Магнитные Пинцет для измерения Twist и крутящий момент

В последние годы методы одиночных молекул доказали свою широкое применение при изучении белков поступательного двигателя и других ферментов, получая представление их кинетики и подстилающей механохимия. В контексте силовой спектроскопии, важный вклад сделана атомно-силовой микроскопии потока растяжения и оптических и магнитных пинцетом. Оптические и магнитные пинцет (MT) были особенно удалось объединить большую гибкость с точки зрения молекулярной манипуляции с высоким пространственным и временным разрешением. Здесь, мы ориентируемся на МТ, которые можно применить как растяжку усилия и моменты, чтобы биологических молекул привязаны между поверхностью и суперпарамагнитных бисером ^1-3.

Магнитные пинцет (MT, Рисунок 1а) являются метод одной молекулы очень универсальный, который был использован для мониторинга как механические свойства нуклеиновых кислот, а также их взаимодействие с белками. МТ есть много силс, в том числе общего простоты и надежности экспериментальной реализации, легкому применения крутящего момента, природного эксплуатации и простой калибровки в режиме постоянного ^форс-4, расширение до параллельных измерений ^{5, 6,} и отсутствие нагрева образца и фотостарения. По сравнению с другими одиночных молекул приближается, МТ предоставляют возможность проводить измерения силы-зависимость в силах, как низко как ≈ 10 дг и иметь возможность прямо контролировать степень сверхспирализации. В то время как МТС имеют преимущественно использовались в качестве экспериментального инструмента для исследования биологических процессов с участием нуклеиновых кислот ^{7, 8,} они также нашли применение в исследованиях механических свойств белков ^9-13 или клеток ^{10, 14-17.} Многочисленные полезные ссылки доступны, которые описывают, как построить и запустить MT ^{4, 18-20.}

Howevэ-э, обычные МТ не отслеживают вращательное движение непосредственно, и, в то время как они применяются крутящий момент, они не измеряют крутящий момент непосредственно. Кроме того, они ограничивают свободное вращение троса нуклеиновой кислоты. Здесь мы представляем два расширения магнита пинцетом. Первые, называемые свободно вращающиеся вокруг магнитных пинцет (FOMT, 1б) ^21, позволяет измерения колебаний угловых равновесия и изменений в иронии привязных молекул нуклеиновых кислот, без ограничения вращательное движение вокруг оси троса. Второй, названный магнитные пинцет крутящего момента (МТТ, Рисунок 1в), который имеет возможность применять и непосредственно измерить как усилия и моменты одиноким биомолекул ^22-27.

В следующем протоколе, мы предполагаем, что читатель имеет на его / ее распоряжении "обычных" МТ приборов. Мы отсылаем читателя к дискуссии для справок о том, как построить и запустить MT настроить, а также Рассмотритерационы, которые должны быть приняты во внимание при выборе магнитных шариков, магниты, и процедур отслеживания. Кроме того, разделы 1 и 2 Протокола Текст описать, как мы обычно подготовить и инкубировать образец ДНК для использования в МТ, а также предварительные измерения, которые могут выполняться на одном ДНК в обычном MT. Разделы 3 и 4 Протокола Текст иллюстрируют, как инструмент МТ могут быть легко адаптированы и использованы для FOMT и МТТ измерений.

