Ножевое ранение Травма данио рерио взрослых мозге: Метод по расследованию позвоночных мозг нейрогенеза и Регенерация

Млекопитающие имеют очень ограниченные возможности мобилизации новых нейронов во взрослой жизни, и взрослый нейрогенез в мозге, в основном, ограничивается двумя конечного мозга регионов, расположенных на субвентрикулярной зоне (SVZ) боковых желудочков, и под зернистым зона (SGZ) зубчатой извилины в гиппокампе ^1. Млекопитающие также не может восстановить повреждения мозга, вызванного нейродегенеративных заболеваний, инсульта или травмы, эффективно. Потерянные нейроны не будут заменены, а вместо этого пролиферации различных типов глиальных клеток, в том числе астроцитов, микроглии и олигодендроцитов, не наблюдается. Как следствие этого пролиферативной процесса, называемого реактивного глиоз, раненых ткани мозга уплотнен образованием глиальных шрам, который ингибирует нейрональные и регенерацию аксонов ^2-4.

В отличие от млекопитающих, костистых рыб, как данио сформировать новые нейроны в изобилии в взрослой стадии и имеют высокую регенеративные и proliferatив потенциал для ремонта поражения центральной нервной системы ^2,5-7. Данио взрослый мозг содержит 16 различных нейронных ниши стволовых клеток, которые генерируют большое количество новых нейронов в течение всей жизни ^8-11. Нейроны, рожденные в этих конкретных распространения зон взрослого данио мозга мигрируют в своих целевых районах, где они будут сроком погашения и интеграции в существующие нейронных сетей ^8,10,12-15.

Среди предшественников зон, определенных в взрослых данио, зона конечного мозга желудочка является одним из наиболее изученных нервных стволовых клеток ниши. Клетки в этой нише предшественников могут быть классифицированы на три группы в отношении их морфологию, скорость деления и экспрессию различных глиальных или нейронных маркеров. Тип I и клетки типа II радиальные глии как клетки, которые имеют длинные процессы. Они выражают стволовых клеток маркеры, включая GFAP, нестина и S100β. Тип I клетки не размножаются в то время как клетки типа II proliferatэ медленно, о чем свидетельствует их выражения распространения маркеров, таких как пролиферирующих клеток ядерного антигена (PCNA) и включение desoxythymidine аналогов. Клетки III типа быстро делящихся клеток, которые привержены стать нервные клетки-предшественники и выразить нервные маркерных генов, таких как PSA-NCAM ^5,16.

Хотя регенеративные мощности костистых рыб, хорошо документированы, всего в нескольких публикациях описаны и подробно исследовали клеточные и молекулярные механизмы, участвующие в регенерации нейронов во взрослом мозге в ответ на повреждение ^15,17-22. Чтобы расшифровать механизмы, причастных к данио взрослого центральной нервной регенерации и восстановления системы и понять сходства и различия между конститутивной и регенеративной нейрогенеза, мы разработали данио модель взрослого травмы конечного мозга. Здесь мы опишем визуально, как генерировать травмы в одном из конечного мозга hemisphERES с помощью иглы шприца, при сохранении контралатеральной непораженный сторону в качестве внутреннего контроля. Мы также покажем, как контролировать изменения при травме в клеточной пролиферации и экспрессии генов с помощью иммуногистохимии и в гибридизация анализов.

Данио рерио были сохранены в рыбной объекта Института токсикологии и генетики (ITG) в Технологический институт Карлсруэ (KIT). Эксперименты на животных были проведены в соответствии с немецкими стандартами по защите животных и были одобрены правительством земли Баден-Вюртемберг, Regierungspräsidium Карлсруэ, Германия (Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 'Взрослый Neurogenese').

