrylamide solution 	Sigma 	A9926	Chemical
Ammonium persulphate (APS)	BioRad	1610700	Chemical
Blotting paper	Whatman blotting paper I	1001-125	Assay
Bromophenol blue	Sigma	B5525-5G	Chemical
Capillary loading tips	BioRad	2239915	Plastic ware
Deionized formamide	Ambion	AM9342	Chemical
Heating block 	Eppendorf	5350	Device
Hybond N+nylon membrane	GE	RPN203B	Assay
Hybridization bottle	Sigma	Z374792-1EA	Plastic ware
Hybridization Oven	Thermo Scientific	1211V79	Device
N,N,N',N'- Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T7024-25ml	Chemical
PhosphorImager	GE- Typhoon scanner	29187194	Device
PhosphorImager screen and cassette	GE healthcare	GE28-9564-75	Device
Pipettes	Gilson, models: P20 and P10	FA10002M, FA10003M	Plastic ware
Plastic pipette	Falcon	357550	Plastic ware
Polyacrylamide gel apparatus	BioRad	1658003EDU	Device
Sephadex G-25 column	GE healthcare	27532501	Device
Speed Vac Concentrator	Thermo Scientific	20-548-130	Device
Spinwin	Tarsons	1010	Device
T4 Polynucleotide Kinase (PNK)	NEB	M0201S	Assay
Transblot apparatus	BioRad	1703946	Device
ULTRAHyb hybridization buffer	Ambion	AM8670	Assay
Urea	Fischer Scientific	15985	Chemical
UV-crosslinker	UVP	CL-1000L	Device
Vortex	Tarsons	3020	Device
Water bath	NEOLAB	D-8810	Device
Xylene cyanol	Sigma	X4126-10G	Assay