Улучшенная технология визуализации позволяет получать трехмерную визуализацию органов во время разработки. Здесь мы описываем целую систему культивирования органов, которая позволяет визуализировать развивающиеся ворсинки в кишечнике эмбриона мыши.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Мышь плода Всего кишка Культура Система для Экс Vivo Манипуляция сигнальных путей и трехмерных живых изображений развития ворсинки
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Большинство морфогенетические процессы в кишечнике плода были выведены из тонких срезов фиксированных тканей, обеспечивая снимки изменений более стадиях развития. Трехмерная информация из тонких серийных срезов может быть сложным для интерпретации в связи с трудностями восстановления серийных срезов прекрасно и поддержание правильной ориентации ткани над серийных срезов. Недавние открытия, сделанные Grosse др., 2011 подчеркивают важность трехмерной информации в понимании морфогенез развивающихся ворсинок кишечника 1. Трехмерная реконструкция однократно меченных клеток кишечника показали, что большинство из эпителиальных клеток кишечника связаться оба апикальных и базальных поверхностей. Кроме того, трехмерная реконструкция цитоскелета на апикальной поверхности эпителия показали, что просвет кишечника непрерывна и что вторичные люмен являются артефактом сectioning. Эти две точки, наряду с демонстрацией interkinetic атомной миграции в кишечном эпителии, определяется развивающийся кишечный эпителий как многорядный эпителий, а не расслаивается, как считалось ранее 1. Возможность наблюдать эпителия трехмерно был семенных к демонстрации этой точки и переосмысление эпителиальных морфогенез в плода кишечника. С развитием многофотонной технологии визуализации и трехмерного программного обеспечения реконструкции, способность визуализировать нетронутыми, разработки органы быстро улучшается. Двухфотонного возбуждения позволяет менее вредны проникновение вглубь тканей с высоким разрешением. Двухфотонное изображений и 3D реконструкция целых плода кишечника мыши в Уолтон и др., 2012 помог определить структуру ворсинок вырост 2. Здесь мы опишем всю систему органной культуре, которая позволяет экс естественных развитие ворсинок и расширений этой системы культуры, чтобы позволитькишечник, чтобы быть трехмерно отображаемого в процессе их развития.
Введение
Каждая ворсинка кишечника состоит из двух основных тканевых компартментов: эпителиального поверхностного слоя и мезенхимального ядра. Тонкая кишка мыши формируется на 10-й день эмбриональногопериода, когда лист энтодермы закрывается и герметизируется, образуя трубку эпителия, окруженную мезенхимальными клетками. Эта плоская трубка эпителия подвергается быстрой пролиферации, увеличиваясь как в длину, так и в обхвате, и претерпевает драматические перестройки, включающие динамические изменения формы клеток1. В то же время окружающая мезенхима также претерпевает множество процессов развития, включая формирование сосудистого сплетения, дифференцировку гладкой мускулатуры и рекрутирование энтеральных нейронов4. В проксимальном отделе тонкой кишки на 14,5-е сутки эмбриона начинают образовываться конденсации (кластеры) Hedgehog- и PDGF-чувствительных клеток рядом с эпителием2,5. Образование мезенхимальных кластеров продолжает распространяться по всей длине кишки, так что к эмбриональному дню они покрывают всю тонкую кишку. По мере формирования мезенхимальных кластеров эпителиальные клетки, расположенные ближе всего к кластерам, начинают выходить из клеточного цикла, в то время как другие эпителиальные клетки продолжают размножаться. Те клетки, которые находятся непосредственно над мезенхимальным кластером, которые вышли из клеточного цикла, начинают менять форму по мере того, как возникающие ворсинки сгибаются в просвет. Дальнейший рост ворсинок отчасти обусловлен продолжающейся пролиферацией эпителия между возникающими ворсинками. Мезенхимальные кластеры остаются плотно прикрепленными к эпителию растущих ворсинок и продолжают экспрессировать различные сигнальные молекулы. Волна появления ворсинок распространяется по всей длине тонкой кишки вслед за образованием мезенхимальных скоплений. По мере того, как кишечник продолжает расти и межворсинковая область расширяется между возникающими ворсинками, образуются новые мезенхимальные кластеры, прилегающие к эпителию между ворсинками, и за этим следуют дальнейшие раунды возникновения и роста ворсин6.
