В этом отчете описывается метод измерения активности личинок дрозофилы с помощью TriKinetics Drosophila Activity Monitor. Устройство использует инфракрасные лучи для обнаружения движений до 16 отдельных животных. Данные могут быть проанализированы для представления параметров движения, включая скорость и положение животных в пробирных камерах.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Измерение личинок деятельности в
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Личинки дрозофилы используются во многих поведенческих исследованиях, но простое устройство для измерения основных параметров активности личинок не было доступно. Этот протокол перепрофилирует инструмент, часто используемый для измерения активности взрослых особей, монитор активности дрозофилы TriKinetics (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) для изучения активности личинок. Прибор может контролировать движения животных в 16 отдельных стеклянных пробирках диаметром 8 см, используя 17 инфракрасных лучей обнаружения на трубку. Программное обеспечение для регистрации автоматически сохраняет данные на компьютере, записывая такие параметры, как количество движений, время срабатывания датчиков и положение животных в трубах. Затем данные могут быть проанализированы для представления общей локомоции и/или предпочтения в положении, а также для других измерений. Все данные легко доступны и совместимы с базовым программным обеспечением для построения графиков и обработки данных. В этом протоколе будет обсуждаться, как использовать устройство, как работать с программным обеспечением и как провести анализ активности личинок от начала до конца.
Введение
Использование дрозофилы в качестве генетического инструмента изменило научные знания о биологических системах. Личинки дрозофил использовались в различных исследованиях, включая ноцицепцию1, развитие2 и в качестве модели для изучениягенов болезней человека3. Активность дрозофилы включает в себя ряд форм поведения, которые варьируются в различных условиях, включая температуру2,воздействие наркотиков 4 и среди различных генотипов. Тем не менее, несмотря на значительное использование личинки в качестве модельного организма, простого стандартизированного метода анализа активности личинок не существует. В настоящее время во многих исследованиях локомоции личинок используется сложное программное обеспечение для анализа видео5. Несмотря на свою мощь, сложность таких автоматизированных инструментов может отбить охоту у лабораторий, которые еще не оснащены для изучения локомоции, включать анализ информативных параметров активности в свои исследования. В других современных неавтоматизированных методах, таких как анализ сканирования по сетке, движение оценивается человеком-наблюдателем, что вводит возможность субъективности и ограничивает пропускную способность до одного животного за раз6-7. В аналогичном исследовании использовался 5-полосный ползающий анализ, который измерял время, необходимое личинкам для прохождения определенного линейногорасстояния. В таких неавтоматизированных анализах измеряется смещение, но при этом не учитывается нелинейное перемещение между начальной и конечной точками. Как обсуждается ниже, описанный здесь метод учитывает большую часть фактического движения личинок, является объективным, простым в эксплуатации и обеспечивает надежную пропускную способность.
Чтобы легко изучить поведение личинок без ущерба для точности, эффективности или стоимости, этот метод использует TriKinetics Drosophila Activity Monitor (DAM), устройство, часто используемое для изучения активности взрослых особей. Использование одного устройства для изучения активности взрослых особей и личинок является экономически эффективным и позволяет напрямую сравнивать движения животных на этих двух этапах жизни. Система, обладающая самым высоким уровнем разрешения производителя, использует 17 инфракрасных лучей обнаружения на пробирную трубку, которые регистрируют активность личинок при прерывании сенсорных лучей в пределах 16 отдельных пробирок. Затем система автоматически сохраняет записанную информацию на компьютере, делая ее доступной для работы с базовым программным обеспечением для построения графиков. Полученные данные представляют собой пучки, которые были прерваны отдельными личинками (которые могут быть преобразованы в скорость), движение при нахождении личинки в луче детектора и положение животных в пробирных камерах в течение периода регистрации (что позволяет рассчитать предпочтительное положение). Система эффективна и относительно проста в эксплуатации, а также обеспечивает высоковоспроизводимый анализ базовой активности в пределах досягаемости любой лаборатории, изучающей личинки дрозофилы.