1. Генерация ножевое ранение в мозге

1. Анестезия
   1. Для приготовления исходного раствора Tricaine (3-амино-бензойной кислоты этиловый эфир, называемый также этил-3-аминобензойной кислоты), используют 400 мг Tricaine порошка и растворить его в 97,9 мл воды и 2,1 мл 1 М Трис / HCl буфер (рН 9). Доводят рН до 7. Сделать 5 мл аликвоты и хранить их при -20 ° С до использования.
   2. Трансфер соответствующее количество 0,5-1 летнего рыбок данио от своих танков в пластиковых клетках мыши. Примечание: череп взрослого рыбок данио на около 12месячного возраста все еще ​​относительно мягким и легко может быть перфорирована с помощью иглы (см. раздел 1.2.3 и рис 1А).
   3. Чтобы обезболить взрослых данио, объединить 5 мл Tricaine (исходный раствор) в пластиковых пересечения клетку с ~ 100 мл чистой рыбы резервуар для воды (конечная концентрация Tricaine 0,02% (вес / объем) Tricaine).
   4. Выдержите рыбу в анестетиков, пока они не больше не двигаются (45-60 сек).
2. Телэнцефалона Травма
   1. Место индивидуальный наркоз данио в щель в блоке Tricaine пропитанной пены.
   2. Под микроскопом рассекает со светом сверху мягко держать рыбу с одной стороны, и ориентировать его таким образом, что позволяет получить доступ к голове сверху.
   3. С другой стороны подтолкнуть 30 г шприц (инсулиновый шприц с интегрированной иглой) вертикально через череп в медиальной области одного конечного мозга полушарии (1А-1В). Полушария конечного мозга авновь видны через череп. Убедитесь, что введен поражение не глубже, чем 2 мм (рис. 1в). Примечание: Настоятельно рекомендуется ввести поражение всегда в том же полушарии, чтобы облегчить идентификацию месте поражения, когда рассекает мозг из черепа.
   4. После введения конечного мозга травмы, поместите рыбу в свежей рыбы воды. Держите до 10 рыб в клетке 2 л мыши, наполненный рыбой воды для восстановления и подключите клетку мыши к системе подачи воды. Примечание: выживаемость, как правило, ~ 97%, если рыба здоровы и никаких других эксперименты не проводились с рыбой раньше. Добавление антибиотиков для рыбы воды не надо. После выздоровления, рыбы ведут себя нормально: они плавают, кормов и мат.

