Высокая пропускная Титрование люциферазы экспрессирующих рекомбинантные вирусы

Классические анализы вирусных бляшек продолжают оставаться основой исследований вирусов, несмотря на то, что они, как известно, отнимают много времени и представляют собой значительное узкое место для получения результатов экспериментов. Появились более быстрые методы непрямого количественного определения вирусов, включая количественную полимеразную цепную реакцию (кПЦР), ИФА и проточную цитометрию^1-4. Последние инновации, такие как счетчик вирусов Virocyt, позволяют напрямую подсчитывать вирусы с помощью передовой технологии сортировки в потоке и комбинации белков и красителей ДНК/РНК⁵. Несмотря на то, что все эти методы, несомненно, ускорили темпы исследования вирусов, каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. Например, количественная ПЦР может позволить количественно оценить конкретную последовательность вирусного генома, но не может эффективно отличать инфекционные вирусы от дефектных вирионов⁶. ИФА могут быть очень специфичными, однако требуют подходящих антител против желаемого вирусного белка-мишени и могут быть очень дорогими. Несмотря на то, что технология проточной цитометрии имеет множество преимуществ и значительно улучшена, пропускная способность и доступность узкоспециализированного оборудования, тем не менее, остаются препятствием. Важно отметить, что все эти методы не идеально подходят для высокопроизводительного скрининга, для которого простота и время, необходимые для этапа количественной оценки вируса, имеют решающее значение.

Здесь мы описываем высокопроизводительный и легко автоматизируемый метод титрования вирусов, экспрессирующих трансген люциферазы Firefly (Fluc). Этот метод генерирует приближенные титры вируса в тестовом образце на основе считывания сигнала люминесценции с помощью параллельного использования стандартной кривой известных количеств вируса. Образцы, содержащие неизвестное количество вируса, экспрессирующего люциферазу, переносят на разрешающую клеточную линию «бляшек» параллельно стандартной кривой разведения вируса, и вирус-ассоциированная люминесценция считывается после нескольких часов инкубации. Это позволяет получать быстрые, количественные данные, часто в тот же день, в отличие от классических протоколов анализа бляшек, которые обычно требуют нескольких дней инкубации для ручного подсчета видимых бляшек^7-9.

Протокол описывает этапы нашего метода титрования с использованием онколитического вируса везикулярного стоматита, кодирующего трансген Fluc (VSV∆51-Fluc) в качестве примера, и предоставляет обзор 1. Подготовка образцов 2. Покрытие разрешающей клеточной линии для титрования вирусов с помощью автоматизированного дозатора 3. Подготовка вирусной стандартной кривой 4. Перенос супернатантов образца на разрешающую клеточную линию с помощью 96-луночного ручного пипеттора 5. Оценка цитотоксичности образца с помощью реагента на жизнеспособность клеток 6. Приготовление люциферинового субстрата 7. Чтение биолюминесценции и 8. Анализ данных.

1 Подготовка образцов

1. Получение образцов, содержащих люциферазы, экспрессирующих вирус (в данном VSVΔ51-Fluc в качестве примера) для титрования и передачи в 96-луночных планшетах. С другой стороны, выполнение инфекции в 96-луночных планшетах для культуры ткани и использования супернатантов непосредственно.
2. Оставьте два столбца необработанные для включения стандартных кривых. Для экспериментов сделано непосредственно на 96-луночных планшетах, титр в конце эксперимента (40 ч после инфицирования) или хранить при температуре -80 ° С и титр на более позднем этапе.

