Исследованиях развития у мышей препятствует недоступность эмбриона во время беременности. Способствовать долгосрочных культуры эмбриональном сердце на поздних стадиях беременности, мы разработали протокол, в котором вырезали сердце культивируют в полутвердых, разбавленных Матригель.
Исследованиях развития у мышей препятствует недоступность эмбриона во время беременности. Таким образом, протоколы, чтобы изолировать и культуры отдельных органов интереса имеют важное значение в создании способа обоих визуализации изменений в развитии и позволяя стратегии нового лечения. Способствовать долгосрочных культуры эмбриональном сердце на поздних стадиях беременности, мы разработали протокол, в котором вырезали сердце культивируют в полутвердых, разбавленных Матригель. Эта подложка обеспечивает достаточную поддержку, чтобы поддерживать трехмерную структуру, но является достаточно гибкой, обеспечивая дальнейшее сокращение. Короче говоря, сердца вырезали из зародыша и помещают в смесь холодной Матригель разводили 1:1 ростовой среды. После разбавленной Матригель затвердевает, ростовой среде добавляют в чашку для культивирования. Сердца вырезали еще в эмбриональный день 16,5 были жизнеспособны в течение четырех дней после вскрытия. Анализ коронарных сплетения показывает, что этот метод ненарушить коронарных сосудов развития. Таким образом, мы представляем новый метод долгосрочного культуры эмбриональных сердцах.
За последние годы трансгенных мышей была преобладающей модельной системой для изучения пороки развития сердца. Тем не менее, другие организмы модели, такие как данио, оказались иметь значительные преимущества по сравнению мыши. Три основных преимущества данио являются внешними кладку яиц, для облегчения доступа к эмбрионов; оптической прозрачности эмбрионов, что позволяет легко визуализировать развития сердца и простота применения низкомолекулярных лечения, чтобы модулировать развитие эмбриона 1. Таким образом, развитие культуры метод, который позволил бывший внутриутробного роста эмбриональных орган в обход, по крайней мере частично, ограничения в настоящее время сталкиваются исследователи, изучающие процессы развития у трансгенных мышей.
Экс естественных сердечной системы культуры были разработаны как в куриных эмбрионов мыши и которые позволяют обработки с малыми молекулами и анализ того, как различferent области сердца связь 2-6. Для целой культуре сердце мыши, сердца, взятых из эмбрионов до эмбриональных (E) 12,5 возраста могут быть размещены в культуральной среде с или без раскачивания 2,3,5. При использовании этого метода, эмбриональные сердца были успешно инкубировали в эквивалентности E13.5, и сердца культивировали с качалки были сохранены в течение трех дней (начиная с Е10.5) 3. Тем не менее, никаких исследований не сообщили об успешном культуру сердца из старых эмбрионов. Кроме того, спасательные эксперименты были ограничены применением терапевтического агента глобально в культуральную среду 2.
Система срез культуры, в котором сердца вырезали, встроенные, и секционные использованием Vibratome, также была использована как для младших сердца, таких как мыши Е12.5 сердца и гамбургер-Гамильтона этап 36 (примерно E16 у мышей) куриного сердца 2,4,6, и старше сердца, таких как послеродовое и взрослой мыши чearts и сердца взрослого человека 7,8. В то время как эмбриональная анализы обычно используется 150-мкм срезы толщиной 2,4, толщина сечения может быть большим, чем 500 мкм без признаков кислородного голодания 8. Эти срез культуры были сохранены в течение двух месяцев в области культуры, с большинством ломтиками поддержание сократительной протяжении всего этого периода 9. По сравнению с исследований в отдельных кардиомиоцитов, эти срез культуры позволить совместного культивирования кардиомиоцитов с соседними типами клеток и обеспечивает полезный способ бывший анализ естественных условиях. Тем не менее, эти культуры требуют более сложные настройки, чем просто поместив сердце в культуральной среде (например, встраивание живого сердца для резки на Vibratome) и любой анализ, очевидно, ограничена часть сердца внутри раздела.
Учитывая описанные выше ограничения для культивирования эмбриональных сердцах мыши и богатство трансгенных мышей AVAтестированию нет доступа для исследования, мы разработали бывших естественных условиях сердце мышей культуры системы, подобной бывших естественных легких культуре система, разработанная Уивер, и др.. культуры 10 Наша система позволяет долгосрочное культуры и визуализации ремоделирования коронарного кровообращения в целом эмбрионального сердца мыши. Кроме того, использование Матригель позволяет бисера, который состоится в месте недалеко от центра, обеспечивая тем самым локализованные лечения терапевтических агентов. Эти эксперименты могут быть выполнены в различных временных точках развития сравнить эффект данного лечения на процесс, такой как коронарные артерии образование. Поскольку малые молекулы могут диффундировать через Матригель, эта культура система может быть также использована для культуры расчлененный области сердца рядом друг с другом, чтобы определить, является ли конкретный межклеточных контактов необходимы для определенных процессах развития или же паракринных сигналов от одной области к другой необходимо.
Эта культура системыотносительно проста и, в отличие от системы культуры ломтик, использует основные реагенты культуры и установок, которые легко доступны в большинстве лабораторий. Короче говоря, вырезали эмбрионального сердца культивируют в разбавленной Матригель, что обеспечивает полу-твердом носителе. Эта поддержка является достаточным для поддержания трехмерной морфологии сердца, а также позволяет сжатие сердца. Используя эту систему, всем сердцем из старых мышиных эмбрионов (E14.5-E16.5), может поддерживаться в культуре на срок до четырех дней. Все коронарное сплетения поддерживается, в отличие от срез культуры, поэтому любые сигналы сигнализации, которые происходят из разных регионов сердце сохранит свое присутствие. Кроме того, живых клеток флуоресцентные красители могут проникать Матригель, чтобы позволить визуализации живого сердца, и белок конъюгированные гранулы могут быть размещены вблизи сердца, чтобы обеспечить локализованный источник сигнализации. Вместе эти преимущества делают этот метод идеальным методом для изучения процессов развития эмбрионаIC сердце мыши.
1. Вырезанием Эмбриональные сердца
2. Культура настройка
3. Фиксация и визуализация
При использовании этого метода, сердце сохраняет свою трехмерную морфологии и остаются жизнеспособными, как показано продолжение сокращений (фильм 1). Эти сокращения являются последовательно более заметным в предсердиях, чем в желудочках. После культуры, сердца может быть за?…
Нынешняя система культуры создает значительные преимущества для эмбриональных исследованиях сердца мыши. Эта культура система сохраняет способность миокарда и коронарный сплетение, с ограниченным признаки некроза, даже после четырех дней в культуре. Кроме того, полутвердую матрицу …
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Андреа Портбери за критическое прочтение рукописи и NIH (грант № R01HL061656) для финансовой поддержки.
REAGENTS | |||
Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
PBS (1x) | |||
DMEM | Cellgro | ||
FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
Growth factor-reduced Matrigel | BD Bioscience | 356231 | |
Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
24-well culture plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
EQUIPMENT | |||
Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
Cell culture incubator | Thermo | 3110 |