In Vitro Ферментативный анализ для измерения транскрипции ингибирование галлия (III) и H ₃ 5,10,15-трис (пентафторфенил) corroles

Химиотерапия часто включает в себя широкий спектр средств цитостатики с нежелательными побочными эффектами и ограниченный характер адресности, но с большим пониманием биологии рака, есть постоянно растущий спрос на противораковых агентов с высшим рака таргетирования эффективности и меньшим количеством побочных эффектов. ¹ Раковые клетки человека часто становятся зависит от одного или активированного онкогена сверхэкспрессируется за выживание. ² Таким образом, многие противораковые препараты оценивали по их способности ингибировать транскрипцию РНК. Процедуры, которые блокируют экспрессию этих трансформирующих генов являются эффективными в устранении раковых клеток и привести к гибели клеток. ³ Трансформированные клетки более чувствительны к сбоям в транскрипции РНК, чем являются соответствующие нормальные клетки. ⁴ Противораковые лекарственные средства, которые ингибируют транскрипцию, как ожидается, что они избирательно ингибируют выражение онкогенов, которые необходимы для раковых клеток, чтобы выжить. ⁵ Следовательно, транскрипции РНК яnhibition является способом выявления потенциальных кандидатов противоопухолевого препарата и узнать больше об их механизмом действия. Этот протокол показывает, что Ga (tpfc) ингибирует РНК-транскрипцию на том же порядке, что и химиотерапевтических препаратов Актиномицин D и triptolide; Аналогичные сравнения могут быть сделаны с помощью этого протокола с другими кандидатами противоопухолевого препарата. Актиномицин D является РНК транскрипции ингибитора обычно используется для лечения гестационного трофобластическую железы, рак яичка, опухоль Вильмса, rhabdomyosacoma и Юинга саркома ^6. Актиномицин D был использован в лечении рака в течение почти пятидесяти лет, поскольку он был впервые одобрен в FDA в 1964.Triptolide является селективным ингибитором транскрипции, который был исследован в лабораторных и в различных животных моделях с опухолями на 30 лет. ⁷

Амфифильный макроциклический характер corroles придает значительные преимущества по сравнению с другими классами наркотиков таких, как небольшие молекулы или биологическихс. ^8-14 макроциклического символов позволяет клеточной проницаемости, который больше, чем ожидалось для таких больших молекул, и они являются достаточно большими, чтобы взаимодействовать с макромолекул поверхностей, таких как белки. ⁸ Corroles, как известно, образуют жесткие нековалентных комплексов с биомолекул и лекарственных средств. ¹⁰ В дополнение к присущей цитотоксичности Коррол рамках, мы показали, что сульфированного Коррол действует как молекулой-носителем для химиотерапевтических агентов, в частности, ДНК-интеркалирующую антрациклина доксорубицина наркотиков. Когда сульфированный Коррол было больных с доксорубицином, 3-кратное повышение в IC ₅₀ доксорубицин наблюдалось DU-145 клеток. ⁹ Коррол база устойчива и имеет присущие абсорбции и флуоресценции свойства, которые, когда функционализированный, подвергаются уникальные абсорбции сдвиги , которые могут быть использованы для определения характеристик. ¹⁰ Функционализация эшафот по своей природе не затрагиваемт фотофизические свойства Коррол, ^9-15, но, как видно с сульфонированной Коррол, выборочно модифицировать рамки Коррол может существенно изменить его биологические свойства. ¹⁶ Мы ранее оценивали шесть metallocorroles против семи линий раковых клеток человека. Результаты показывают, что токсичность по отношению к раковым клеткам человека зависит от конкретного иона металла, а также замещение функциональных групп. Например, сульфированные галлия corroles наблюдается высокий клеточное поглощение и проникли выборочно в ядре головного мозга раковых клеток метастатического простаты (DU-145); то же самое Коррол, хотя это не проникает в ядра других клеточных линий, показывает большую цитотоксичность для груди (MDA-MB-231), меланома (SK-MEL-28) и яичников (OVCAR-3) раковые клетки, чем на рак предстательной железы. ⁹

Первоначальные анализы на основе клеток показывают, что эти соединения перспективными в качестве противораковых терапевтических средств, которые существу Furthэ расследование механизмом действия. Ингибирование транскрипции наблюдается при некоторых металлоорганических комплексов ^17-27, и мы стремились изучить этот процесс в качестве возможного механизма цитотоксического поведения Коррол семьи. Это транскрипция анализ обеспечивает простой, недорогой и легкое метод оценки транскрипции ингибирование, что приведет к более подробной информации о последствиях этих молекул в живых клетках.