Синхронное развитие эпителия и мезенхимы необходимо для морфогенеза ворсинок. Сигнальные молекулы секретируются из одного слоя в другой, где рецепторы получают и преобразуют сигнальное сообщение, чтобы координировать развитие между эпителием и мезенхимой. Мезенхимальные кластеры действуют как сигнальные центры и экспрессируют различные морфогены развития7-10. Нарушение формирования кластера или структуры приводит к потере появления ворсинок и рисунка. Ингибирование передачи сигналов PDGF приводит к уменьшению количества кластеров и меньшего количества ворсинок, а те ворсинки, которые образуются, деформируются вслед за аномальными кластерами11. Потеря сигнализации Hedgehog приводит к полной потере формирования кластеров и невозможности появления ворсин2,12. В совокупности эти данные демонстрируют, что кластеры координируют развитие эпителия ворсинок с его мезенхимальным ядром.
Используя всю эту систему культивирования органов, мы можем изменить передачу сигналов, участвующих в перекрестных помехах эпителиально-мезенхимального кластера, чтобы определить роль этих сигналов в морфогенезе ворсинок. Двухфотонное конфокальное оптическое сечение и реконструкция позволяют визуализировать формирование кластеров и возникновение ворсинок в трех измерениях и лучше понять пространственные отношения между мезенхимальными кластерами и их вышележащим эпителием. Расширяя систему культивирования до четырех измерений, мы можем захватывать z-стеки развивающихся кластеров и ворсинок с течением времени и наблюдать за этими взаимодействиями. В конечном счете, возможность следить за развитием ворсинок таким образом и наблюдать за изменениями, происходящими с измененной сигнализацией, произведет революцию в понимании эпителиальных мезенхимальных взаимодействий в морфогенезе ворсинок.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Все мыши были обработаны гуманно, используя протоколы, утвержденные Мичиганского университета Медицинской школы Unit лабораторных животных медицины и в соответствии с руководящими принципами Комитета университета по использованию и уходу за животными.
1 целая система Органная культура
- Подготовка информации и культуры пластин
- В капюшоне культуры ткани, удалить 5 мл BGJb СМИ с фондового бутылки и добавляют 5 мл пен / стреп. Подготовьте рабочую запас СМИ в 50 мл коническую трубку, путем добавления 1 мл 5 мг / мл аскорбиновой кислоты в 49 мл BGJb СМИ (с пен / стреп).
- Подготовка культуры пластины 6 также путем добавления 1 мл под каждой из transwells.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если все 6 transwells не используются, двигаться дополнительные transwells в свежем стерильной 6-луночного планшета для последующего использования. Добавить 3 мл рабочего BGJb СМИ, чтобы каждый из трех 10 см стерильные чашки Петри.
- Подготовка для вскрытия
- Замочите рассекает инструменты в 70% этанольннол и не забудьте сохранить инструменты чистыми во время работы.
- Настройте рассекает центр с большим ведром льда и поместите культуры пластину 6 а и 10 см чашки Петри с BGJb СМИ на льду. Работа на льду, насколько это возможно, а рассечения и подготовки кишечника к культуре.
- Обезболить взрослых самок мышей в камере с изофлуораном (100 мкл) до euthanization смещением шейных позвонков для сбора плода кишечника.
- После сбора плоды от своей матери, поставить друг плод тщательно в соответствии с Theiler постановка диаграмму 13. Не полагайтесь на дней после полового акта, чтобы определить возраст каждого плода как вариаций до 24 часов в стадии развития регулярно наблюдается в пределах одного помета.
- Рассечение плода кишечника
- Усыпить плоды от обезглавливания перед удалением кишечника.