2 Получение разрешительных клеток для титрования вируса

1. 24 ч перед титрованием, приготовить суспензию Vero клеток при концентрации 2,5 × 10 ⁵ клеток / мл в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 30 мМ HEPES и 1% пенициллина / стрептомицин. ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, этот протокол использует клетки Веро, любой подходящий разрешительный клеточной линией для VSV инфекции могла бе используется.
2. Семенной 2,5 × 10 ⁴ клеток (100 мкл) в 96-луночных белого твердого вещества плоскодонных планшетах с использованием микропланшет-дозатор.
   1. Подготовьте 12 мл клеточной суспензии на чашку плюс 5 мл для грунтования.
   2. Чистый Диспенсер для микропланшет кассеты с помощью промывки трубки 50 мл стерильной воды.
   3. Заполните Диспенсер для микропланшет линии с клеточной суспензии и пусть 5 мл клеточной суспензии течь через.
   4. Выбор программы, которые будут Распределить 100 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета белого стенками. Разливают, и в случае необходимости повторить для дополнительных пластин. Кроме семян несколько скважин в 96-луночный прозрачной плоской нижней плите, если непрозрачные белые-нижней стенками плиты используются для проверки здоровья клеток и плотности.
   5. По завершении операции промойте клетки обратно в оригинальной упаковке. Очистить кассету, выполнив 50 мл 70% этанола с последующим добавлением 50 мл теплой стерильной воды через трубопровод.
   6. Убедитесь кассеты и труб апpropriately чистить между использованием.
3. Инкубируйте клетки в течение 24 ч при 37 ° С в увлажненной 5% СО ₂ инкубатора.

3 Получение вирусных калибровочной кривой

1. Приготовьте стандартную кривую VSVΔ51-Fluc в бессывороточной DMEM таким образом, что конечная концентрация бляшкообразующих единиц (БОЕ) на мл, после передачи на Vero клетках следующим образом: 10 ⁸ БОЕ / мл, 10 ⁷ PFU / мл, 10 ⁶ БОЕ / мл, 10 ⁵ БОЕ / мл, 10 ⁴ БОЕ / мл, 10 ³ БОЕ / мл, 10 ² БОЕ / мл, и 10 ¹ БОЕ / мл. Подготовка 50 мкл каждой концентрации на тарелку клетках Веро плюс дополнительные 10%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Титр вируса складе люциферазы нужно будет оцениваться в классическом пути ¹⁰ в целях получения стандартной кривой, которая позволит для абсолютного количественного. В противном случае относительное количественное может быть достигнуто без точной информации титра произвольно установки титра вируса на основена стадиях растворения. Например, первый разбавление стандартной кривой может быть установлено равным 10 ⁸ вирусных частей и следующей 1/10 разбавления до 10 ⁷ и так далее. В этом контексте следует выразить значения, сгиба-изменения по сравнению с заранее определенной выборке абсолютного количественного будет не очень точной.

4 Передача образцов супернатантах на разрешительных клеток

1. Проверка Vero клетки высевали в четко нижней 96-луночного планшета под световым микроскопом, чтобы подтвердить, что монослои, по крайней мере, 95% сливной.
2. Трансфер 25 мкл образца супернатанта на клетках Веро, посеянных в белых стенками пластин. Не передать супернатантами в 2 колонки, предназначенные для стандартных кривых. Примечание: Это может быть сделано одновременно для всех скважин на одной пластине с помощью обработчика жидкости 96-канала.
3. Использование 8 или 12-канального пипеттора многоканальный, добавить 25 мкл из каждого разведения стандартной кривой, полученной на стадии 3 в клетках Vero вв 2 назначенные столбцы.
4. Центрифуга пластины в течение 5 мин при 430 х г при комнатной температуре.
5. Выдержите в течение 5 часов при 37 ° С в увлажненной 5% CO ₂ инкубаторе.