2. Анализа влияния конечного мозга травмы

1. Мозг Вскрытие и Фиксация
   1. Повторно восстановленный анестезировать рыбы в различные моменты времени после повреждения (Typicallу, 1, 3, 5 и 14 дней после поражения (DPL)) с 0,02% (вес / объем) Tricaine, как указано выше, и их эвтаназии, поместив их в воду со льдом в течение 5 мин.
   2. Поместите рыбу на бумажной ткани, смоченной в фосфатно-солевом буфере (PBS) и отделить голову от тела за счет сокращения жабры с резким ножницами.
   3. Держите голову в 1x PBS в течение 5 мин, чтобы позволить кровотечение. Примечание: Эта истощает кровь из ткани, которая может возмутить дальнейшие шаги в протоколе.
   4. Закрепить головы в течение ночи при 4 ° С в 4% параформальдегида (PFA) в PBS или 4 часа при комнатной температуре (RT).
   5. Промыть фиксированные головы дважды с 1x PBS в чашке Петри.
   6. Тщательно Рассеките мозги в 1x PBS при вскрытии микроскопом ^23. Поражение, как правило, видны под микроскопом рассекает. Мозги без видимого поражения должен быть уничтожен.
   7. Передача мозги в 2 мл реакционных трубок, заполненных 1,5 мл 100% метанола (MeOH) и инвертировать трубки 5x перед инкубациейих при -20 ° С в течение по крайней мере 16 часов. Примечание: Мозги может храниться в течение нескольких месяцев в МеОН при -20 ° С до использования для иммуногистохимии или в гибридизация.
2. Подготовка ткани для иммуногистохимии
   1. Увлажняет мозги через метанола серии нисходящей в 2 мл пластиковые пробирки (последовательно 75% метанола (1x PBS, 0,1% Твин-20 = Оптовая цена);. 50% метанол, 25% метанол Выдержите мозги (15 мозги / 2 мл пробирок ) в течение 5 мин в каждом растворе.
   2. Вымойте голову в ПТВ в течение 5 мин. Повторите 4 раза со свежим PTW.
3. Вложение интеллектов для секционирования
   1. Для встраивания, передача мозги из реакционной трубки 2 мл в PTW в полости полиэтилен формования чашек с передачей пипетки (диаметр 5 мм).
   2. Подготовьте 2% агарозы (степень ДНК) в 1x PBS в колбе Эрленмейера. Нагрейте ее в микроволновой печи при 600 Вт, пока агарозном не растворится полностью. Подготовка 50 мл в течение 10 мозгов. Пусть йе агарозном остыть в течение 3 мин при комнатной температуре перед использованием. Держите агарозы на предварительно нагретой нагревательный блок (60 ° C), а вложение мозги для того, чтобы предотвратить затвердевание.
   3. Извлеките 1X PBS из пресс-формы, содержащей один мозг с помощью пипетки Пастера (диаметр 1 мм). Будьте осторожны, чтобы не повредить мозг.
   4. Налейте агарозы в форму и полностью заполнить его. Затем используйте рассечение иглы циркулировать мозг в агарозы, чтобы смыть PTW облегчая вставлять мозг.
   5. Ориент мозг в формы брюшной стороне вниз, из стороны спинной и поместить его прямо.
   6. Пусть агарозы остыть. Для более быстрого охлаждения, поместите форму на льду. Повторите шаги.
   7. Повторите 2.3.3-2.3.6 для всех мозгов.
4. Обрезка агарозы блока
   1. Использование рассечение иглы, выскочить агарозы блок.
   2. С острым лезвием бритвы, вырезать агарозы на заднем конце головного мозга. Убедитесь, что это плоскость параллельна ТЕlencephalon.
   3. Обрежьте агарозы на переднем конце головного мозга. Тогда переверните блок так, чтобы он стоит на заднем плане.
   4. Удалить избыток агарозы путем разрезания параллельно спинной мозга и брюшной сторон. Тогда переверните мозг назад, чтобы он лежит на брюшной стороне.
   5. Разрежьте блок усеченного треугольника, в котором конечный мозг находится в меньшей плоскости (рис. 2).
5. Подготовка Vibratome для секционирования
   1. Подготовьте Vibratome в соответствии с инструкциями изготовителя. Используйте новую лезвие и заменить его после 10 мозгов.
   2. Заполнить буфер ванны с 1х PBS до уровня, который просто достигает дна лезвия.
   3. Поместите маленькую точку суперклея на верхней части образца диска в Vibratome.
   4. Осторожно поместите самолет, который находится кзади от мозга на суперклей. Клей затвердеет, как только он находится в контакте с 1x PBS вбуфер ванна Vibratome.
   5. Вставьте образца диск с образца в буферный лоток с помощью манипулятора микротоме.
   6. С помощью манипулятора для вращения образца диск в требуемом положении. Расположите блок в буферном ванной таким образом, что находит конечного мозга прямо под поверхностью, с спинной части мозга, обращенной лезвие. Затем затяните ЮКЖД с 3 мм шестигранным ключом и снимите манипулятор. Примечание: зажимной винт или один из зажимных устройств не должен быть расположен над зазором в образце диска; в этих позициях зажима образца диск невозможно.
6. Секционирование мозг
