Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Поколение ортотопической крысиной модели плевральной мезотелиомы по злокачественной имплантации II-45 мезотелиомы клеток в плевральной полости иммунокомпетентных крыс представлены. Метод цитометрии потока для анализа семь подмножеств иммунных клеток в этих животных из 25 мкл пробы крови также описывается.

Abstract

Огромный всплеск интереса в иммунной основе лечения рака, таких как вакцины и ингибиторы иммунных контрольно-пропускной пункт, и более глубокого понимания роли микроокружения опухоли в ответ на лечение, в совокупности указывают на необходимость иммунокомпетентных ортотопических моделей доклинических испытаний из этих новых методов лечения. Эта статья показывает, как установить ортотопическая иммунокомпетентных крыс модель плевральной злокачественной мезотелиомы. Прогрессирование заболевания Мониторинг в ортотопических моделей посрамлен внутренним расположением опухоли. Для продольно контролировать прогрессирование заболевания и его влияние на циркулирующие иммунные клетки в этой и других моделей крыс рака, один трубки проточной цитометрии анализа требует только 25 мкл описан весь в крови. Это обеспечивает точную количественную оценку параметров иммунного семи: Общий лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов, а также Т-клеточного подмножества CD4 и CD8, В-клеток и естественных клеток-киллеров. Различные подводные лодкиETS этих параметров являются полезными в различных обстоятельствах и моделей, с нейтрофилов соотношения лимфоцитов, имеющего наибольшую ценность для мониторинга прогрессирования заболевания в модели мезотелиомы. Анализ уровня циркулирующего иммунных клеток, используя этот метод однотрубный может также помочь в мониторинге ответа иммунной основе лечения и понимание основных механизмов, ведущих к успеху или неудаче лечения.

Introduction

Злокачественная мезотелиома (ММ) является агрессивным злокачественности, который возникает из трансформированных клеток в мембрану (мезотелием), что линии легких и брюшной полостей, сердце и внутренних половых органов, и является наиболее распространенным первичная опухоль полости легких или плевре, ^1,2 , Воздействие асбестовых волокон составляет 80% всех ММ, и в то время запретов на использование асбеста были введены десятилетия назад в большинстве западных стран, его широкое использование в сообществе оставил смертоносного наследия. Всемирная организация здравоохранения подсчитала, что во всем мире 107000 человек умирают каждый год от болезней, связанных с асбестом, с смертности продолжает расти. Новый без профессиональной заболеваемости волна также новых и мало понимания того, когда и на каком уровне это будет ^пик 3.

Большинство людей с ММ диагностируется поздно, когда системная химиотерапия является одним из немногих жизнеспособных вариантов ^4. Самые effectiве химиотерапии и текущий 'стандарт медицинской помощи »(пеметрекседом вместе с цисплатином ⁵⁾ идентифицировали более 10 лет назад. Однако неудача этого лечения является неизбежным и нет доказанных вариантов второй линии, оставляя пациентов с мрачным прогнозом и медиана выживаемости составляет всего 12 месяцев ^2. Таким образом, существует настоятельная неудовлетворенная потребность в более эффективных методов лечения. Несмотря на рассмотрении ряда новых методов лечения в клинических испытаниях никто не привело к изменениям в практике. Это отчасти из-за низкой (5%) переноса доклинических результатов, как правило, выполняется в моделях ксенотрансплантата мыши, чтобы клинической ^6-8. Такие модели не точно повторять сложные аспекты опухолевого микроокружения, происходящих в не-физиологических местах, часто в отсутствие функционирующего иммунной системы ^9.

Сингенные Ортотопическая модели создания значительно более реалистичное окружение опухоли, чем Commonly используется подкожные модели ксенотрансплантатов как опухоли встречаются в правильном физиологическом месте с неповрежденной иммунной системы ^10,11. Чем больше размер крысы повышает его использование в качестве модели заболевания грызунов, особенно в исследованиях, где наркотики серийный забор крови требуется для оценки эффективности лечения и токсичность ^12. Кроме того, в модели, в которой контроль прогрессирование болезни затруднено из-за расположения опухоли (например, в плевральной полости), способность контролировать развитие болезни с использованием коэффициентов, найденные в обращении является очень привлекательным. Поколение сингенной ортотопического модели мезотелиомы плевры с использованием иммунной компетентные крыс описана. Кроме того, это простой и относительно неинвазивный метод для мониторинга прогрессирования заболеваний плевры путем измерения циркулирующих иммунных клеток также описано.