Здесь транскрипция ингибирование галлия (III) 5,10,15- (трис) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) и его свободное основание аналог 5,10,15- (трис) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (Рисунок 1) тестируются. В отличие от некоторых комплексов переходных металлов, галлия (III), является окислительно-восстановительный неактивным и, следовательно, непосредственно не участвует в процессе окислительно-восстановительного окислительно-восстановительных основе метаболических путей. ²⁸ Несмотря на это, галлия (III) не обладают цитотоксическими свойствами и была исследована в терапевтических целях, Галлия является вторым наиболее перспективным металлом для противораковых терапевтических после платины и претерпела множество исследований и расследований; нитрата и хлорида галлия соли были оценены в клинических испытаниях против гепатомы, лимфомы, рака мочевого пузыря, и других заболеваний. ^29-34 галлия (III), поэтому идеально подходит для противораковых Коррол исследований. Исходные данные показывают, Ga (tpfc) и tpfc имеют низкую GI _50, концентрация лекарственного средства, необходимую для ингибирования 50% максимальной пролиферации клеток, с различных линий раковых клеток (рисунок 2); Это подтверждает обоснованность дальнейших экспериментов на этих двух соединений, чтобы определить их тормозящее свойства. Мы сравниваем эти соединения с общей противоопухолевых препаратов Актиномицин D и triptolide. Актиномицин D встраивается ДНК, ингибирует РНК удлинение и индуцирует апоптоз в определенной клеточной линии на пикомолярных концентрации ^6,35-37 Triptolide показал ингибировать рост опухоли.; он связывается с человеческим XPB / ERCC3, субъединицы Oфактором транскрипции F TFIIH, что приводит к ингибированию РНК-полимеразы II активности. ^6-7,38-40

В то время как это широко известно, что corroles обладают цитотоксическими свойствами, существует мало информации о различных механизмах, связанных с функционализации. Коррол ингибирование транскрипции РНК бы предложить более полное представление об их взаимодействии с биомакромолекул. Другие комплексы, которые известны для связывания с ДНК, такие как dirhodium (II, II) комплексы, хром (III), комплексы рутени (II), polypyridyl комплексы, родий (III), комплексы и различные другие, были подвергнуты транскрипции РНК анализах, ^{18- 27} в результате более глубокого понимания их взаимодействия с биомакромолекул. Это легкое и широко доступны эксперимент также хорошо первоначального испытания для оценки цитотоксичности свойства данной молекулы и определить, действительно ли он заслуживает дальнейшего биологического тестирования. Анализ транскрипции РНК также позволяет в течение многих модификаций, таких как varyinг количество соединения или ферментов, используемых; Изменяя инкубационный период, время реакции и точек отбора проб времени; и изменения длины ДНК шаблона и последовательность, среди других переменных, представляющих интерес, таким образом, потенциально обеспечивая большое количество данных. Это транскрипция анализ также легко доступны также доступных комплектов со всеми необходимыми компонентами реакции обеспечены, хотя компоненты могут быть куплены и подбирается индивидуально. В этих экспериментах мы используем коммерчески доступного набора, как известно, имеют высокую урожайность. ⁴¹

Для оценки ингибирования транскрипции, мы используем два метода: электрофорез в агарозном геле и УФ-Vis спектроскопии. Электрофорез в агарозном геле является простым и эффективным способом для разделения, идентификации и очистки 0,5- до 25-кб ДНК и РНК фрагментов. ⁴² УФ-видимой спектроскопии может быть использован для определения концентрации и чистоты РНК. ⁴³

ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с РНК поддерживать чистоту рабочей среды, чтобы избежать загрязнения от ДНКазы и РНКазы ферментов, которые разрушают ДНК и РНК. Убедитесь, что наконечники и трубы ДНКазы и РНКазы. Это также полезно протереть лаборатории поверхностей и оборудования, таких как пипетки, держатели труб и т.д. с раствором обеззараживания.

