Экс Vivo культуры глотки Арки для изучения Сердце и мышцы предшественников и свою нишу

Глоточные мезодермы клетки дают начало части сердца и глотки мышц. Во время эмбрионального развития, мультипотентные сердечные клетки-предшественники из второго поля сердца мигрировать из глотки мезодермы и заполнить сердца тракт оттока и правый желудочек, и их аномальное развитие тесно связано с заболеванием-врожденных сердце ведущей причиной врожденных дефектов и рождении defect- смертей у людей. ^1-3 Последние исследования показали, что мезодерма глотки способствует возглавить мышцы, в дополнение к сердцу, что делает мезодерма важной частью сердечно-лицевых развития ^4. Таким образом, процессы развития, включая индукционные, пролиферации и дифференцировки головных и сердечных клеток-предшественников в глотки мезодермы находятся под активным следствием ^5-7.

До недавнего времени оставалось неизвестным ли клетки сердечной предшественники подвергаются расширения withoут дифференциация, частично из-за отсутствия информации об их клеточной среде. Наше недавнее исследование показывает, что глоточные арки служат микросреды для возобновления сердечных и мышечных клеток-предшественников и может быть культурным экс естественных условиях в течение нескольких недель ^8. Этот метод эксплантов предлагает новый и уникальную возможность для изучения развития сердечно-черепно-лицевой предшественников бывших естественных условиях.

Все мыши были сохранены на Американской ассоциации по аккредитации лабораторных животных (AAALAC) -accredited вивария при Университете Джонса Хопкинса и размещены в соответствии с процедурами, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных. Институциональная Уход и использование комитета животных (IACUC) одобрил все экспериментальные протоколы.

1. Экспериментальная Подготовка

1. Шерсть 12-луночный планшет с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в фосфатном буферном растворе (PBS) в течение 60 мин.
2. Удалить раствор для покрытия и добавить 200 мкл сыворотки среде (SFM). Twirl пластину, чтобы убедиться, что фильм СМИ охватывает всю поверхность.

2. Хирургические процедуры

1. Эвтаназии беременных мышей, используя протокол комитета утвержден уход за животными в учреждения с последующим смещением шейных позвонков, чтобы обеспечить полное эвтаназию.
2. Спрей и очистить регион живота мыши с 70%этанола. Поддерживать строгие стерильные методы, чтобы избежать загрязнения.
3. Используйте щипцы и ножницы, чтобы сделать 0,5 см ² разреза в области пупка.
4. Используйте пальцы, чтобы ущипнуть / захватить кожу выше и ниже разреза и осторожно потяните кожу в противоположных направлениях (голова и хвост).
5. Используйте пинцет и ножницы, чтобы сделать начальный разрез в мембране в области пупка. Аккуратно разрезать мембрану в V-формы от пупка до яичников на каждой стороне (2 х 1,5 см ^2), тем самым открывая матку.
6. Используйте пинцет, чтобы зажать яйцевод, соединяющий матку с яичником и ножницами, чтобы зажать яйцевод на стороне яичника, тем самым освобождая матку из яичника.
7. Осторожно потяните вверх матку по маточной трубе с пинцетом и вырезать матку, свободной от региона мочевого пузыря с помощью ножниц.
8. Потяните матку дальше по маточной трубе с пинцетом и сократить яйцевод с ножницами на другой стороне, тем самым освобождая матку от мУз.
9. Перевести матку 50 мл пробирку и добавить 20 мл холодной стерильной PBS с Са ²⁺ и Mg ^2+. PBS, должны содержать Ca ²⁺ и Mg ²⁺ во эмбриона рассечение.
10. Слегка встряхните пробирку в течение 10 сек, чтобы вымыть матку крови.
11. Передача матку из трубки с пинцетом и поместить его в 10 мл чашку и добавляют 5 мл холодной PBS в верхней части матки.
12. Поместите блюдо с матки под стереомикроскопа.
    Примечание: Шаги 2.13-2.19 требуется стереомикроскопа.
13. Используйте две пары щипцов, чтобы аккуратно открыть матку и анализировать из амниотической мешочки с эмбрионами из матки по одному.
    1. Используйте две пары щипцов осторожно откройте амниотической мешок, который окружает эмбрион, щепотка мешочек с одним пинцетом и аккуратно извлеките ее из эмбриона, используйте другие щипцы для резки и отпустите амниотической мешка из эмбриона. Если конкретный генотип необходимости держать амниотической мешка для генотипирования.
14. Поместите эмбрион в сторону и использовать пинцет, чтобы сократить 1-й ^{и 2-й} выгибая сзади к сердцу между аркой и глотки мешок (рис 1А '').
15. Аккуратно перевернуть эмбриона другой стороны и использовать пинцет, чтобы сократить 1-й и 2-й арки сзади к сердцу между аркой и глотки мешок.
16. Используйте пинцет, чтобы сократить сердечный отток тракта, что до сих пор, соединяющий ^1-й и ^2-й глотки арки в зародыше. Удалить арки, которые по-прежнему соединены вместе в форме бабочки (рис 1B), из эмбриона.
17. Используйте пинцет, чтобы зажать и отпустить ^1-й глотки арки из оставшегося сердечной выносящего тракта и энтодермы передней кишки (рис 1B '' указано пунктирной линией и *).
18. Используйте пинцет, чтобы зажать и отпустить ^2-й глотки арки из оставшегося сердечной оттокаи энтодермы передней кишки (рис 1B '' указано пунктирной линией и **).
19. Перевести каждую пару арок отдельно, используя пинцет и поместите обе арки в середине обозначенного хорошо. Пластинчатые ^1-й и ^2-й глотки арки в отдельных скважинах. Убедитесь, что арки находятся в контакте с пленкой носителя добавляют на стадии 1.2. Очень важно, что арки не покрываются среды, так как они должны вступить в контакт с поверхностью скважины для крепления в течение этого периода.