1. Подготовка и инкубация образец ДНК

1. Подготовка конструкции ДНК, которые сшивали с дуплекс концы (обычно используют ≈ 600 б.п. ПЦР ДНК фрагменты), которые функционализованных с несколькими биотина и дигоксигенин группах соответственно ^18. Для начала, длина троса ДНК> 1 мкм, например, 7,9 кб, соответствующий растянутой длиной ~ 2,7 мкм в качестве занятых здесь, рекомендуется для простоты использования; в частности, с использованием длины ДНК, который похож на или меньше радиуса шарика проблематично из-за геометрии крепления в МТТ и FOMT. См. обсуждение для описания того, как длина ДНК влияет временного отклика в угловой области.
2. Соберите клетки потока для одиночных молекул экспериментов. Для проточных, использовать два стекла микроскопа покровных разделенные двухслойной Parafilm прокладки. Верхняя микроскоп покровное должны иметь два отверстия для жидкости в-и выходами на клетки. Это удобноиспользовать джет пробурить отверстия. В нижней покровное покрыта нитроцеллюлозы (0,1% вес / объем в амилацетат). Поместите прокладки парафильмом на нитроцеллюлозы покрытием стороне нижних горками и закрыть сверху с чистыми лучших слайдов.
3. Уплотнение клетки потока. Использование физических пинцет, поместите собранный проточную ячейку на нагревательной пластины, установленной до 80-100 ° С в течение ~ 1 мин. Обратите внимание, что ячейка потока хорошо запечатанный, что Парафильмом не закрыть отверстия, которые подключаются к входом и выходом, и что стеклянные слайды четко привязаны.
   Примечание: Для обеспечения хорошего уплотнения, рекомендуется вычеркнувшая пузырьков в парафильмом использованием большого ватный тампон. Ячейка потока может затем быть установлен на приборе магнитные пинцетом.
4. Подготовка буферов. Подготовка TE модема буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA) и 200 мМ NaCl). Альтернативно, можно использовать PBS буфера (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ фосфатный буфер, рН 7,4) с добавлением WIth 100 мкг / мл BSA, 0,1% Твин и 5 мМ натрий-азид (PBS +), как привязывать буфера. Флеш объемы 2-3 клеток TE-модем буфера в ячейку.
5. Выдержите 0,5 или 1,5 радиуса мкм немагнитных латексные шарики в проточную ячейку для ~ 30 мин. Эти шарики будут действовать в качестве опорных шариков во время магнитных пинцет измерений, которые позволяют свести к минимуму влияние дрейфа между целью и держателем образца (то есть проточную ячейку). Промойте одиноких без магнитных шариков промывкой 2-3 объемов клеток ТЕ привязывать буфера.
6. Функционализации нижнюю поверхность проточной ячейки путем инкубации с 100 мкг / мл анти-дигоксигенином в PBS в течение не менее 1 часа (предпочтительно более длительный; инкубации может быть осуществлена ​​в течение ночи), для обеспечения присоединения ДНК. Промыть 2-3 объемов клеток ТЕ привязывать буфера. Наконец инкубировать проточную ячейку с 2 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) в ТЕ буфере привязывать в течение 30 мин для пассивации поверхности.
7. Возьмем аликвоту2 мл покрытых стрептавидином суперпарамагнитные MyOne бисером (см. Обсуждение и таблицу материалов) и разбавляют 10 мл ТЕ привязывать буфера. Промыть дважды 10 мл ТЕ буфера привязывать помощью магнитного концентратора частиц, и ресуспендируют в 10 мл ТЕ буфера привязывать. Присоединить ~ 1 мл молекул ДНК (приблизительно 1 нг) в этих гранул путем инкубации в буфере ТЕ привязывать течение 30 мин.
8. Развести решение ДНК-привязи суперпарамагнитные бисером в десять раз, добавив 90 мл ТЕ-модем буфера. Наконец, вводят раствор в проточную кювету и инкубировать в течение ~ 1 часа, чтобы позволить для прикрепления ДНК к анти-дигоксигенин покрытием поверхности. Промойте проточной ячейки тщательно TE привязывать буфера. После инкубации конструкций ДНК-трос, промыть широко с экспериментальной буфера (это может быть TE буфера модема), чтобы удалить все непривязанными шариков.
9. Для измерений, которые используют угловую протокол отслеживания, которая требует фидуциальных бусы маркеров, прикрепленные к магнитных шариков