- Рассеките каждый кишечник в 1X Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором (DPBS), а затем PLAв.п. его в 10 см чашку Петри с работы BGJb СМИ.
- Осторожно снимите селезенки из желудка и поджелудочной железы от живота и верхней двенадцатиперстной кишки.
- Аккуратно отделить сальник заботясь, чтобы оставить сальника, прикрепленный как можно больше и разделения соединений только достаточно, чтобы позволить кишечник, чтобы быть выпрямлены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для кишечник старше E14.5 или тех, которые культивировали дольше, чем 24 часов, мягко отделить кишечник на 3 равные части, чтобы обеспечить просвета содержание течь через кишечник и быть исключен из обрезанными концами. Тем не менее, для культур начала до E13.5, ждать, пока после 24 ч культивирования перед отделением 3 сегменты кишечника, чтобы позволить серозной расти должным образом по всей длине кишечника. - Используйте рот пипеткой перенести кишечную штук на transwells культуральной пластины (1.1.2).
- Осторожно переместить кишечник по мере необходимости так, что они прямо через transwelл.
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как кишечник начинают двигаться просвета содержимое через трубку, либо перегибы в кишечнике вызовет резервного копирования и повреждения кишечника.
- Культура и лечение
- Выньте материал из под Transwell, добавить 700 мкл лечения СМИ (Рабочая среда с добавлением рекомбинантных белков или фармакологических ингибиторов) под Transwell.
- Добавить 300 мкл лечение СМИ каплям сверху кишечнике и дайте ему впитаться через Transwell. Повторно кишечник по мере необходимости.
- Изменение обработки медиа по крайней мере, один раз в день или чаще, в зависимости от периода полураспада реагента лечения.
- Подготовка белковых замачивают агарозы для локализованного источника лечения реагента
- Ресуспендируют агарозном бисером в их контейнере для хранения и передачи 100 мкл агарозы в 1,5 мл пробирке.
- Заполните оставшееся объем трубки стерильной 1x Phosphate-солевой буфер (PBS) и смешать шарики, чтобы вымыть их. Поместите пробирке в стойку в течение нескольких минут, чтобы позволить шарики оседают на дно, а затем пипеткой от PBS от сверху бисером. Заполните пробирке стерильным 1x PBS и повторить процесс стирки в два раза больше.
- Подготовьте интерес белок в два раза больше требуемой концентрации для лечения.
- Смешайте 5 мкл промытых агарозы с 5 мкл белка складе 2x и аккуратно перемешивать шарики в белке. Поместите пробирку на льду в течение 1 ч, перемешивание аккуратно каждые 10-15 минут.
- Промыть бусы кратко в стерильной 1x PBS до размещения бусинки на кишечнике.
- Размещение агарозы
- Аккуратно поместить агарозном бисером в верхней части кишечника с помощью пипетки с рот тянут капиллярных игл. Поместите шарики с особой осторожностью, так как небрежное обращение может привести к повреждению кишечника и предотвратить развитие ворсинок в травмированной области.
- Поместите в два раза больше бусины, которые необходимы для анализа, так как кишечник будет пройти перистальтических движений и около половины шариков, помещенных сойдет кишечника за время культивирования.
- Фиксация культивируемых кишечника
- Осторожно снимите лечения СМИ снизу Transwell и позволяют кишечник высохнуть на воздухе в течение 3 мин.
- Добавить 1 мл фиксатора под Transwell в течение 2 мин, затем покрыть верхнюю часть кишечника с 2 мл фиксатора на оставшуюся часть времени фиксации. Закрепить 4% параформальдегидом O / N при 4 ° С или в течение 2 ч при комнатной температуре.
2 Визуализация основных кишок
- Wholemount изображений
- Поместите целые кишечник (с эндогенной флуоресценции) на слайде с 100 мкл 1х DPBS. Используйте пинцет, чтобы аккуратно организовать кишечник.