Protocol

Все процедуры с участием животных были проведены в соответствии с рекомендациями в австралийском кодекса практики по уходу и использованию животных в научных целях. Протокол для этого исследования был одобрен Комитетом по Королевский North Shore Hospital Уход за животными и этике. Женский Фишер 344 (F344, 150-200 г) были сохранены в Кернс фонда, Kölling институт при стандартных условиях (12 ч свет / темнота циклов и свободным доступом к пище и воде). Примечание: Блок-схема для всех экспериментальных процедур представлена ​​на рисунке 1. 1. Подготовка клетки для имплантации Культура крыса мезотелиомы II-45 клеточной линии (также известный как IL-45; получены путем перитонеального введения крокидолита асбеста) в среде RPMI 1640 (RPMI), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и расти в стандартных условиях (37 ° С увлажненный инкубатор с 5% СО 2). Maintaв по пассирования и к югу от культивирования примерно 1:50 дважды в неделю в 75 см 2 колбу. Подготовка реагентов для клеточной культуры и теплых аликвотах при 37 ° С. Необходимые реагенты включают бессывороточной RPMI носитель (SFM), RPMI с 10% FBS, фосфатным буферным раствором (PBS) и 0,5% трипсин-ЭДТА. Культуры клеток для имплантации примерно 70-80% слияния. Это гарантирует, что они находятся в линейном фазе роста. Урожай клетки путем отбрасывания носитель, промывания один раз 5 мл стерильной PBS в с последующим добавлением 3 мл 0,5% трипсин-ЭДТА. Вернуться колб для инкубатора в течение примерно 5 мин, пока все клетки становятся не соблюдают. После клетки не соблюдают, добавить 3 мл RPMI с 10% FBS для инактивации трипсина. Сбор и центрифуги клетки при 300 мкг в течение 3 мин. Вымойте осадок клеток в 10 мл SFM и центрифуги снова при 300 мкг в течение 3 мин. Вымойте осадок клеток снова с 10 мл УЛП и центрифуги, как указано выше, Ресуспендируют клеток в 10 мл SFM и выполнять подсчет клеток с помощью гемоцитометра или аналогичный приборов. Развести клетки таким образом, чтобы 100 мкл содержали количество, клеток для имплантации. Примечание: Рост опухоли была продемонстрирована в дозе, как низкий, как 100 клеток в 100 мкл но стандартная доза составляет 500000 клеток в 100 мкл. Подготовьте достаточное количество клеток в средствах массовой информации, так как число крыс для имплантации (т.е. 100 мкл / крысу), плюс по крайней мере 0,5 мл больше, чтобы компенсировать потери от грунтовки и мертвого объема иглы. Подготовьте достаточное SFM (без клеток), чтобы имплантировать в контрольных крыс (т.е. 100 мкл / крыса), плюс по крайней мере 0,5 мл дополнительное. Примечание: клетки и SFM готовы к имплантации. Они должны храниться в 37 о С и имплантировали в 2 ч уборки поддерживать жизнеспособность. 2. В естественных условиях имплантацию клеток Поместите крысу F344 (> 13 недель) в индукции камеры и обезболить с помощью 1,4% ИФ ингаляции (или метод их использования в объекте). После того, как появится крыса спит шаг его из камеры в носовой конус (с 1,4% изофлуран течет), поместите его на спину с груди вверх (вид снизу). Это позволяет внутренние органы урегулировать от грудной полости. Проверьте рефлексы в соответствии с институциональными протоколов для обеспечения крыса полностью под наркозом. Бритье правильный регио costalis (грудь) области, чтобы удалить шерсть. Очистите бритую область с 80% об / об этанола. Определить место инъекции: на правой стороне, найти 2-ой железы, начиная черепно. Сайт инъекции 0,5 см проксимальнее это, между 3-м и 4-м ребром от хвостового конца грудной клетке. (2А). Аккуратно перемешать II-45 клетки ресуспендируют. Медленно привлечь клеточной суспензии (или SFM для контрольных крыс) в 1 мл и# 160; шприц без иглы прилагается. Если игла прилагается для составления клеток есть потенциал для клетки расти вместе инъекционной иглой линии. Приложите 23G х 1¼ иглу. Премьер-игла и удалить пузырьки воздуха. После того, как шприц и игла загрунтованы, разместить в длину 20 мм и диаметром 5 мм проставка над вала иглы. Это используется для предотвращения проникновения иглы от слишком глубоко в плевральную полость во время инъекции. Приблизительно 5 мм 12 мм оголенного иглы является достаточным для проникновения через ребра без повреждения органов. Медленно вставьте иглу между ребер, отступать от шприца, чтобы обеспечить кровеносный сосуд не был проколот (кровь не должна появиться в шприце), то придать 100 мкл клеток или SFM. (2В). Снимите иглу и аккуратно свернуть крысу из стороны в сторону, чтобы распространять клетки в грудной полости. Поместите крысу в клетку и проверить на восстановление. Чте крысы должны проснуться в течение 1 мин и начинают передвигаться. Повторите для каждой крысы, используя новую иглу. Повторное использование той же иглы приведет к росту клеток по нагнетательной линии иглы. Daily Monitor благосостояния животных. Эвтаназии животных на этически определенных конечных точек, как регулируется институциональной комитета по этике животных. Этические конечных точек для крыс в этих экспериментах были потеря веса больше, чем 10% или затрудненным дыханием. 3. хвостовой вены кровь Коллекция Если кровь должна быть собрана сразу после имплантации клеток, держать крысу наркозом. Если отбор проб крови в другом момент времени, обезболить крысы, используя 1,4% ИФ ингаляции. Проверьте рефлексы в соответствии с институциональными протоколов для обеспечения крысу полностью анестезии. Поместите крысу на бок и найти боковую хвостовую вену. Стерилизовать хвост с 80% этанола и маркировать 0,5 мл ЭДТА Collection трубки. Для сбора крови, всегда начинайте с хвостового конца хвоста (приблизительно одна треть пути вдоль). Это позволяет дальнейшие попытки ближе к черепной конце хвоста в случае первая попытка будет неудачной. Никогда не ресэмплировать каудально, так как это может привести к сгусток крови. Подставьте 23G х 1 ¼ иглы параллельно боковой вены и сдвиньте его в вену под небольшим углом, так что проникает примерно на 10 мм (рис 3A). Примечание: Если вены успешно проколоты крови будет видно в конце крепления иглы (рис 3B). Каплю крови образуют на хвосте на месте пункционной иглы. Соберите эту кровь с помощью пипетки и передачи в меченых 0,5 мл (или меньше) сбора ЭДТА трубки. Для иммунной клеточном анализе 25 мкл достаточно. Применить марлю с давлением не прокола сайт до остановки кровотечения. Флик трубку крови смешивать кровь и ЭДТА ргМероприятие свертывания. Сохранить время между сбором крови и смешиванием с ЭДТА как можно короче, чтобы предотвратить свертывание. Когда не сбора крови из нескольких крыс магазин образцов ЭДТА-крови в стойке при комнатной температуре до анализа. Процесс в крови в пределах 2 ч сбора. 