Чтобы продемонстрировать мощь этого анализа, представлены данные, которые показывают его использование для проверки различий в активности, возникающих в результате изменения температуры окружающей среды, а также путем сравнения мутанта, ранее описанного как гипоактивный (IAV1)9, с широко анализируемым контролем (w1118).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка личинок
- Для анализа желаемого личинку для передвижения или позиции предпочтения, растут личинки в стандартных условиях в нужное возраста для анализа 10 с использованием стандартного пищу летать 11.
- Сделайте сетчатый фильтр по растяжения шелкография класса нейлоновая сетка на воронке. Закрепите сетку на шее воронки с резинкой. Поместите воронку в стакан.
- Для сбора личинок для анализа, совок шпатель-полно еды, содержащей личинки нагула из бутылки культуры и промыть РТ водопроводной воды на сетчатый фильтр, собирая отдельные личинки непосредственно из сетки с кистью 10.
2. Подготовка пробирок
- Для подготовки подключить Пробирки, тщательно кипятить 4% гель агара и вылить в чашку Петри на глубину 1,5 см. Это обеспечит пробку для каждой стороны трубки, когда животное прилагается. 4% раствор достаточно плотный, чтобы предотвратить личинок из рenetrating пробки.
- Убедитесь, что трубы чисты и до введения личинки. Если это не так, как это может блокировать движения от записывается.
- Для обеспечения личинки имеют достаточную влажность для движения, подготовить бутылку сжатия, содержащий небольшое количество горячей воды. Обратить бутылку, тщательно ориентировать выход к раковине и сжать осторожно, чтобы изгнать воду из трубки пикап.
- Вставьте розетку бутылку в пробирке. Выжимать бутылку, чтобы доставить водный пар в пробирке, пока на стенке трубки тонкий слой конденсата не появится. Видео 1 показывает личинку движется в трубе с соответствующим количеством влаги.
- Для герметизации личинку в пробирку, удалить толстую 1,5 см гель агара из чашки Петри и помещают над поверхностью сетки, чтобы воздушный поток под агара так, что агар штекер может быть вставлен в трубку. Нажмите один конец пробирке в гель дважды вставить оба штекера геля в одном конце.
- С paintbспешить, положите одну личинку в пробирку примерно 1,5 дюйма глубиной и запечатать трубу, нажав край, ближайший личинки в геле агара. Результирующее давление будет вытеснять второй разъем геле агара с противоположного конца и запечатать животное внутри трубки.
- Место трубки в MB5 многолучевой дрозофилы Activity Monitor (РСВ) устройства, и отрегулируйте положение трубки ", так что животные не могут выйти за рамки диапазона датчиков.
- Чтобы убедиться, что пробирки не выскользнуть из ИК рамки считывания устройства во время транспортировки, держать трубку в месте крепления кольца шпаклевки вокруг каждой трубы, где он контактирует устройства записи.
3. Измерение активности
- Запись активности в инкубаторе, чтобы предотвратить неточные показания, которые могут возникнуть в связи с тенями, люминесцентных ламп или к изменениям температуры в лаборатории. На рисунке 5 рекомендованной организации системы.
- Установить инкубатор на 20 ° С (рисунок 1). Чтобы избежать ложных записей из-за помех от источников света ламп во время записи, выключите люминесцентные лампы инкубатора и использовать отдельный источник света СИД во время записи в инкубаторе. Выполните испытание без каких-либо животных, чтобы обеспечить, что условия освещения не аберрантно вызвать датчиков. Там не должно быть никаких записанные данные движения после этого испытания.
- Разрешить личинки, чтобы акклиматизироваться к 20 ° С Настройки инкубатора в течение 5 мин до начала анализа.
- Чтобы установить плотины системы к желаемым интервалом записи (например, 1 мин), убедитесь, РСВ программное обеспечение для записи система загружается на главный компьютер 12 и откройте файл РСВ системы до подключения камеры записи с интерфейсом PSIU.
- Чтобы установить нужную частоту записи, при которой данные будут сохранены, выберите предпочтения, а затем нажмите выше или ниже опции чтения интервала, чтобы выбрать различные временные рамки, в которых данныебудут сохранены. Например, выберите интервал чтения раза с 1 сек до 1 часа.