   1. Подготовка 24-луночный планшет для сбора секций. За мозга быть секционного, заполнить один хорошо 1 мл блокирующего буфера (0,1% (объем / объем) 10% Твин-20, 0,2% (вес / объем) бычьим сывороточным альбумином (BSA), 1% (об / об) диметилсульфоксид (ДМСО) в PBS).
   2. Начните секционирования при 50 толщиной мкм, скорость 1 мм / сек и 70 Частота Гцс помощью вибрационного микротом.
   3. Используйте синтетическую щетку (1 мм), чтобы забрать тонкие ломтики агарозы как они отрываются лезвие и собрать их в тарелку 24-а.
7. Иммуногистохимия на Vibratome разделах
   1. Блок неспецифические сайты связывания для 1 часа при комнатной температуре в блокирующем буфере (0,1% (объем / объем) 10% Tween 20, 0,2% (вес / объем) BSA, 1% (об / об) ДМСО в ЗФР).
   2. Удалить супернатант и добавить 250 мкл разведенного антитела в блокирующем буфере в течение ночи при 4 ° С. Кроме того, инкубировать первичного антитела в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем промыть 3 раза в течение 10 мин в ПТВ. Примечание: Для окрашивания PCNA использовать разведение 1:400 (мыши анти-PCNA Более подробную информацию см. в таблице материалов.). Несколько первичные антитела можно инкубировать в то же время.
   3. Инкубируйте разделы в вторичными антителами в течение 2 ч при комнатной температуре затем промыть 3 раза в течение 10 мин в PTW. Примечание: разведении 1:1000 в ПТВ, для детальных см. таблицу материалов. Несколько вторичные антитела можно инкубировать в то же время.
8. Взрослый мозг РНК в гибридизация (в качестве альтернативы иммуногистохимии)
   1. Мозг Вскрытие и фиксация (та же процедура, для иммуногистохимии):
      1. Гибридизация зонда.
      2. Увлажняет мозги в 2 мл пробирки реакции, как описано для иммуногистохимического анализа.
      3. Инкубировать мозги в протеиназой К (ProtK;. 10 мкг / мл конечная концентрация) в PTW течение 30 мин. После инкубационного периода удалить ProtK / PTW и исправить мозги снова в течение 20 мин в BT-Fix (4% PFA, 4% сахарозы, 0,12 мМ CaCl _2, 77 мМ Na ₂ HPO _4, 23 мМ NaH ₂ PO _4).
      4. Промыть мозги 5x течение 5 мин в PTW (0,1% (объем / объем) Твин-20 в PBS).
      5. Удалить PTW и промыть мозги в 500 мклHYB буфер (50% (объем / объем) деионизированной формамид, 5x SSC, 500 мкг / мл дрожжевой тРНК, 50 мкг / мл гепарина, 0,1% Tween-20, 9 мм citricacid). Подождите пока мозг не оседают на дне пробирки затем отбросить супернатант и добавить 500 мкл буфера чистой HYB и инкубировать при 65-70 ° С в течение 3-4 часов.
      6. Развести РНК зонд до 1:200 или 1:400 (в зависимости от зонда) в 400 мкл конечного объема HYB буфера. Нагреть разбавленный РНК зонд при 70 ° С в течение 5 мин.
      7. Удалить супернатант из мозга и добавьте РНК зонд, инкубировать при 65-70 ° C (O / N). Все для мытья буферные растворы должны быть предварительно нагретой и выдерживали при 70 ° C.
   2. Маркировка
      1. Промыть мозги при 65-70 ° С (в течение всех стадий промывки 4) с 500 мкл промывочного буфера 1 (50% формамид, 1x SSC, 0,05% Tween 20) дважды в течение 30 мин. Заменить буфер на один буфера 2 (2x SSC, 0,1% Tween 20) и инкубируют в течение 15 мин. Удалить буфер 2 и мыть голову в буфере 3 (0,2 x SSC, 0,1% Твин 20) FOR 30 мин, повторите этот шаг 2 раза. Заменить буфер на 3 буфера 4 (0,1 x SSC, 0,05% Tween 20 в PTW), инкубируют в течение 5 мин.
      2. Удалить супернатант и мыть в течение 5 мин в 500 мкл PTW при комнатной температуре.
      3. Вставить мозги в 2% агарозы (в 1х PBS) и сократить Vibratome секций (50-100 мкм), как описано для иммуногистохимического анализа.
      4. Wash 1x течение 5 мин в 500 мкл блокирующего буфера (1X PBS, 0,1% Твин-20, 0,2% (вес / объем) BSA, 1% (об / об) ДМСО).
      5. Удалить супернатант и добавить 500 мкл блокирующего буфера в течение 2 часов при комнатной температуре.
      6. Удалить супернатант и добавить 300 мкл анти-Dig AP связью антитела, разведенного 1:4000 в блокирующем буфере.
      7. Выдержите O / N при 4 ° С.
   3. НБТ / BCIP Окрашивание
      1. Промыть 5x в течение 15 мин с PTW буфере при комнатной температуре.
      2. Промыть 1x в окрашивания буфера. Промыть два раза 5 мин в окрашивающего буфера (100 мМ Трис / HCl рН 9,5, 50 мМ MgCl _2, 100 мМ NaCl, 0,1% Tween-20).
      3. Удалить супернатант и пятна с 500 μл окрашивание раствор (3,5 мкл 4-тетразола метилене (NBT) и 5-бром-4-хлор-3-индолил-фосфат (BCIP) в 1 мл окрашивающего буфера).
      4. Остановить окрашивания путем промывки 3 раза до 5x с ПТВ.
9. Монтаж секций
   1. Установите разделы на слайдах с использованием водорастворимой, не-флуоресцентный монтажную среду (см. таблицу материалы).
   2. Держите слайды в холодильнике при температуре 4 ° C. Примечание: окрашивание стабилен в течение нескольких недель или даже месяцев.
   3. Анализ слайды под соединением или конфокальной микроскопии.