3. Инкубация и изображений

1. Инкубируйте арки помещают в пластины 12-луночного в 37 ° C / 5% CO ₂ в течение 2 часов для арки приложить к поверхности скважины.
2. Осторожно добавьте 200 мкл 37 ° C SFM вниз в сторону скважины. Убедитесь, что арки остаются прикрепленными и инкубировать O / N.
3. На следующий день, визуально проверить, что глоточные арки крепятся и осторожно добавить 200 мкл 37 ° C SFM вниз сторонахорошо. Если арки остаются привязан и плавающий, аккуратно удалить носитель с помощью пипетки без удаления не только арки до фильм СМИ осталось. Использование пипетки поместить арки в середине шага скважины и повторного 3.1.
4. Монитор в день; добавить ~ 100-200 мкл СМИ каждый 2-ой день, чтобы заменить любой выпаривали СМИ.
   Примечание: 24-48 ч после миграции клеток появляются вокруг арки и размножаться и мигрировать из арки в течение ближайших 5-8 дней. После 36-72 ч формирование избиения кардиомиоцитов можно наблюдать со ^2-го глотки арки (рис 2B). Формирование Myotube можно наблюдать с ^1-го глотки арки 3-7 дней после приложения (рис 2А).

Во время разработки, лица и мышц сердца предшественники можно проследить, как они размножаются и мигрируют из 1-й и 2-й глотки арки, чтобы стать голова и сердце мускулатуру, соответственно (рис 1А, A 'и A' '). Культивирование глотки арки предлагает уникальный способ изучения сердца и мышц развития подробно экс естественных условиях. После вскрытия и крепления глотки арок, мигрирующие клетки прикрепленными арок можно наблюдать в 24-48 ч культуры. В течение 3 дней формирования культуры myotube можно наблюдать с 1-го глотки арок и формирования кардиомиоцитов из 2-го глотки арок (рис 2А и 2В). Формирование кардиомиоцитов может быть визуально подтверждено спонтанно заражения кластеры мигрирующих клеток и / или анализа конкретных кардиомиоцитов маркеров (например, сердечного тропонина Т). Myotuбыть / формирование лица мышцы можно проверить визуально длительным удлиненные (до 500 мкм в длину) спонтанно дергающихся клеток и / или анализа специфических маркеров мышц (например, миогенин). С помощью системы CRE-LOX у мышей, мезодерма потомство может быть прослежено люминесцентных журналистами на CRE-выражения во время экс естественных условиях культуры (рис 2А "и 2В»). Кроме того, с помощью этого метода можно изучать судьбу потомства в котором конкретный интерес ген условно выбиты или избыточно экспрессируется, которые в противном случае привести к ранней эмбриональной летальности как описано ранее 8.

Рисунок 1: мышь эмбрион (Mesp1 CRE, Ai9) 9,5 дней после оплодотворения (E.9.5 >). () Левая сторона эмбриона. (ПА: Фарингальный арка, ОТ: Отток тракта, LV:.. Левый желудочек (') Mesp1 построчная оплата-след; ЗП отмечает Mesp1 + клеток и их потомство Стрелка указывает ЗП + Mesp1-потомство в PA2, непрерывная с OT. ('') Пунктирная линия указывают, где резать PA1 и PA2 кзади от сердца (B) Butterfly, как справа и слева PA1 и PA2 после вскрытия из эмбрионов FE:.. энтодермы передней кишки (В.) RFP знаки Mesp1 потомство . в РА1 и РА2 (B '') * и ** вместе с пунктирными линиями указывает, где резать и освободить PA1 и PA2 от OT и ИП Scale бар:.. 500 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого фигура.

загрузить / 52876 / 52876fig2.jpg "/>
Рисунок 2:. Искусственный глотки арки () Искусственный PA1 (3 дня культуры). (') RFP отмечает Mesp1 потомство в РА1. Стрелки и * указывают на образование в начале myotube. ('') Наложение RFP выражения в РА1. (B), культивированный ПА2 (8 дней культуры). (В ') RFP знаки Mesp1 потомство в PA2. Стрелки и указывают ** избиение область кардиомиоцитов (модифицированный из Shenje др. 8). (В '') Наложение RFP выражения в PA2. Масштабная линейка:. 250 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторам нечего раскрывать.