Индуцирование проникающего черепно-мозгового повреждения у взрослых мух дрозофил

1. Проникающая черепно-мозговая травма (ПТБИ; Рисунок 1)

1. Сортируем только что закрытые F1 мухи. Отбирайте молодых самцов в течение 6 ч после эксклозии. Поместите этих самцов в чистые флаконы с кормом, по 40 или менее мух в одном флаконе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это проще всего сделать в середине утра, обезболив мух на CO₂ и определив взрослых самцов, у которых все еще есть меконий (виден как темное зеленоватое пятно через брюшную стенку) в кишечнике.
2. Продезинфицируйте мельчайшие штифты (см. Таблица материалов) в течение не менее 5 минут, поместив ~100 штифтов в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, заполненную 70% этанолом.
3. Продезинфицируйте подушечку CO₂ и кисть, распылив 70% этанол, и вытрите насухо чистой салфеткой без ворса. Когда инструменты станут чистыми и сухими, переложите 40 или менее отсортированных пап F1 обратно на чистую площадку.
4. Разделите самцов F1 на 2 группы на нахлыстовой площадке. Одна группа будет служить контрольной, невредимой мухой. Вторая экспериментальная группа будет подвергнута ПТБИ.
5. С помощью щипцов вытащите 4-5 новых штифтов Minutien из микроцентрифужной пробирки и поместите их рядом с краем прокладки CO₂. Под рассекающую область выберите прямой булавку Minutien с острым концом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование одной булавки Minutien для эксперимента уменьшит вариативность. Повторно используйте острые булавки. Поместите поврежденные или затупленные контакты в отдельную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 70% этанола, для безопасной утилизации.
6. При работе с мухами из стандартного креста включите стереомикроскоп с диодной (LED) лампой, оснащенной соответствующими фильтрами возбуждения и излучения зеленого флуоресцентного белка (GFP). Это позволяет возбуждать при длине волны 440-460 нМ и визуализировать 500-560 нМ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: С этой лампой и фильтром клеточные тела грибовидного тела будут флуоресцировать зеленым цветом через кутикулу головы (Рисунок 1C). Для мух-близнецов или мух других генотипов можно использовать стандартный осветитель белого света для стереомикроскопа для визуализации ориентиров на кутикуле головы для наведения на повреждение тела гриба (Рисунок 1C).
7. С помощью щипцов возьмите и держите выбранный булавку Minutien в одной руке (для правшей это обычно правая рука) и кисть в другой (обычно левой) руке. Выберите муху из экспериментальной группы и расположите муху так, чтобы у вас был дорсальный вид на капсулу головы с головой мухи вправо. Поместите щетку на переднюю часть тыльной поверхности грудной клетки и осторожно надавите вниз, чтобы стабилизировать муху.
8. Направьте кончик булавки Minutien на клеточные тела тела гриба с правой стороны головы и проникните в капсулу головки. Если вы используете ориентиры, нацельтесь на тыльную кутикулу головы между глазом и тыльным ободком глаза (Рисунок 1).
9. После завершения травмы с помощью кисти аккуратно оттолкните головку от булавки Minutien.
10. При использовании мозга для проведения РНК-секвенирования или количественной ОТ-ПЦР сделайте вторую травму на левой стороне головы.
11. Повторите шаги 2.8-2.10, чтобы поранить всех мух в экспериментальной группе.
12. После того, как все мухи будут ранены, поместите контрольных и раненых мух в промаркированные отдельные флаконы с пищей. Положите флаконы горизонтально (т.е. на бок), пока мухи восстанавливаются после анестезии, и во время последующего старения, чтобы предотвратить попадание мух в пищу.
13. Стандартные перекрестные мушки размещают при температуре 25 °C, а постоянные мухи-близнецы при температуре 30 °C до состарения.
14. Для мух в возрасте более 24 ч подкладывайте их на чистый корм каждые 1-2 дня.

Рисунок 1: Проникающая черепно-мозговая травма (ПТБ) в центральный мозг взрослой дрозофилы. (А) Схема внешнего вида головы взрослой мухи. Это вид спереди. Таким образом, правая сторона животного находится слева от зрителя. (B) Схема внутренней части головы взрослой дрозофилы с траекторией повреждения, обозначенной серым цветом. Это вид сзади. Таким образом, на этом изображении и последующих рисунках правое полушарие мозга находится справа. Центральный ПТБ мозга воздействует на несколько структур мозга, включая грибовидное тело (зеленый) и ткани за пределами мозга, включая жировое тело (синий) и гемоциты (красный). CB = центральная область мозга. OL = область оптической доли. (C) Дорсальный вид живой головы взрослой особи, на которой грибовидные тела (стреловидные наконечники) помечены зеленым флуоресцентным белком (GFP). Это «стандартный генотип» (подробнее см. текст). Протокол PTBI воспроизводимо приводит к травмированию тел грибов.