2. Измерения на одном ДНК молекулы в обычных магнитных пинцет

1. При использовании обычного MT (см. Обсуждение) с соответствующей конфигурации поля (рис. 1а) и поступательных и вращательных контроль над положением магнита, искать вращения ограниченными молекул ДНК в клетке потока. При прокладке силы ≥ 1 PN (обратитесь ссылки ^{4, 19, 20, 28, 29} относительно калибровки силы в магнитных пинцетов), привязанные шарики легко можно отличить от бусин прикрепленных к поверхности нижней слайда их различных высотах в фокусе . Если молекула ДНК с возможностью вращения ограничен может быть оценена путем введения 20-30 поворотс магнитов на усилием ≈ 0,25 PN: здесь, длина троса должно уменьшиться на 0,4-0,5 мкм.
   Примечание: Для запуска магнитные пинцеты эксперименты, обработка изображений используется для определения х, у, г положение ДНК-привязи бисером. Пользовательские Labview программного обеспечения для этой цели имеется у авторов по запросу.
   1. Убедитесь, что шарик крепится одной привязи ДНК. Это может быть сделано путем сравнения поведение при положительных и отрицательных оборотов в сил> 1 PN (рис. 2а). В этом сила режима, наличие нескольких тросов ДНК приведет к примерно симметричной уменьшением расширения при введении положительные и отрицательные очереди, в то время как одиночные привязи ДНК приведет к асимметричного ответа.
2. Поиск соответствующих неподвижных шариков прилипла к нижней поверхности в непосредственной близости от троса интереса, который может служить в качестве опорных шариков.
3. Калибровка длину тон ДНК, л. Положение поверхности проточной ячейке может быть определена путем приведения привязанный шарик в контакте с поверхностью (например, поворотом магнита на ~ 60 оборотов в силу ниже 0,2 PN). Измерения вертикальном положении привязной шарик по отношению к этой поверхности, то сообщить о абсолютному значению л.
   Примечание: Чтобы свести к минимуму последующие эффекты дрейфа, рекомендуется для выполнения измерений л по отношению к позиции опорного валика, прикрепленного к поверхности.
4. Запись кривую вращения (т.е. измерение расширением ДНК в зависимости от количества витков) при растяжении силу ≈ 0,25 PN (рис. 2а).
   1. Определить число оборотов, при котором расширение максимальна, так как это соответствует состоянию, при котором молекула ДНК является кручение расслабленным. Для этого, полезно, чтобы соответствовать кривой вращения локально с параболической или функцией Гаусса для определения центра Positiна. Определить эту точку как "нулевых оборотов".
      Примечание: заказ написано обычным для этой цели можно получить у авторов по запросу.
5. Для серии ~ 20 магнитов позиций, определить среднюю расширение кручение-непринужденной молекулы (т.е. на "нулевых оборотов", см. шаг 2.4.1) с г-следа.
6. Для каждой точки измерения на шаге 2.5, точно определить растягивающее усилие от колебаний в х или у позиции ^{20, 28, 29,} или, если намагниченность борта хорошо известно, используя знание местного градиента поля ^4. Построение растягивающего усилия против средних результатов расширения в форс-расширения кривой (рис. 2б).
   1. Установите полученные данные форс-расширения к червеобразного уравнения цепи с помощью полиномиальное приближение Бушиа др. ^30.
   Если готовится к последующих измерений FOMT, медленно вращайте магниты время записи экскурсии магнитного бисера в в (х, у).
   Примечание: Чем меньше радиус полученного кольца в обычной конфигурации MT, более тесно молекула ДНК привязал ближе к «южного полюса» магнитного валика. Когда один переключается на конфигурации FOMT, такая молекула ДНК будет привязан близко к "экватору" магнитного шарика, что позволяет надежную отслеживание угла поворота от (х, у)-положения (см. Обсуждение).

3. Измерения Twist ДНК с использованием свободно-орбитальных магнитных Пинцет

1. Вручную заменить квадратные магниты обычных магнитных пинцетов цилиндрической магнита, который используется для FOMT (рис. 1b). Эта операция должна быть выполнена таким образом, что выбранный троса ДНК остается в пределах поля зрения. Это может быть достигнуто менее чем за 1 мин, просто открутив полный магнитный голову, которая держит магниты для конфигурации обычные пинцеты и поставив на ее место магнита голове, который содержит цилиндрический магнит для FOMT.