- Используйте лаборатории ткань осторожно снимите DPBS и сразу добавить 100 мкл 70% глицерина, чтобы сделать ткани моповторно прозрачным и увеличить возможную глубину изображения.
Примечание: Если дальнейшее проникновение кишечника желательно, вместо монтажа в кишечник в 70% глицерине, замочить в кишечник в течение нескольких капель раствора фокусировки Ясно в течение 10-30 мин. Внесите от решения Фокус Ясно и смонтировать кишечник с горы дожди. - Опустите каждый из четырех углов покровного в пластилина и забрать небольшое количество глины для использования в качестве прокладок между горкой и покровного держать покровное от уплощение кишечник.
- Печать покровное на слайд с растопленным VALAP прикладной ватным тампоном.
- Изображение кишечник по обе вертикальном или перевернутом конфокальной микроскопии. Пожалуйста, обратитесь к дискуссии для более подробной информации.
- Vibratome секционирования основных кишечника (для поперечного сечения зрения кишечных структур)
- Код для вставки кишечник в 7% агарозы в небольших пластиковых форм (10 х 10 х 15 мм) и позволить агарозные блоки востыть и затвердеть.
- Удалить агарозные блоки из пластиковых форм и клей агарозные блоков в стадии сбора vibratome с мгновенным клеем.
- Заполните этап сбора ледяной 1x DPBS.
- Сокращение секции при толщине между 100-150 мкм. Для более толстые участки использовать клиринговые решения (описанный в разделе 2.1.2), чтобы визуализировать глубже в поперечном сечении.
- Налейте vibratome секции от стадии сбора в лунку 6-луночного планшета для хранения при 4 ° С.
- Иммунофлуоресцентное окрашивание фиксированных, vibratome секционного тканей
- Поместите 5-12 vibratome секции на лунку в 24-луночный планшет с 1x DPBS.
- Удалить 1x DPBS и добавить 500 мкл пермеабилизации решения на лунку. Осторожно образцы в течение 25 мин при комнатной температуре.
- После проницаемости, мыть образцы 3 раза 1x PBS.
- Блок образцы, по крайней мере 30 минут в 500 мкл блокирующего раствора.
- После блокировки, еXCHANGE блокирующий раствор с 500 мкл первичных антител разводят в блокирующем растворе и поддерживать образцов при 4 ° CO / N.
ПРИМЕЧАНИЕ: разведения первичных антител, которые хорошо работают на замороженных и парафиновых срезах как правило, работают хорошо на vibratome секций тоже, однако антитела требуя извлечение ядерного антигена как правило, не работают хорошо с этим протоколом (например, BrdU). - На следующий день, мыть образцы 3 раза в течение 15 мин каждый раз с блокирующим раствором.
- После промывки применяют 500 мкл вторичного антитела, разбавленного в блокирующем растворе. Оберните пластину 24-а в алюминиевую фольгу для защиты флуорофоры от света и рок образцы в течение 45 мин до 2 ч при комнатной температуре.
- Вымойте образцы 3 раза 1x PBS в течение 15 мин каждого и смонтировать vibratome разделы на слайдах, как описано в разделе 2.4.
- Монтаж vibratome разделы
- Подготовить слайды для vibratome монтажа за счет сокращения тонкие ломтики дважды ИПППск ленты и размещение их вдоль длинных сторон слайдов.
- Осторожно поместите 5-10 vibratome разделы между двойной палки лентой на слайдах в капле 100 мкл 1x PBS.
- Открываются все разделы и разложил их в один слой по стеклу.
- Удалите излишки агарозы или неровные кусочки, которые препятствовали бы покровное от сидения плоским.
- Осторожно использовать лабораторную ткани, чтобы впитать лишнюю 1x PBS со всего секциях vibratome.
- Добавить каплю водной среде монтажа на верхней части секций vibratome а затем покровное.
- Печать покровные на слайдах с растаял VALAP применяется с помощью ватного тампона.
- Изображение в vibratome разделы по обе вертикальном или перевернутом конфокальной микроскопии. Пожалуйста, обратитесь к дискуссии для получения более подробной информации по выбору системы формирования изображения.