1. транскрипции РНК с Коррол обращения

1. Подготовка Коррол и ингибитора соединений в 0,01: 1 мольном соотношении [комплекс]: [ДНК].
   ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем случае, соотношение было 4,3 фмоль комплекс: 0,43 пмоль ДНК, где ДНК-матрицы использовали Апет-28с вектор с геном ЛИГА из E. палочка под контролем промотора Т7. Другое ДНК с Т7 промотора, также действительны кандидаты для запуска транскрипции анализа.
   1. Растворить Актиномицин D, triptolide, tpfc и Ga (tpfc) в диметилсульфоксиде (ДМСО) в чистых, отдельных контейнерах. Получение конечной концентрации 0,01: 1 мольном соотношении [Complex]: [ДНК] с помощью серийных разведений с нуклеазы без воды.
      1. Растворите 1 мг актиномицин D в 1,8 мл ДМСО. Алиготе 10 мкл в отдельную емкость и доводят до 1 мл с нуклеазы без воды, чтобы создать разбавление 1/100. Алиготе 1 мкл разведения в отдельном контейнере и разбавляют до 1 мл с нуклеазы без воды, чтобы создать разведении 1/1000.
         ПРИМЕЧАНИЕ: концентрация конечного раствора актиномицина D 4,3 фмоль.
      2. Растворите 1 мг triptolide в 0,64 мл ДМСО. Алиготе 1 мкл в отдельную емкость и доводят до 1 мл с нуклеазы без воды, чтобы создать разведении 1/1000. Алиготе 1 мкл разведения в отдельном контейнере и разбавляют до 1 мл с нуклеазы без воды, чтобы создать второй 1/1000 разведение.
         ПРИМЕЧАНИЕ: концентрация окончательного решения triptolide 4,3 фмоль.
      3. Растворите 1 мг tpfc в 2,9 мл ДМСО. Аликвоты 10 мкл в отдельную емкость и разбавьте до 1 мл нуклеазы без воды, чтобы создать 1/100 Dilution. Алиготе 1 мкл разведения в отдельном контейнере и разбавляют до 1 мл с нуклеазы без воды, чтобы создать разведении 1/1000.
         ПРИМЕЧАНИЕ: концентрация окончательного решения tpfc 4,3 фмоль.
      4. Растворите 1 мг Ga (tpfc) в 2,6 мл ДМСО. Алиготе 10 мкл в отдельную емкость и доводят до 1 мл с нуклеазы без воды, чтобы создать разбавление 1/100. Алиготе 1 мкл разведения в отдельном контейнере и разбавляют до 1 мл с нуклеазы без воды, чтобы создать разведении 1/1000.
         ПРИМЕЧАНИЕ: концентрация окончательного решения Ga (tpfc) составляет 4,3 фмоль.
         Примечание: эти corroles и ингибиторы не растворимы в воде и должны быть предварительно растворенного в ДМСО. Небольшие количества ДМСО (менее 1%) не вызывают цитотоксичность в клетках (неопубликованные данные).
2. До начала реакции транскрипции, подготовить необходимые реагенты по отдельности или купить их с коммерческой поставщика.
   1. Оттепель на льду все заморозилиN реагенты (см таблице 1 приведен список замороженных реагентов).
   2. Разрешить реакционного буфера 10х и 4 рибонуклеотид (АТФ, ГТФ, CTP и UTP) решения время смешивать, пока они не будут полностью растворяется в растворе.
   3. Кратко центрифуги все реагенты, чтобы предотвратить потерю материала на оконечности трубки. После оттаивания, хранить рибонуклеотиды на льду при сохранении реакционного буфера 10х при комнатной температуре.
   4. Комбинат реагентов для реакции транскрипции при комнатной температуре (табл 2 для списка реагентов).
      Примечание: спермидин в 10x реакционного буфера может совместного осадка ДНК-матрицы, если реакцию собран на льду, а не при комнатной температуре.
   5. Тщательно перемешать, щелкая трубки или пипетки смесь вверх и вниз, осторожно. После смешивания, центрифуги кратко собрать реакционной смеси в нижней части трубки.
   6. Инкубируйте реакционной смеси при 37 ° С в течение в общей сложности 2-4 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимые времена реакции будет менятьсяс размером шаблона ДНК и последовательности. Этот шаг может потребовать оптимизации для конкретных последовательностей. Более короткие шаблоны могут потребовать более длительного времени реакции для высоким выходом из общей РНК.
   7. Удалить 4 мкл аликвоты из каждой реакции после каждого часа и хранят при -20 ° С. Изменить это необходимо для желаемых временных точках.