- Чтобы выбрать различную параметр для записи данных, выберите предпочтения, а затем выберите соответствующие флажки в разделе типа выходных данных (на счету, движется, позиции и останавливаться, см таблицу 1). Каждый параметр представляет собой уникальный анализ активности личинок внутри трубки.
- Для начала записи, подключите монитор к источнику питания Interface Unit (PSIU) с использованием CAB6 телефонный кабель. Подключите PSIU к розетке. Зеленый свет укажет соответствующее соединение.
- Подключите PSIU через Universal Serial Bus (USB) на Macintosh или Windows PC для записи данных. Откройте программу РСВ SystemMB1v6x на компьютере автоматически начать запись данных.
- После желаемое время коллекция будет завершена, выберите Выйти, а затем бросить в настоящее время на экране РСВ деятельности; Затем данные будут автоматически сохранены в DAM системы данных. Возьмите этот файл данных (например, мониторинг 1) и перетащите в отдельную папку. Это будет хранить необработанные данные из программного обеспечения DAM так, чтобы они в дальнейшем могут быть обработаны.
4. Подготовка данных для обработки (РСВ FileScan)
- Для обработки сырых данных в понятном формате открыть приложение РСВ FileScan и выберите Выбрать папку ввода данных. Затем выберите папку данных и требуемый файл и выберите опцию сканирования. Наконец выбрать длину бен в желаемый период чтения. Это организовать исходные данные в параметры, установленные оператором и программа будет сообщать данные, собранные в этом конкретном диапазоне.
- Выберите тип выходных данных для анализа установку нужного движения (на счету монитор, движется, останавливаться). В меню дополнительных показаний, выберите сумму в бункер (это если длина бен больше, чем выбранный интервал считывания системы).
- Имя файла надлежащим образом и сохранить. Файл будет храниться в одном месте, что и папка с шагом 3,9.
- Для того, чтобы собрать средние движения, процесс необработанные данные, полученные с шага 4. Чтобы создать таблицу в программе электронных таблиц, откройте файл, который ранее был сохранен (этап 4.3), и когда появляется текстовое окно мастера импорта, выберите Готово, чтобы открыть файлы данных в формате электронной таблицы.
Примечание: В зависимости от типа данных анализируемого, таблица будет прочитано по-разному. Обычно для измерения монитора движется или рассчитывает, период времени исследования будут записаны в цифровой форме, в то время как каждый человек чтение трубка получит назначенный письмо. При просмотре данных в таблице, столбцы KZ представляют слоты для пробирок 1-16 соответственно. Строки представляют точки данных, собранных. - Например, если шаги были собраны в течение 20 мин в 1-минутными интервалами, в среднем на 20 строк, чтобы вычислить среднее количество ходов / мин, и других измерений.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
1 показаны результаты исследования температурного отклика управления личинок третьей возрастной стадии, ш 1118, используя устройство контроля для определения различий в личиночной передвижения на семи различных температурах. Личинки промывают и помещают в плотине активности устройства, как описано выше, и помещают в инкубатор до нужной температуры. Затем устройство давали привыкнуть к среде в течение 5 мин до начала записи. Каждый личинка, в отдельности анализировали для передвижения в течени...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Активность личинок дрозофилы зависит от множества факторов, в том числе генотипа 8, 13 лет и температуры окружающей среды 2. Хотя мощные Видеографический методы, позволяющие весьма подробный анализ были разработаны теми, кто изучает передвижения 5, этот уровень детализации может быть излишним для тех, кто желает, чтобы определить основные параметры деятельности. Метод, описанный здесь использует устройство, которое доступно во многих лабораториях, легко работать, порождает высок...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана NIH P20GM103643 I. Meng.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Монитор активности дрозофилы, многолучевой, 16 трубок, включая провода | TriKinetics Inc. | Интерфейс источника питания MB5 | |