3 Живая съемка Whole кишок
Кишечник собирают из fetuseс после E12.5, с подключенный сальник остаются нетронутыми, успешно развиваться ворсинки в культуре с использованием вышеуказанного систему. Таким образом, этот экс виво система допускает захват живых Z-секции изображений развивающихся кишечника, которые могут быть восстановлены для трехмерного зрения морфогенеза с течением времени.
- Настройка живого изображения
- Используйте мгновенный клей придерживаться индивидуального поликарбоната мембраны к экрану мелкой сеткой. Это обеспечивает поддержку эшафот провести кишечник в месте ниже погружения хрусталика вертикальном конфокальной микроскопии. Пожалуйста, обратитесь к разделу обсуждения для получения более подробной информации по выбору живых микроскопов изображений.
- Поместите сито в центре лунку планшета для культуры.
- Поместите расчлененный кишечник на поликарбонатную мембрану и добавить каплю моментального клея на обоих концах. Используйте только достаточно клея, чтобы прикрепить кишечник, но не пальто это!
- Добавить питательных сред бесплатно из фенола красного ниже поликарбонатаМембрана в центре скважины из культурального планшета.
- Добавьте воду к внешнему краю пластины культуры, чтобы обеспечить влажность.
- Поскольку плода кишечник подвергается перистальтический-как волны сжатия в культуре, добавить 100 мкл 1: 5 решения ксилазина в 1x PBS до 3 мл СМИ контролировать движение кишечника то время визуализации. Эта доза будет контролировать кишечных движений для около 8-10 часов без ущерба для развития ворсин.
- Для поперечной зрения кишечника, вставлять живые кишечник в 3-4% раствором агарозы и сократить толстые секции (150-500 мкм) на vibratome. Подходим жесткость агарозы с жесткостью кишечника сокращаются и эмпирически определили этап развития. Как правило, 3% раствор агарозы хорошо работает для кишечника в возрасте до E14.5 и 4% раствор хорошо работает для кишечника E15-E16.
- Клей vibratome разделы на поликарбонатную мембрану, проставленный на сито (как в разделе 3.1.1) икультура, как описано в разделе 3.1.2-3.1.6.
- Проведите живого изображения с использованием двухфотонного конфокальной флуоресцентной микроскопии (лазерный возбуждения между 690-1,040 нм) на вертикальном стенде с перестраиваемой таблице.
- Двухфотонное лазер настроен на 900 нм обеспечивает глубокое проникновение с наилучшим разрешением для GFP сигналов. Это уменьшает повреждение тканей во время визуализации. Кроме того, установив мощность лазера до минимально возможного выброса уменьшает повреждение тканей. Как правило, чтобы получить хороший возбуждение GFP, использовать 12% мощности на двухфотонного лазера.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Культура целых эксплантатах плода кишечника позволяет анализов расположения, распределения и продолжительности сигнальных молекул, которые координируют кишечного развитие, так как эта система позволяет манипулировать сигнализации с фармакологических реагентов или рекомбинантных белков. Система Transwell культуры (Фигура 1А, воспроизводятся с Walton и соавт., 2012) 2 обеспечивает интерфейс воздуха и жидкости, что позволяет разместить лекарственно или белок пропитанные шарики агарозы н...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Динамичный характер и сложные ткани взаимодействия развивающегося кишечника требуется 3D визуализацию, чтобы иметь полную оценку этих морфогенетических событий. С развивается технология визуализации, способность изучать ворсинок морфогенез подробно разрабатывает / улучшение и с ним, понимание пространственной общения и взаимодействия во время органогенеза значительно усиливается.
Альтернативные методы культивирования целые кишечник также были протестированы, но система Transwell остается наи...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет никаких финансовых противоречий.