2. РНК Спин колонка

1. После реакции транскрипции, очистить РНК с использованием микроцентрифужных-совместимый хроматографических колонок.
   Примечание:. Использование РНК спиновых столбцов для очистки РНК с более чем 20 оснований приводит к восстановлению более 80% ⁴⁴
   Примечание: После колоночной хроматографии является общим и удобный способ для очистки РНК. Другие способы очистки также существовать, например, хлорида лития осадков, фенол: хлороформ экстракции, изопропанол осадков, а также других коммерчески доступных наборов.
   1. Равномерно ресуспендируйте матрицу Сефадекса в буфере столбца, по энергично переворачиваяколонка три или более раз. Сделайте это, щелкая столбец резко.
   2. Удалить верхнюю крышку с колонки. Там будут какие-то остаточную матрицу сефадексом в крышке; если крышка заполнена матрицы, заменить крышку на колонку и повторить предыдущий шаг, пока большинство матрицы не в колонке.
   3. Обрывать Нижний конец колонны.
      Примечание: Некоторые жидкости из колонны.
   4. Пакет колонку.
      1. Столбец Место в стерильной (РНКазы и ДНКазы) 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
      2. Центрифуга трубки в настольной центрифуге при 1000 мкг в течение 1 мин.
   5. Отменить 1,5 трубки микроцентрифужных мл буфера с элюированного из колонки.
   6. Сразу же место колонку в новой стерильной 1,5 мл микроцентрифужных трубки и пипетки образца в центр кровати колонки. Используйте 20-50 мкл образца, чтобы избежать перегрузки колонки.
   7. Центрифуга трубки в настольной центрифуге при 1000 мкгв течение 1 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: элюента очищенный образец РНК.

3. Электрофорез в агарозном геле (1% агарозном геле) ⁴²

Примечание: этидия бромида флуоресцирует при связывании с ДНК и РНК, поэтому эти биомолекулы могут быть визуализированы с помощью УФ-света путем инкубации их с 0,5 мкг мл этидий бромида раствор /.