4. Измерения ДНК Крутящий момент с помощью магнитного Пинцет крутящего момента

1. Вручную заменить цилиндрический магнит, который используется для FOMT с помощью цилиндрического магнита плюс боковой (постоянное) магнит для МТТ (фиг. 1в). Эта операция должна быть выполнена таким образом, что выбранный троса ДНК остается в пределах поля зрения.
   1. Наиболее простым способом достижения этого является, чтобы вручную добавить боковую магнит в надлежащем месте, которое может быть достигнуто в течение 1 мин. Никаких дополнительных перестройка не требуется.
      Примечание: альтернатива боковой магнита является использованиеэлектромагнитов ^32.
2. При необходимости для анализа, калибровки силы в аналогично тому, MT, с использованием либо х шарик или Y колебания или при условии, что намагниченность борта хорошо известно, используя знание местного градиента поля ^21.
3. Ниже в хронологическом порядке угловые колебания как функцию времени θ (т), используя либо исходных точек на основе отслеживания протокола ²³ или, как показано на сопроводительной видео, угловое протокол отслеживания на основе мониторинга (х, у)-положения (см. Обсуждение). В первом случае, записывать полноценные изображения борта как функцию времени для последующей обработки изображений. В последнем случае, достаточно для записи (X, Y) колебаний борта на данном этапе.
   Примечание: сценарий MATLAB для определения θ (T) от полных изображений борта, как функции времени в протоколе отслеживания нормирующего основе являетсяИмеющаяся в наличии у авторов по запросу.
   1. Как описано в обсуждении, для углового протокола слежения на основе мониторинга (х, у)-положение Кроме того, целесообразно, чтобы записать время след где магниты медленно (как правило, на 0,1 Гц) поворачивается на несколько оборотов. Это позволит один для точного преобразования прямоугольных координат (X, Y) в полярных координатах (г, θ) с использованием уравнений 3-5 обсуждения.
      Примечание: скрипт MATLAB для углового слежения сценария, основанного на мониторинге (х, у)-позиция можно получить у авторов по запросу.
      Примечание: Время измерения зависит в основном от требуемого разрешения крутящего момента. Подробный аргумент приводится в Lipfert др. ^24. Для шарики MyOne и 8 KBP привязи ДНК, измерительные для 30-100 сек должно быть достаточно, чтобы дать разрешение крутящего момента в диапазоне от ~ 1 пН · нм.
4. Определите жесткость на кручение ловушку из йэ дисперсия угловых флуктуаций _(σ θ ^2, в радианах) с помощью:
   к _θ = к _Б Т / σ _θ ² (1)
   Примечание: Типичные жесткости вращения ловушки, достигнутые в МТТ в диапазоне 10-1000 пН · Нм / рад, ниже, чем для обычных магнитных пинцетом.
5. Кроме того, записи Z-положение валика и использовать его для определения длины троса л (см. также шаги 2,4-2,7).
6. Поворот N поворачивается и снова записывать θ (т) и L (T).
   Примечание: уменьшено вращения ловушка жесткость МТТ по сравнению с МТ делает ее пригодной для измерения крутящего момента одной молекулы, но следует, что максимальный крутящий момент, который может быть оказано снижается. Это означает, что МТТ не может быть в состоянии уравновесить высокий крутящий момент перетаскивания, вызванные быстрым вращением. Поэтому следует соблюдать осторожность, чтобы не превысить максимальную скорость; тypically вращаться со скоростями, близкими к 0,1 Гц.
7. Определить момент накопленный в привязи нуклеиновых кислот после N получается с помощью:
   Γ = - к _θ <θ _N - θ _0> (2)
   Где <...> обозначает средний и θ ₀ и θ _N являются угол при нулевых оборотов (что соответствует кручение расслабленном троса, ср. Шаг 2,3 и N получается, соответственно.
8. Повторите шаги 4.5 и 4.6, при необходимости, с тем чтобы полностью определить реакцию молекулы в крутящий момент за один проход измерения (репрезентативные результаты, рисунок 6).

Представитель результаты от MT (рис. 1а) показаны на рисунке 2. 2а показаны кривые вращения-расширения для 7.9 кб ДНК, принятым на F = 0,25, 0,5 и 2,0 PN. Отклик одной ДНК к вращению должна быть симметричной при самых низких сил (0,25 Pn), с расширением ДНК уменьшается в результате формирования положительных или отрицательных plectonemic супервитков. Качественный знание этого ответа полезно при первоначальном поиске вращения ограниченного троса ДНК (шаг 2.1). Обратите внимание, что дополнительная проверка троса требуется проверить, что оно состоит из одной молекулы ДНК: здесь, асимметричным ответом из одного ДНК вращения в силах более 0,5 PN помогает отличить его от нескольких ДНК (шаг 2.1.1). Как только это было проверено, один возвращается к вращательной ответ на 0,25 пН для того, чтобы определить точное количество магнита поворачивает, при котором один ДНК яы на кручение расслабленным, где взять кривую силы-расширение, которое должно напоминать на рисунке 2 б. Для этого конкретного измерения, фит данных в модели цепи червеобразного (сплошная линия) дали оборудованная контур длины L C = 2,71 мкм и длина изгиба настойчивость L P = 45 нм. Для двухцепочечной ДНК, то встроенные значения длины настойчивость должна лежать в диапазоне 40-55 нм, в зависимости от буферных условиях 33, а оборудованная контурная длина должна быть близка (как правило, в пределах 10%) до значения ожидаемой за ДНК конструктом, используется в измерениях, используя отношения L ДНК = 0,34 нм / BP · число пар оснований.