Благодарности
Мы с благодарностью выражаем признательность доктору Деборе Л. Гумуцио в качестве нашего консультанта и за ее неоценимую поддержку в определении культуры и методов визуализации. Мы также благодарим доктора Джима Броди, доктора Хонг-Сян Лу, доктора Шарлотту Мистретту и доктора Энн Гроссе за их вклад в развитие системы культивирования органов всего кишечника. Полезные дискуссии по визуализации дали отличные советы от доктора Чипа Монтроуза, Майкла Червински и Саши Мешинчи. Вся визуализация была выполнена в лаборатории микроскопии и анализа изображений Мичиганского университета. Финансовая поддержка была предоставлена NIH R01 DK065850.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Тонко рассекающие щипцы | Инструменты для изобразительной науки | 11254-20 | 2 пары |
| 70% этанола | |||
| 1x стерильный фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS) | Gibco | 14040-133 | 500 мл |
| 6-луночные планшеты | Costar | 3516 | |
| 24-луночные планшеты | Costar | 3524 | |
| Чашки Петри 60 x 15 мм | Falcon | ||
| Пластины Transwell, вставки 24 мм, поликарбонатные мембраны 8,0 мм | Corning Costar | 3428 | 6 вкладышей на пластине |
| BGJb media | Invitrogen | 12591-038 | 500 мл |
| PenStrep (10 000 ЕД/мл Пенициллин; 10 000 мг/мл стрептомицина) | Gibco | 15140 | |
| Аскорбиновая кислота | сигма | A0278 | сделать бульон 5 мг/мл, процедить, аликвотировать и хранить при -20 °°; C |
| Ротовая пипетка (аспираторная трубка Drummond 1-15 дюймов в сборе) | Fisher | 21-180-10 | Снимите аспиратор в сборе и замените его на 1,000 & микро; l наконечник пипетки, который действует как адаптер для подключения 6-дюймовой стеклянной пипетки Пастера. |
| 6-дюймовые стеклянные пастеровские пипетки | |||
| для капиллярных трубок | World Precision Instruments | TW100F-4 | тянуть к иглам |
| 4% Параформальдегид | производится в 1 x PBS, pH до 7,3 | ||
| Культуральные планшеты | Falcon | ||
| Мелкоячеистый экран из нержавеющей стали | купить в хозяйственном магазине | ||
| Поликарбонатные мембраны | Thomas scientific | 4663H25 | в качестве альтернативы, отрезать мембраны Corning Costar 3428 от трансвелловых опор |
| Мгновенный клей | купить в хозяйственном магазине | на основе геля предпочтительно | |
| 35 x 10 мм пластины | Falcon | ||
| 7% агароза | Sigma | А9414 | приготовьте в/в в 1х DPBS, нагревая растворить на водяной бане |
| мельчайшие булавки | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Фенол красный свободный фильтрующий материал (DMEM) | Gibco | 21063-029 | |
| Ксилазин (100 мг/мл) | AnaSed | 139-236 | |
| Matrigel | BD | 356231 | матрикс базальной мембраны, фактор роста снижен, фенол красный не содержит |
| 3-4% агарозы | Sigma | A9414 | готовить ж/в в 1x DPBS, нагревать до растворения на водяной бане |
| Визуализация неподвижного кишечника | |||
| Наименование материала/оборудования | Компания | Номер в каталоге | Комментарии/Описание |
| вазелин | покупка в аптеке | используется для изготовления VALAP: равные части вазелина, ланолина, парафина | |
| ланолина | Sigma | L7387 | используемый для изготовления VALAP: равные части вазелина, ланолина, парафина |
| Surgipath | 39601006 | используемые для изготовления VALAP: равные части вазелина, ланолина, парафина | |
| 70% глицерина в 1 x PBS | |||
| Focus clear и Mount Clear | CelExplorer Labs Co. | F101-KIT | |
| Пластилин для лепки | купить в магазине | ||
| двойная палочка ватный | |||
| аппликатор | |||
| пластиковые формы, 10мм х 10мм х 5 мм) | Салфетка Tek | 4565 | |
| слайды | |||
| покровные салфетки лабораторная | |||
| салфетка | Кимберли Кларк | 34155 | безворсовая деликатная работа салфетка |
| Тейлер постановочная таблица | http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf | ||
| Leica SP5X конфокальный микроскоп | Leica | использовалась для проведения визуализации в реальном времени | |
| Стенд Leica DMI 6000 | Leica | использовалась для проведения визуализации в реальном времени | |
| Водная монтажная среда (Prolong Gold) | Молекулярные зонды | P36930 | |
| Наименование материала/оборудования | Номер компании | в каталоге | Комментарии/Описание |
| 24-луночная пластина | Costar | 3524 | |
| Тритон Х-100 | Сигма | T-8787 | используется для изготовления раствора для пермеабилизации: 0,5% Triton X-100 в 1 x PBS |
| сыворотка для козьей сыворотки | , используемой для приготовления блокирующего раствора: 4% сыворотка для коз, 0,1% Tween20 в 1 x PBS | ||
| Tween20 | Сигма | П9416 |
Ссылки
- Grosse, A. S., et al. Cell dynamics in fetal intestinal epithelium: implications for intestinal growth and morphogenesis. Development. 138, 4423-4432 (2011).