4. Подготовка проб для иммунной профилирования клеток с использованием бисера, в основе метода Примечание: Этот метод платформа одного зависит от использованием коммерчески доступных абсолютные подсчета трубы, которые имеют известное число бусин для каждого образца. Эти трубки содержат лиофилизированные гранулы, которые растворяют в ходе подготовки образца, выпуская бусы. Гранулы флуоресцентно меченных и стробирования по населению борта, абсолютного количества могут быть рассчитаны. Убедитесь, что ЭДТА образец цельной крови хорошо перемешать, поместив его на медленном роторный смеситель для нескольких мин. Этикетка одного абсолютного подсчета трубки для каждого образца. Гранулы, содержащие шарики должны быть видны под тОн металла держатель шарика на дне пробирки. Трансфер 25 мкл ЭДТА цельной крови в меченого абсолютной счетной трубки. Осадком из гранул будет растворяться при добавлении крови. В каждую пробирку добавляют 20 мкл анти-крысиного коктейль Т / В / естественных киллеров (NK) клетки, 10 мкл анти-крысиного CD8a PE 10 мкл анти-крысиного CD4 (домен 1) FITC и 10 мкл анти-крыса CD45 РЕ / Cy7 (4А). Флуорофоры определены в таблице 1. Центрифуга кратко трубка (300 мкг в) обеспечение антитела и клетки находятся в нижней части трубки, а не прилипли к стороне трубки. Вихревой смешивать и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре. Лизировать красные кровяные клетки добавления 400 мкл 10 мМ Трис, 0,15 М хлорида аммония (рН 7,5) и вихревые перемешать. Лизис завершена, когда образец появляется полупрозрачный и не облачный (цифры 4B и C). Отказ лизировать образец полностью приведет к увеличениюd фон и ложно повышенные рассчитывает при анализе с помощью проточной цитометрии. 5. Цитометрический Обработка образцов Примечание: Выполнение на цвет 4 проточного цитометра. Откройте программное обеспечение в режиме приобретения и нового шаблона с 8 участков, как показано на рисунке 5. Настройка параметров прибора в перечисленных в таблице 1, и установить ворота R1 (FITC [FL-1] по сравнению с БТР [FL-4]), Рис 5Ai) рассчитывать флуоресцентные шарики. Другие ворота не так важны, на данном этапе приобретения, но будут необходимы для анализа. Абсолютные шарики подсчета, используемые в этом протоколе содержит флуоресцентные красители и могут быть обнаружены в любой канал, хотя это слабое в синем канале. Использование подготовленный образец крови, контроль вихрь, а затем загрузить на цитометром и работать на низкой скорости (12 мкл / мин) на режиме настройки, так ворота сбора данных могут быть скорректированы. Установите приобретение длясобрать 10.000 события в бортовой ворот R1. Установите папку для записи данных и установить номер файла и образец файла ярлык в меню приобретения. Загрузить образец для анализа на цитометр и установить скорость потока в среде (35 мкл / мин). Запуск каждого образца при той же скорости потока. Скорость потока может потребоваться изменяться до низкой (12 мкл / мин) или высокой (60 мкл / мин), но, как правило, средний необходимости. В этом случае, это занимает около 90 сек до 120, чтобы приобрести 10000 шарик события для каждого образца. После того, как образец загружен смотреть разброс участков, чтобы убедиться, события появляются в шарик ворот R1. Первоначально могут быть некоторые нестабильности в давлении образца, вызывающего дрейф в разброс участков. Подождите, чтобы это стабилизировать. После стабилизации, нажмите на приобретать и позволяют образец для запуска. После того, как цитометр закончил приобретение 10.000 шарик события в R1 цитометр остановится приобретения и сохранения всех данных. Снимите и выбросьте образец потока втбыть. Цитометр теперь готов к следующей выборки. Выполнить все образцы, а затем перехода в режим анализа. 6. Иммунный анализ сотового Примечание: стробирования стратегии и Булева алгебра используются для определения каждого клеточной популяции. Булева алгебра является метод анализа на основе логики, что позволяет несколько операций в одном определении. Анализ программного обеспечения в цитометром потока (например, BD CellQuest) позволяет использовать булевой алгебры. Уравнения используются активно учесть значительное отрицательное реактивности, который помогает в определении клетку, более конкретно идентифицировать каждый клеточной популяции. «Регионы» используются для определения 'ворота'. Области определить 2-мерном пространстве, тогда как ворота могут быть составлены из многочисленных областей, связанных алгебраическими операторов (+, *, -, определенный в таблице 2). Переключение в режим программного обеспечения анализа. Шаблон анализ должен быть создан, чтобы соответствовать <strОнг> Рисунок 5 с участков и ворота показано на рисунке. Анализ каждого файла (т.е., каждый человек образец) отдельно. Настройка ворота R1-R9 через, а затем настроить алгоритмы для каждого типа клеток, как определено в таблице 2 (также показано на рисунке 5). Используйте счетчик статистики клеток для расчета отдельных клеточных популяций, определенных ворот и алгоритмов (таблица 2 и рисунок 5). Алгоритмы будет регулировать число клеток автоматически в счетчике статистики клеток. Рассчитать клеток подмножества, используя следующее уравнение: Примечание: Количество клеток событий, подсчитанных (например, лимфоцитов CD4 события) перечисляется с помощью приведенного выше уравнения, чтобы дать ряд клеток на мкл крови. Примеры приведены на рисунке 5.