На рисунке 3 показаны процедуры и результаты выравнивания в FOMT (рис. 1b). Начальные (х, у) экскурсии, записанные в шаге 3.2 можно сравнить с общего вида колебаний как функции ое поперечная позиция магнит показано на рисунке 3а, которая показывает «вихрь» модель, которая может быть использована для руководства последующее относительное смещение между магнитом и ДНК-привязанный шарик, состоявшейся в FOMT. При последующей грубой выравнивание будет завершено, шарик в (х, у)-колебания проследить круговую траекторию, как показано также черной следа в рисунке 3b. В этот момент, вращающий момент от магнитов около оси уменьшается до такой степени, что тепловые флуктуации достаточно, чтобы вращаться вокруг борта точке крепления. Радиус R круг в результате кругового кольца (установлены круг отображается красным цветом) представляет собой радиальное расстояние между точкой крепления ДНК и центра борта (рисунок 1b). Как показано на фиг.3С, однако, гистограмма данных на фиг.3В показывает, что грубый выравнивание не гарантирует равномерное покрытиеиз всех возможных положениях вдоль кругового кольца. Даже при том, тепловые флуктуации являются достаточными, чтобы изучить все вращения угол на окружности, остается небольшой энергетический барьер (порядка тепловой энергии К В T) в свободном вращении.

Когда выравнивание тоньше осуществляется в FOMT (шаг 3.4), прибор может быть использован для определения крутильных модуль ДНК (рис. 4). Во-первых, точное выравнивание образца используется для получения круговое движение (рис. 4а), чей двумерный гистограмма должен теперь показать равномерное покрытие (рис. 4б). Соответствующее время след д (т) угловых колебаний (полученных из преобразования (х, у)-позиций, см. ниже) показывает не периодичность не соответствующая 360 ˚ (рис. 4в) и показывает большие экскурсии, соответствующие нескольких полных оборота (рис. 4г). Подразумевается энергетический ландшафтгармоническая в диапазоне от> 1000 ˚ (фиг. 4E). Стандартное отклонение флуктуаций является σ θ = 223 °, что соответствует угловой ловушки жесткости к θ = к Б Т / σ θ 2 = 0,27 пН · Нм / рад, что в свою очередь дает оценку эффективной торсионной длины настойчивость ДНК, равной С = L С / σ θ 2 ~ 76 нм (L C = 1150 нм для 3,4 кб ДНК, используемой в этом измерении) в измеренной силы.

Пример того, как FOMT могут быть использованы для измерения изменения поворот индуцированного в привязанной молекулы ДНК через связывание белков 31, 34 показана на рисунке 5. Здесь мы контролировать связывание белка RAD51, чтобы удвоить-Мель ДНК; RAD51, как известно, как удлинить и расслабиться ДНК, как это образует нуклеопротеидную нить 31. По промывки RAD51 в проточной ячейке, мы видим, что шарик подвергается спирали траекторию в FOMT (рис. 5а). Путем преобразования следов (х, у) движения в зависимости от времени к д (т), как описано выше, мы можем сотрудничать участки эффект, что RAD51 имеет от длины троса ДНК и степени ее разматывать (рис. 5б, в) .

Альтернативный подход к измерению крутильных свойства ДНК являются МТТ (рис. 1в, рисунок 6). Схема на рисунке 6а иллюстрирует принцип измерения: после перекручивания (или подмотки) троса ДНК с помощью N оказывается, ДНК оказывает восстанавливающий момент на шарик, который ведет к смещению равновесия углового положения от θ 0 до θ N. В МТТ поперечная составляющая магнитного поля уменьшается по сравнению с МТ, что облегчает измерение таких угловых перемещений в то же время позволяя вращение шарика (рис. 1). Величина углового сдвига, измеренной после применения N = 45 превращается в 7,9 т.п.н. ДНК показано на фиг.6b. Полная последовательность протокола измерения МТТ и полученный исход крутящего момента по сравнению с кривой вращения для ДНК показаны на рисунке 6c-F. Здесь, измерение стандартного отклонения (рис. 6c) и среднее (фигуре 6d) от угловой координаты показаны в зависимости от чрезмерной и подмотки, с стандартное отклонение обратно пропорциональна угловой жесткости ловушки (уравнение 1). Взятые вместе, эти величины позволяют построить крутящий момент по сравнению с кривой вращения для ДНК (рис. 6f), который должен показать линейную область реагирования по центру около 0 получаетсяй два плато при которой насыщение крутящего момента, при положительных и отрицательных оборотов, соответственно. Такой момент по сравнению с кривой вращения дополняет информацию в расширении по сравнению с кривой вращения (рис. 6, д), тем самым количественного переходы, сопровождающие потери устойчивости и денатурации ДНК.