- Walton, K. D., et al. Hedgehog-responsive mesenchymal clusters direct patterning and emergence of intestinal villi. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15817-15822 (2012).
- Wells, J. M., Melton, D. A. Vertebrate endoderm development. Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 393-410 (1999).
- Hashimoto, H., Ishikawa, H., Kusakabe, M. Development of vascular networks during the morphogenesis of intestinal villi in the fetal mouse. Kaibogaku zasshi Journal of anatomy. 74, 567-576 (1999).
- Mathan, M., Moxey, P. C., Trier, J. S. Morphogenesis of fetal rat duodenal villi. Am J Anat. 146, 73-92 (1976).
- Burns, R. C., et al. Requirement for fibroblast growth factor 10 or fibroblast growth factor receptor 2-IIIb signaling for cecal development in mouse. Dev Biol. 265, 61-74 (2004).
- Pabst, O., Schneider, A., Brand, T., Arnold, H. H. The mouse Nkx2-3 homeodomain gene is expressed in gut mesenchyme during pre- and postnatal mouse development. Dev Dyn. 209, 29-35 (1997).
- Pabst, O., Zweigerdt, R., Arnold, H. H. Targeted disruption of the homeobox transcription factor Nkx2-3 in mice results in postnatal lethality and abnormal development of small intestine. Development. 126, 2215-2225 (1999).
- Kaestner, K. H., Silberg, D. G., Traber, P. G., Schütz, G. The mesenchymal winged helix transcription factor Fkh6 is required for the control of gastrointestinal proliferation and differentiation. Genes & Development. 11, 1583-1595 (1997).
- Madison, B. B., McKenna, L. B., Dolson, D., Epstein, D. J., Kaestner, K. H. FoxF1 and FoxL1 link hedgehog signaling and the control of epithelial proliferation in the developing stomach and intestine. J Biol Chem. 284, 5936-5944 (2009).
- Karlsson, L., Lindahl, P., Heath, J. K., Betsholtz, C. Abnormal gastrointestinal development in PDGF-A and PDGFR-(alpha) deficient mice implicates a novel mesenchymal structure with putative instructive properties in villus morphogenesis. Development. 127, 3457-3466 (2000).
- Mao, J., Kim, B., Rajurkar, M., Shivdasani, R., Mcmahon, A. Hedgehog signaling controls mesenchymal growth in the developing mammalian digestive tract. Development. 137, 1721-1729 (2010).
- Theiler, K. The house mouse. Development and normal stages from fertilization to 4 weeks of age. , 2, Springer-Verlag. (1989).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Mol Cell Biol. 23, 4013-4025 (2003).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Fu, Y. Y., et al. Microtome-free 3-dimensional confocal imaging method for visualization of mouse intestine with subcellular-level resolution. Gastroenterology. 137, 453-465 (2009).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