5 Оценка Жизнеспособность клеток

1. Примечание: При запуске из супернатантов, полученных от инфекции экспериментов, проведенных в прозрачных 96-луночных планшетах, жизнеспособность образец может быть оценена до количественной с индикаторным красителем жизнеспособности клеток, таких как резазурин.
2. Добавить резазурина в количестве, равном 10% от объема в каждую лунку 96-луночного планшета образцов, содержащих вирус и клетки. Включите клеток только контролирует, а также средств массовой информации только контроля, чтобы определить значения для 100% и 0% жизнеспособность соответственно.
3. После 2-4 ч (время инкубации будет варьироваться в зависимости от типа клеток и от концентрации коммерчески доступны, либо восстановленного порошка красителя), считывать и записывать сигнал с использованием флуоресцентного планшет-ридера (530-560 возбуждения, 590) излучения. Viabili Сообщить клетокти для образца по формуле Относительная метаболической активности = ((Опытный образец сигнала - отрицательный контроль сигнала) / (сотовый только сигнал управления - отрицательный сигнал управления)) х 100%

6 Подготовка субстрата люциферин

1. За 30 мин до конца 5 ч инкубации подготовить люциферин, чтобы получить раствор 2 мг / мл в стерильном фосфатно-буферном солевом растворе (PBS). Подготовьте 2,5 мл на чашку плюс дополнительные 2 мл. Защитите решение от света. Примечание: люциферин могут быть также получены ранее в день и хранили при 4 ° С до использования.

7 Чтение Биолюминесценция

1. После 5 ч инкубации, добавление 25 мкл люциферин в каждую лунку в клетках Веро белых твердых пластин. Добавить люциферин вручную или с помощью автоматизированной дозатора, встроенного в фотометр. ПРИМЕЧАНИЕ: Использование инструмента только одной и конечной точки читает может потребовать включения люциферазы совместимый лизиса BUFFER перед добавлением субстрата люциферин, чтобы улучшить консистенцию.
2. Читайте тарелки со следующими параметрами:
   1. Встряхнуть в течение 5 сек.
   2. Подождите 30 сек.
   3. Читайте свечение на соответствующем стоимости основных чувствительность / экспозиции. Если опция доступна на инструменте, используйте многоточечный читает (например, 3 х 3 матрицы) для повышения точности.
3. Запись и сохранить количественно интенсивности биолюминесценции.
4. Если автоматизированная дозатор был использован для добавления люциферина очистить люциферин и залейте линий с теплой стерильной водой.

Анализ 8. данных

1. Для получения точных результатов, решить нелинейной регрессии для генерации уравнение Hill от стандартных кривых. Применить это уравнение к оттитрованы образцов для расчета вирусные экспрессионные единицы. Некоторые вирусы или ситуации может привести к стандартной кривой с линейной зависимостью; В этом случае решение для линейного уравнения.

Краткая информация о рабочем процессе, описывающей метод высокой пропускной показано на рисунке 1. Рисунок 2 показывает результаты типичного стандартной кривой ofVSVΔ51-Fluc. Четыре-параметр нелинейный регрессионный анализ генерируется сюжет Hill, из которого неизвестно вход бое (оценка титра вируса) может быть интерполированную. Такие ожидаемые титры называют вирусные экспрессионные единицы (ВЭУ). Фиг.3А показывает VEUs и титры получены путем выполнения стандартного бляшек с одних и тех же образцов 10. Образцы возник из эксперимента, где различные химические вещества, используемого для повышения репликации и распространения VSVΔ51-Fluc в 786-0 клеток. VEUs интерполяцией по калибровочной кривой необходимо умножить на коэффициент, который основан на разведении образца супернатантами передаются на клетках Веро (в данном случае, фактор разбавления 5). Линейная корреляция между титрами и ВЭУ показана на рисунке 3B 2 из 0,8083 и р балле Пирсона 0,899 (р <0,0001). На рисунке 4, типичные данные цитотоксичности клеток, полученных из метаболического теста показан на 786-0 клетках, обработанных химикатами до заражения VSVΔ51-Fluc. Наконец, 5 показаны типичные стандартные кривые, полученные с различных вирусов (простого герпеса (HSV), вирус коровьей оспы, и аденоассоциированные Вирус (AAV), все выражения люциферазы светляков) и описывает время инкубации и циклов замораживания-оттаивания, по мере необходимости.