| для монитора активности | TriKinetics Inc. | PSIU24 | |
| Стеклянные трубки 80 x 5 мм для монитора активности (100) | TriKinetics Inc. | PGT 5x80 | |
| DAMsystemMB1v6x Программное обеспечение для сбора данных для Macintonsh OSX (Intel) | www.trikinetics.com | бесплатно скачать | |
| программное обеспечение DAMFileScan 108x для Macintosh | www.trikinetics.com | бесплатно скачать | |
| программное обеспечение USB (PSIUdrivers.zip). | www.trikinetics.com | free скачать | |
| DAMSystem Notes 308 | www.trikinetics.com | free скачать | |
| Zeiss Stemi 2000C- Стерео микроскоп | Spectra Services | SP-STEMI2000C-BS | |
| Углекислый газ | Maine Oxy | анестезия | |
| Fly Pad Genesee | 59-114 | поверхность для сортировки обезболенных мух | |
| Маленькая кисть для рисования | Winsor & Newton | #2 ROUND | или аналогичный, используемый для сортировки обезболенных мух |
| Сетка для шелкотрафаретной печати (160) | msj-gallery.com | размер пор SM160W63-3 ярда | использованный в этом протоколе, был ~ 0,1 мм |
| Тегосепт | Genesee | 20-258 | консервант |
| Этанол (190 проб) | Pharmco | 111000190 | использован для растворения Tegosept |
| 6 унций Бутылка с квадратным дном (PP) | Genesee | 32-130 | |
| "Флуги" для пластиковых флаконов Fly | Genesee | 49-100 | |
| Флаконы дрозофилы, широкие (PS) | Genesee | 32-117 | |
| Флажки для широких пластиковых флаконов | Genesee | 49-101 | |
| Желтые дегерминированные кукурузные муки | Золотая медаль | ||
| Дрозофила агар | LabScientific | FLY 8020 | |
| Пекарские дрожжи - Red Star | King Arthur Flour | 1270 | |
| Сахарный песок - Домино |
Ссылки
- Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila.gene essential for nociception. Cell. 113, 261-273 (2003).
- Ainsley, J. A., Kim, M. J., Wegman, L. J., Pettus, J. M., Johnson, W. A. Sensory mechanisms controlling the timing of larval developmental and behavioral transitions require the Drosophila.DEG/ENaC subunit. Pickpocket1. Dev. Biol. 322 (1), 46-55 (2008).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila. melanogaster.and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol. Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Cattaert, D., Birman, S. Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila.larvae. J. Neurobiol. 48 (1), 58-73 (2001).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila. hordotonal organ mutants. PNAS. 100 (26), 16053-16058 (2003).
- Nichols, C. D., Bechnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. (61), (2012).
- Godoy-Herrera, R. The development and genetics of digging behavior in Drosophila. arvae. Heredity. 56, 33-41 (1986).
- Sinadinos, C., Cowan, C. M., Wyttenbach, A., Mudher, A. Increased throughput assays of locomotor dysfunction in Drosophila. larvae. Journal of Neuroscience Methods. 203 (2), 325-334 (2012).
- Homyk, T., Sheppard, D. E. Behavioral mutants of Drosophila melanogaster. I. Isolation and mapping of mutations which decrease flight ability. Genetics. 87 (1), 95-104 (1977).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila. larvae. J. Vis. Exp. (63), e3837(2012).
- Model Organisms I: yeast, Drosophila and C. elegans. Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education-database/3/essentials-of-biology-1-yeast-drosophila-and-c-elegans (2015).
- Woods, J. K., Kowalski, S., Rogina, B. Determination of the spontaneous locomotor activity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (86), e51449(2014).
- Troncoso, B., Godoy-Herrera, R., Waldo, M. The development of larval movement patterns in Drosophila). Heredity. 58 (1), 321-329 (1987).
- Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian rhythm of the locomotor activity in Drosophila. melanogaster.and its mutants ‘sine oculis’ and ‘small optic lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
- Johnson, A. W., Carder, W. J. Drosophila, ociceptors mediate larval aversion to dry surface environments utilizing both the painless TRP channel and the DEG/ENaC subunit, PPK1. PLoS ONE. 7 (3), (2012).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