Representative Results

Метод, используемый в данной работе для генерации модели ортотопической мезотелиомы плевры, используя II-45 клеток в результате животных поддаваясь мезотелиомы воспроизводимым и быстрым сроки, без крыс не умирает из-за метода имплантации. Титрование числа клеток, имплантированных уста…

Discussion

Эта статья детализирует метод для генерации крысы сингенной ортотопического модели мезотелиомы плевры и простой способ для мониторинга прогрессирования заболевания с помощью выборки продольного крови.

Модель II-45 был разработан подвергая Фишер 344 асбестовых волокон <s…

Materials

EDTA Collection tube (0.5ml)	Greiner Bio One GmbH	450480
Rat T/B/NK Cell cocktail	BD Pharmingen	558509	anti-Rat CD3  APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78)
anti-RAT CD8a PE	Biolegend	200608	(IgG1vClone G28)
anti-Rat CD4 FITC (Domain 1)	Biolegend	203406	(IgG1 Clone OX-38)
anti-Rat CD45 PE/Cy7	Biolegend	202214	(IgG1 Clone OX-1)
TruCount™ Tubes	Becton Dickinson	340334	Box of 50 absolute counting tubes
RPMI 1640 media	Life Technologies	11875-119
foetal bovine serum (FBS)	Scientifix	FBS500-S (lot# 010101-1)
trypsin-EDTA	Life Technologies	15400-054
PBS tablets	Medicago AB	09-9400-100
23Gx1¼ Needle	Becton Dickinson	302008
1mL Syringe	Becton Dickinson	302 100
Fischer 344 Rat	Animal Resources Centre, Perth Australia	F344
I.S.O (Isoflurane USP)	Veterinary Companys Australia (VCA)	B7058
II-45 Rat Mesothelioma line	Zurich University		Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC
FACSCalibur™ 4 colour	Becton Dickinson	342975
TRIS-HCL	SIGMA	T3253
Ammonium Chloride	SIGMA	9718
Anaesthetic Machine (The stinger)	Advanced Anaesthesia specialists	#00449