Рисунок 1. Схемы обычных магнитных пинцетов (MT), свободно-орбитальных магнитных пинцет (FOMT), пинцет магнитного крутящего момента (MTT), и две стратегии для отслеживания угла поворота. (А) во всех трех реализаций магнитных пинцетов, магнитные шарики привязаны к поверхности проточной ячейки на функционализированных макромолекул, например, молекулы двунитевой ДНК схематически. Ориентир шарики крепятся к поверхности клетки потока и отслеживаются для drifт коррекция. Все три MT установка окон используют магниты, чтобы применить к росту растягивающее усилие от магнитного валика и, следовательно, трос ДНК. В обычных MT, пара магнитов оказывает магнитное поле, ориентированное в поперечном направлении по отношению к оси троса, Сильно ограничивая вращение вокруг борта ДНК-троса оси. В FOMT, цилиндрической формы магнит обеспечивает магнитное поле, которое ориентированной вдоль направления троса. Когда трос выравнивается по центру цилиндрической формы магнита, все оставшиеся поперечных полей сведены к минимуму, что позволяет свободное вращение вокруг оси троса МТТ, сторона магнита добавляется к цилиндрической формы магнита, используемого в FOMT, чтобы обеспечить небольшой поперечное поле (снижение по величине по сравнению с МТ). Этот небольшой поперечное поле позволяет приложению крутящего момента, а также его измерение. (Б) две стратегии для измерения угла поворота магнитного шарика вокруг оси ДНК-троса показаны. 1): маркер шарик (Greeп) прикреплены к магнитной бусины (коричневый) дает асимметричный изображение, которое позволяет угол отслеживания по себе представить анализ. Два CCD образы 1.4 мкм радиуса магнитного шарика с 0,5-мкм радиуса фидуциального маркера показаны, в центре внимания и вне фокуса. 2): когда ДНК привязан к магнитному шарик в положении, удаленном от южного полюса шарик, центр борта колеблется по дуге, центр которого определяет угловое положение. Либо стратегия может быть использована для отслеживания угла поворота и контролировать изменения в положении угла, как трос является кручение напряженными (следы справа), что позволяет измерения крутящего момента одной молекулы.

Поверочные Рисунок 2. ДНК в обычном MT. (А) кривые вращения-расширения для 7.9 кб ДНК, принятым на F = 00,25, 0,5 и 2,0 PN. Асимметричный ответ при вращении на положительные и отрицательные оборотов отдельных двухцепочечными тросов ДНК можно использовать в качестве удобного испытания крепления троса. (Б) кривая силы-расширение для 7,9 кб ДНК вместе с приступе к червя- как цепная модели (сплошная линия), уступая оборудованная контур длины L C = 2,71 мкм и длина гибки настойчивость L P = 45 нм. Все измерения проводились в PBS буфера.

Рисунок 3. Выравнивание в FOMT. (А) (х, у) колебания ДНК-привязанный шарик, занимаемые в FOMT в зависимости от положения магнита. Положение цилиндрического магнита сканировали при постоянной высоте 3 мм по всей поверхности проточной ячейки с шагом 250 мкм х и (х, у)-колебания картины с позиции магнит напоминающее циклон или вихрь очевидны. Это «вихрь» рисунок может быть использован для руководства смещение магнита (или, наоборот троса, сохраняя при этом магнит фиксированный) по х и у (указано крупных стрелками) для достижения выравнивания. При грубой выравнивание будет завершено, шарик в (х, у)-колебания проследить круговую траекторию (синий след в центре сюжета). Этот след был записан в отдельном эксперименте после выравнивания магниты в более мелкие шаги о центре и показана для примера в этом участке. (Б) (х, у)-колебания ДНК-привязанный шарик, состоявшейся в тон FOMT после успешного грубой-выравнивания магнита (черный след). Колебания лежат на круговом кольце и тепловые флуктуации достаточно изучить все повороты углов на окружности. Приспособленный круг показаны красным цветом. (С) гистограмма, соответствующая данным в (б), показывая, что грубый выравнивание не гарантирует равномерное покрытие всех возможных положениях вдоль кругового кольца. Даже при том, тепловые флуктуации являются достаточными, чтобы изучить все вращения угол на окружности, остается энергетический барьер (на величину порядка тепловой энергии К В T) в свободном вращении.