1. Подготовка 1,000x исходного раствора этидий бромида (0,5 мг / мл) растворением 5 мг этидий бромида в 10 мл воды.
2. Подготовка Трис ацетата ЭДТА (TAE) Летние буфер для электрофореза в геле. Для того, чтобы буфер 50x ТАЕ объединить 2,0 М Трис-ацетат 0,05 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и доведения рН до 8,5.
3. Подготовка 1% (вес / объем) агарозном геле путем растворения 10 г сверхчистого агарозы в 1 л 1x TAE буфер и плавление агарозы с обычной микроволновой печи. После охлаждения до 50 ° С, добавить 1 мл 1,000x этидийбромид в 1% агарозном геле Солуции, смешать осторожно закрученной или путем обращения в закрытом контейнере, а затем залить раствора агарозы в платформу гель-литье и позволяют гель затвердеть при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: бромистый этидий является мутагенным и потенциальным канцерогеном. Надевайте перчатки и тщательно обрабатывать решений. Для надлежащими рабочими процедурами этилиденбромида, пожалуйста, см: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667 .
4. После гель затвердевает, устанавливайте гель в электрофореза бак. Добавьте достаточно буфера ТАЕ, чтобы покрыть гелем до лунки не погружены. Убедитесь, что уровень буфера ТАЕ составляет приблизительно 1 мм над уровнем геля. Удалить гель расческой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление гребень после скважины погружен предотвращает воздушные карманы из оказаться в ловушке в скважинах.
5. Подготовка образцов РНК. Комбинат 1 мкл каждого очищенного образца аликвоты с 1 мкл гель загрузки буфера (или с 1 мкл 10х буфера для загрузки и dilutред до 10 мкл с нуклеазы без воды) и тщательно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз с помощью микропипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 10x Буфер содержит 20% Ficoll 400, 0,1 М Na ₂ ЭДТА, рН 8,0, 1,0% SDS, 0,25% бромфенола синий. 0,25% ксиленцианол также могут быть добавлены к загрузочным буфером, как он работает ~ 50% быстрее, чем бромфенола синего и может быть полезным для мониторинга очень длинные пробеги. ⁴²
6. Загрузка гель с каждого образца осторожно пипеткой раствора в нижней части каждой лунки. Будьте осторожны, не оставляйте воздушных пузырей или микшировать между скважинами.
   Примечание: РНК лестница также может быть использован для определения размера транскрипта.
7. Присоединить провода так, что ДНК будет проникать в гель в направлении положительного свинца. Установка напряжение до желаемого уровня, обычно от 1 до 10 В / см геля. Запустите гель для однако долго достаточно для значительного разделения между фрагментами РНК, используя миграции красителей для мониторинга прогресса разделения.
   NПРИМЕЧАНИЕ: 23 см х 25 см геля на 250 V займет около 1 ч, в то время как 8 см х 8 см гель на 150 V займет около 20 мин. Небольшие фрагменты РНК-лучшее разрешение, когда работать на более высоких напряжениях.
8. Выключите электропитание, когда краситель из загрузочного буфера перекочевал расстояние адекватными для разделения между фрагментами РНК.
9. Изображение РНК под действием УФ-света, как бромид этидия высветится.
10. Сфотографируйте изображения и сравнить интенсивность флуоресценции очищенного РНК из каждого состояния.

4. количественного определения РНК с помощью UV-VIS-спектроскопии

1. Поместите 2 мкл H ₂ O на NanoDrop 2000 или аналогичную машину, и измерьте Blank.
2. Затем поместите 2 мкл каждого образца РНК, следующие очистки, на спектрофотометре и измерения УФ-Вид из диапазоне длин волн от 200 нм до 800 нм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ₊₂₆₀ чтение 1,0 эквивалентно около 40 мкг / мл РНК,и чистый РНК имеет _260/280 соотношение 2,1. ⁴⁵
3. В случае, когда поглощение выше 1 OD, разбавленных образцов в нуклеазы без воды, чтобы получить ОД менее 1.
4. Используйте графическое программное обеспечение для построения различных образцов и сравнить ОП при 260 нм.

Транскрипции РНК Качественно оценены электрофореза в агарозном геле

Электрофорез в агарозном геле используется для изображения в транскрипции РНК. Бромистый этидий флуоресцирует при связывании (λ ет = 605 нм, λ экс = 210 нм, 285 нм) 46, позволяющий визуализации РНК. Темные полосы в геле соответствуют более высокой концентрации РНК. Если Актиномицин D, triptolide, или любой Коррол комплекс ингибирует транскрипцию РНК, производство РНК уменьшается, и группа будет светлее. Используя эту концепцию, относительное ингибирование может быть оценена.

Фиг.3 показывает окрашенные бромистым этидием агарозный гель (1%) реакций транскрипции РНК предварительно обрабатывают не комплекса, актиномицин D, triptolide, tpfc или Ga (tpfc) в комплексной []: [шаблона оснований ДНК] соотношении 0,01 : 1. Актиномицин D и triptolide показывают четкое снижение по сравнению с РНК, что в контроле, как и ожидалось изэти давно изучены ингибиторы. Ga (tpfc) группа также имеет очень низкий уровень РНК, в то время как группа tpfc показывает практически нет торможения и имеет ту же относительную интенсивность в качестве контроля.