Использование рабочего процесса описанной в этой статье, поражение было введено в правом полушарии взрослого данио мозге (1А-1В). Правильный ранение приводит к поражения канала, который простирается от спины к брюху через весь плащ конечного мозга (рис. 3C). Поражение должно быть ограничено одним из полушарий и не пересекать срединную желудочек. Поражение канал видна с ярким микроскопии (рис. 3C) и будет исцелен после примерно 35 дней 15.

Ранее было показано, что после ранения в повышающей регуляции клеточной пролиферации ядерный антиген (PCNA; фиг.3А) и S100β (фиг.3В) на 3 до 7 DPL можно обнаружить с помощью иммуногистохимии 15. Окрашивание PCNA и S100β перекрываются, указывая распространения радиальных глиальных клеток.

Furthermore, для визуализации клеток олигодендроцитов предшественника (OPCS), колотая рана Анализ проводили на Tg (Olig2: EGFP) рыба 24. После окрашивания с анти-GFP антител, накопление OPCs в непосредственной близости от повреждений канала обнаруживается (рис. 3D). Это накопление является временным, и OPC кластеры не наблюдается больше при 35 DPL 15.

Если поражение не было введено правильно, поражение канал не будет видно, и до-регулирования PCNA и S100β или накопления OPCs не будет обнаружено. PCNA является наиболее чувствительным маркером повреждения головного мозга. Для того чтобы проверить эффективность колотой раны и исключить, что оба полушария ранены, настоятельно рекомендуется всегда окрашивает разделы с антителом анти-PCNA. В правильно введена поражения, PCNA должна быть значительно повышающей регуляции (до 4-кратного 15) только в одном из полушарий. Хотя в большинстве случаев этодостаточно использовать только контралатеральный непораженный сторону в качестве внутреннего контроля для мониторинга изменения в экспрессии генов, то настоятельно рекомендуем сравнить генную экспрессию в контрольной полушарии с выражением в конечного мозга полушарий мозга дикого типа. Таким образом, любые системные эффекты поражения на экспрессию генов, которые могут повлиять обоих полушарий могут быть обнаружены.

Колотой раны анализа в сочетании с систематическим экране экспрессии регуляторов транскрипции (TRS) (25 и Schmidt и соавт., Не опубликовано) также может быть использован, чтобы идентифицировать гены TR с возможной роли в нейрогенеза и регенерации (фиг.4А-4С).

Этот подход был выявлен ряд факторов, которые выражаются в мозге и, экспрессия которых является специально регулировался в ответ на повреждение (рис. 4A-C).

Рисунок 1. Схематическое изображение взрослого данио конечного мозга колотой ранения. А) инсулин шприц игла протолкнул черепа взрослого рыбок данио для создания конечного мозга травмы. Белая пунктирная линия представляет собой границу между двумя конечного мозга полушарий и зеленый крест означает положение ножевое ранение. B) Dorsal зрения взрослого данио мозга. Основными направлениями мозга указаны. Зеленый крест показывает положение индуцированного повреждения. C) кончик иглы, которая служит для стимулирования конечного мозга травмы, измеряет 2 мм. Обонятельной луковице (OB), конечный мозг (тел) и оптического Tectum (ОТ).

Рисунок 2 S.chematic представление взрослого данио мозга в подстриженной агарозном блока непосредственно перед Vibratome секционирования. Передняя вверх. Обонятельной луковице (OB), конечный мозг (тел), оптический Tectum (OT), мозжечок (ЦБ) и мозговое вещество (м). Шкала бар: 500 мкм.

Рисунок 3. Восстановительные ответы заколоть травмы раны. Н.э.) взрослых данио мозг на 5 дней после поражения (DPL). А.Б.) Пролиферативное маркер PCNA (А) и радиальной глии маркер S100β (В) до регулируемых в вентрикулярной зоне (стрелки) на колотой ранения. (С) Поражение канала видна при ярком освещении поля (стрелки). Желудочка пояса указывается зеленой линии. (D) клетки-предшественники олигодендроцитов (Olig2: EGFP +) накапливать в месте поражения (стрелки). Шкала бар: 200 мкм. Во всех панелей, правое полушарие является поражением, полушарие. Спинной вверх. Пунктирная линия на на D указывает на границу между мантии и subpallium.

Рисунок 4. Пример генов до регулируемых в ответ на удар травмы. Обратите внимание на сильное повышающее регулирование (стрелки) из eomesa (А, В) и sox4a (С) экспрессии мРНК в правильном конечного мозга полушарии (ножом полушарие), как мониторинг на в гибридизация на 5 DPL. Левое полушарие является неповрежденной и служит в качестве контроля. (В) показывает большем увеличении спинной конечного мозга области А. Dorsal вверх. Шкала бар: 200 мкм для А и С и 55 мкм для В.пунктирная линия в А и С указывает расстояние между мантии и subpallium. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Авторы не имеют ничего раскрывать.