Рисунок 4. Измерение ДНК жесткости на кручение, используя FOMT. (Х, у)-траектория (а) и гистограмма (б) ДНК-ТетERed колебания шарик после тонкой выравнивания относительной магнита-троса позиции в FOMT. В этих условиях, гистограмма показывает существенно равномерное покрытие позиций по кругу. (С) вращательные колебания шарика определяется из (х, у)-позиции. (Г) Гистограмма вращательных колебаний. Красная линия является гауссовским подходит с σ θ = 223 °. (Е) Энергетический ландшафт подразумевается вращения плотности флуктуации от (с) и (г). Разница между энергетического ландшафта, подразумеваемой флуктуаций вращения и гармоническом приближении (с к θ = к Б Т / σ θ 2 = 0,27 pN-nm/rad) гораздо меньше тепловой энергии К В T в течение нескольких поворотов. Данные смещение для ясности такой, что θ 0 = 0. Ширинафлуктуации могут быть использованы для определения жесткости при кручении ДНК, см. основной текст. Измерение проводили в PBS буфере при растягивающей силы ~ 1 PN. Данные взяты из Lipfert др. 21.

Рисунок 5. Связывание RAD51 белка с ДНК измеряли с помощью FOMT. (А) Ассамблея RAD51 белка на привязной 7,9 кб двухцепочечной ДНК контролируется на уровне 3,5 PN. (Х, у, г)-траектория выполняется с помощью магнитного шарика (диаметр 1,0 мм) в течение первого 200 сек сборки показан, со временем цветом от синего до красного. (Б) расширение двухцепочечной ДНК выводится с Z-составляющей траектории шарика в (с) угол поворота вокруг оси троса дцДНК выведенных (а) в виде функции времени.от X, Y компоненты борта траектории в (а) как функции времени.

Измерения Рисунок 6. Крутящий момент на одном тросе ДНК в МТТ. (А) Схема, показывающая принцип измерения крутящего момента. После более-(или под-) обмотки троса ДНК с помощью N оказывается, ДНК оказывает восстанавливающий момент на шарик, который ведет к смещению равновесия углового положения от θ 0 до θ N. (Б) Пример угловых следов, используемых для измерения крутящего момента:. угловые колебания шарик привязан к кручение непринужденной молекулы 7,9 кб ДНК до (синий) и после введения 40 витков (темно-красный) (ср.) Измерение крутящего момента на 7,9 кб молекулой ДНК в PBS буфере проводятся на улрвота силу ~ 3 PN использованием исходных точек маркера шарик основе угловая протокол слежения. Угловые колебания, как показано в (б) были записаны в зависимости от числа оборотов прикладной. (С) стандартное отклонение угловых колебаний в зависимости от применяемых поворотов. Ширина колебаний примерно постоянна, что указывает на постоянную жесткость угловой ловушки. (Г) Сдвиг среднего угла вращения в зависимости от применяемых поворотов. Систематические сдвиги среднего угла при чрезмерной и подмотки являются очевидными. (Е) одновременно контролировать ДНК расширение троса в зависимости от применяемых поворотов. (F) Крутящий момент, оказываемое троса ДНК, определенной от среднего угла, показанного на (D) , см. основной текст. Над-и подмотки около нуля витков приводит к линейному по крутящему моменту оказывается реакцию ДНК-троса (встроенные серые склоны ионов (г) и (е)), который может использоваться для определения эффективной длины скручивание персистентности (~ 77 нм для этого набора данных). Кроме того перекручивания приводит к потери устойчивости и формирование plectonemic супервитков (схематически показаны на вставках), что соответствует плато крутящего момента (черная линия на положительных оборотов в (Е) на ~ 26 пН · нм) и линейным уменьшением расширения троса с номером витков (черный спуск в (е)). Амортизация за линейном режиме заставляет ДНК локального плавления (показано на вставках слева), отмечен плато крутящего момента, равного крутящего момента плавления (черная линия при отрицательных оборотов в (е) при ~ -11 пН · нм).

Патент связанных с этой работой была подана в соответствии с эталонной PCT/NL2011/050446.