Транскрипции РНК количественно UV-VIS-спектроскопии

Измерения UV-VIS были приняты для каждого образца после прохождения транскрипции РНК в течение 4 ч и очищают с РНК спин колоночной хроматографией. Спектры длин волн 220 нм до 350 нм, показаны на рисунке 4, с λ макс происходит при 260 нм, что соответствует абсорбции РНК, а коэффициент экстинкции 0,025 (мкг / мл) -1 см -1. Поглощение при 260 нм и 280 нм, приведены в таблице 3. 260 чтение 1,0 эквивалентно примерно 40 мкг / мл РНК, РНК и чистый имеет 260/280 соотношение 2,1, что позволяет количественных расчетов РНК производится в течение трансРеакционную cription и оценка чистоты РНК после использования столбец РНК отжима. 44 Три из четырех, обработанных ингибитором реакций транскрипции РНК получали меньше, чем в контроле, при Ga (tpfc) -обработанной ДНК транскрипции только 0,07 раз больше РНК в необработанной ДНК. tpfc обработке ДНК не показал никакого очевидного торможения. Все образцы имеют 260/280 соотношение примерно 2,2, что указывает на относительно чистых образцов. Очистка спиновых столбцов РНК удаляет короткие РНК нити длиной 20 или меньше нуклеотидов. Остаточный ДНК или нити длиной более 20 нуклеотидов может присутствовать в том, что считается очищенные образцы. Эти незначительные примеси приведет к 260 / A 280 отношение несколько большей, чем 2,1.

Рисунок 1. Молекулярные структуры галлия (III) 5,10,15- (трис) pentafluorophenylcorrole (Ga (TPFC)) и свободное основание аналог 5,10,15- (трис) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2. Кривые цитотоксичности и GI 50 значения corroles в простате (DU-145) (серый), молочной железы (MDA-MB-231) (синий), кожи (SK-MEL-28) (оранжевый), и яичников (OVCAR -3) (зеленый) линии раковых клеток. Клетки инкубировали с (А) (Ga tpfc) и (б) tpfc, с последующим определением жизнеспособности с помощью MTS основе колориметрического анализа жизнеспособности клеток в соответствии с протоколом производителя. Пожалуйста, нажмите здесь для просмотра большего размера этофигура.

Рисунок 3. этидий бромид окрашенных агарозном геле (1%) реакций транскрипции после 4 ч инкубации. Дорожка 1 представляет собой 1000 п.н. ДНК лестницы в качестве стандарта. Дорожки 2-6 показывают РНК транскрибируется с 0,43 пмоль ДНК и обрабатывают 4,3 фмоль каждой ингибитора ([Комплексные]: [шаблон базы ДНК] отношение 0,01): контроль (дорожка 2), Актиномицин D (дорожка 3), triptolide (дорожка 4), tpfc (дорожка 5), и Ga (tpfc) (дорожка 6).

Рисунок 4. УФ-Вид спектр 1:. 200 разбавления транскрипции РНК в после 4 ч инкубации ДНК-матрицы в реакции транскрипции обрабатывали не комплекса, или актиномицином D, triptolide, tpfc или Ga (tpfc) в [комплекс]: [шаблон оснований ДНК] отношение 0,01: 1, Концентрация РНК измеряли по оптической плотности при 260 нм.

Таблица 1. Список замороженных реагентов.

Таблица 2. Список реагентов для реакции транскрипции.

Таблица 3. Концентрация и чистота транскрипции РНК после 4 ч измерено УФ-видимой спектроскопии. Коэффициент экстинкции одноцепочечной РНК 0,025 (мкг / мл) -1 см -1, 260 считывания 1,0 эквивалентно примерно 40 мкг / мл РНК, РНК и чист имеет 260/280 соотношение 2,1. 45

Авторам нечего раскрывать.