Генерация экспланта ганглия дорсального корешка и диссоциированной клеточной культуры

1. Эксплантация культуры DRG от взрослой мыши

1. Поместите собранный DRG в чашку Петри диаметром 35 мм, содержащую 3 мл ледяной среды без сыворотки (SFM).
2. Перенесите каждую отдельную DRG в сухую стеклянную чашку Петри и под хирургическим микроскопом очистите и обрежьте лишние волокна и соединительную ткань, все еще прикрепленные к DRG, с помощью лезвия. DRG легко идентифицируется как выпуклая прозрачная структура вдоль белого спинномозгового нерва/корня. Кровеносные сосуды часто обнаруживаются вокруг DRG.
3. Поместите очищенную DRG в новую чашку Петри, содержащую ледяную SFM-среду.
4. Разбавьте смесь желатинового белка (см. Таблицу материалов) в ледяном SFM (1:1).
5. Поместите DRG ex vivo в 12-луночные планшеты, предварительно покрытые 10/20 μл смеси желатинового белка, и установите их внутри инкубатора при температуре 37 °C и 5% CO2 на 30-60 минут.
6. Аккуратно добавьте 1,5-2 мл SFM в систему культивирования, чтобы покрыть весь эксплант и поддерживать экспланты в условиях культивирования (37 °C и 5% CO2).
   заметка: Это критически важный этап, потому что DRG крепится к стеклянной посуде только с помощью полимеризованной смеси желатиновых белков. Время полимеризации и навыки пипетирования имеют решающее значение для предотвращения всплытия.
7. Меняйте среду выращивания DRG каждые 72 часа и позволяйте DRG расти столько, сколько нужно.

2. Изоляция одноклеточных нейронов от DRG

1. Поместите весь собранный DRG в стерильную пробирку объемом 1,5 мл с 1,2 мл среды F12, содержащей 1,25 мг/мл коллагеназы внутривенно, и инкубируйте при 37 °C и 5% CO2 в течение 45 мин. Повторите этот шаг еще через 45 мин после первой инкубации.
2. Обработайте экспланты 2 мл среды F12, содержащей трипсин (0,025%) в течение 30 мин сразу после внутривенного введения коллагеназы при 37 °C и 5% CO2.
3. Инкубировать с 2 мл среды F12, содержащей фетальную бычью сыворотку (FBS; 33%), при 37 °C и 5% CO2 в течение 15 минут.
4. Промойте экспланты три раза 2 мл среды F12 и приступайте к их механической диссоциации стеклянной пипеткой, пока среда не помутнеет.
   заметка: Эта процедура включает в себя забор чистых/обрезанных DRG у животного, как описано в предыдущем разделе. При выполнении механической диссоциации эксплантов будьте аккуратны и не применяйте чрезмерной силы, так как это может привести к разливу и потере рабочего материала.
5. Отфильтруйте диссоциированную клеточную культуру через фильтр 0,22 мкм, чтобы удалить любые примеси и излишки соединительной ткани. Центрифугируйте отфильтрованный клеточный лизат при температуре (2 500 x g) в течение 2 минут.
6. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 500 мкл нейробазальной среды, содержащей добавку для культуры нейронов (1x), смесь антибиотиков (1x), L-глутамат (0,5 мМ) и фактор роста нервов (5 мкг/мл) (см. Таблицу материалов).
7. Поместите диссоциированные клетки на покровные стекла, покрытые ламинином (50 мкг/мл; см. Таблицу материалов) с желаемой плотностью клеток. Определите плотность ячеек с помощью счетчика ячеек.
   заметка: Мы поместили ячейки на 25 000 ячеек на предметное стекло. Этот метод позволяет диссоциировать как нейроны, так и глиальные сателлитные клетки. Глиальный компонент, совместно культивируемый с псевдоуниполярными нейронами, играет решающую роль в выживании нейронов.