Рис.1 Технологическая схема высокой пропускной вируса титрованием и цитотоксичности с использованием VSV Δ 51-Fluc. (A) Seed 2,5 × 10 4 Vero клеток на лунку (100 мкл) и инкубировали при 37 ° С. (В) 24час спустя передача 25 мкл стандартной кривой на клетках Веро (2 колонки на чашку). (C) Передача 25 мкл образцов для оттитрованы на оставшихся клетках Веро. Центрифуга пластины и инкубировать при температуре 37 ° С. (D) в количестве, равном 10% от объема в скважине, добавить резазурин реагента к пластине, содержащей оригинальные образцы. Планшеты инкубируют при 37 ° С. (E) После 3 ч, чтения и записи флуоресценции и оценки цитотоксичности. (F) После 5 часов, добавляют 25 мкл 2 мг / мл раствора люциферин в каждую лунку клетках Веро. Читайте свечение и рассчитать Вирусные Единицы экспрессии.

Рисунок 2 Ожидаемый стандартную кривую VSV Δ 51-Fluc. Люциферазы выражение было меняasured 5 часов передачу сообщение супернатантную в пяти различных точках в скважине с помощью фотометра и была выражена биолюминесценции в средних относительных световых единиц (RLU). Средний RLU был заговор против известного вход бое / мл решить нелинейной регрессии и генерировать уравнения Хилла. Средняя из двух кривых повторных и стандартных баров ошибках показаны (R 2 = 0,9993).

Рисунок 3 Сравнение стандартных бляшек титров с результатами, полученными методом высокой пропускной способностью. (А) Вирусные титры в БОЕ / мл получен стандартным методом бляшек на клетках Веро сравнивали с рассчитанными вирусных титров (ВЭУ / мл) из одних и тех же образцов титровали с использованием высокой пропускной люциферазы. (B) линейная зависимость между VEU / мл и титр получены через стандартный рЛак для анализа. Линейный кривая регрессии и коэффициент детерминации (R 2) показаны.

Рисунок 4 Пример жизнеспособности. Пример жизнеспособность до передачи супернатант на Vero клетках была определена путем оценки клеточную метаболическую активность с использованием коммерчески доступного резазурин решение. Сырье значения флуоресценции были нормализованы к тому, что из необработанных, неинфицированных скважин.

Рисунок 5 Ожидаемое стандартные кривые с ВПГ, коровью и AAV вирусов. Люциферазы выражение измеряли при пяти различных точках в скважине с помощью фотометра и была выражена биолюминесценции в средних отнотивные световые единицы (RLU). (А) стандартная кривая ВПГ был добавлен на клетках Веро покрытием 24 ч раньше, при плотности 2,5 × 10 4 клеток на лунку (100 мкл) и измерения люциферазы был сделан 17 ч после supernantant передачи (R2 = 0,9489, п = 1). Уравнение Хилла был создан на основе решения нелинейной регрессии. Стандартная кривая (B) Vaccinia был добавлен на клетках Веро покрытием 24 часа раньше плотность 2,5 х 10 4 клеток на лунку (100 мкл) и выдерживают в течение 2,5 ч при 37 ° С, после чего измерения были сделаны люциферазы (R 2 = 0,9892). Линейное уравнение было сгенерировано с помощью решения для линейной регрессии. (С) AAV стандартную кривую был добавлен на клетках карциномы человека легких (A549) покрытием 24 ч раньше, при плотности 2,5 × 10 4 клеток на лунку (100 мкл) и измерения люциферазы было сделано 24 ч после инфицирования. Уравнение Хилла был создан на основе решения нелинейной регрессии. Средняяиз пяти кривые повторных и стандартные планки погрешностей приведены (R 2 = 0,9926).

Авторам нечего раскрывать.