Определение биопленки инициации на инфицированные вирусом клетки с помощью бактерий и грибов

Человек микробиомом включает в себя разнообразные организмы из различных таксономических царств, которые разделяют географические регионы в организме. Приверженность к поверхности клеток является важным первым шагом в формировании биопленки, которая является частью процесса микробиомом колонизации. Включенный в микробиомом могут быть вирусы, которые вызывают хронические и хронические инфекции. Хроническая инфекция клеток этими вирусами , может привести к изменению в мнимым доступности рецепторов. ^1,2 Кроме того, проникновение в клетку путем внутриклеточных патогенов также может влиять на хост текучесть мембран / гидрофобность , которая в свою очередь может изменить прикрепление других членов микробиомом, в том числе бактерии и грибы , Для того, чтобы понять взаимодействия, которые могут возникнуть между этими несколькими патогенными микроорганизмами, которые совместно локализуются в одних и тех же географических регионах человеческого организма, мы должны иметь возможность изучать взаимодействие патогенных микроорганизмов, которые представляют спектр таксономических царств, присутствующих на поверхности слизистых оболочек.

т "> The Герпесвиридае семейство микробов , присутствующих в 100% людей в качестве постоянных членов микробиомом ^3,4. Кроме того , они могут также быть постоянно пролил как в присутствии и в отсутствие симптомов. В частности, вируса простого герпеса-1 и вируса простого герпеса-2 (ВПГ-1 и ВПГ-2, соответственно) являются постоянными членами микробиомом в oronasopharynx и половых путей. в иммунокомпетентных лиц, как ВПГ-1 и ВПГ-2 вызывают гингивостоматит, а также генитальный герпес ^5-8. на этих участках, ВПГ вызывает латентную инфекцию характеризуется хроническим персистирующим бессимптомным вирусовыделение ^9. Вступление HSV в клетках приводит к изменениям в поверхностной экспрессии nectins, гепарансульфата, липидных плотах и герпесвирусов ввода посредника / некроза опухоли рецептор фактора (HVEM / TNFR) ^10-25. Эти потенциально представляют собой общие рецепторы для некоторых бактерий и грибков, например , золотистого стафилококка и C. Albicans, которые в то время как условно - патогенными микроорганизмами,могут также находиться в качестве членов слизистого микробиомом из oronasopharynx ^26,27. В oronasopharynx С. стафилококк и C. Albicans занимают две различные участки колонизации. В хостов с естественными зубами, слизистой оболочки полости рта разделяют HSV-1 и С. Albicans, в то время как передние носовые ноздри заняты S. стафилококк ^28. Однако, несмотря на в пробирке выводы , что С. стафилококк прилипает ко рту эпителиальных клеток, ^29,30 S. стафилококк нечасто изолирована от полости рта образцов при нормальной ткани присутствует ^29,30. Мало что известно о половых путях со-колонизацию нишах , помимо клинических данных , что С. стафилококк связано с аэробного вагинита, характеризующийся воспалением половых органов, выделения и диспареунии, в то время как C. Albicans производит повреждения слизистой оболочки , аналогичные тому , что наблюдается в ротовой полости ^31-35. Таким образом, хотя эти члены устного и генитального microbiекоторые крест таксономические царства мало известно об их взаимодействии , как это влияет на их способности инициировать образование биопленки за счет присоединения к поверхности клетки - хозяина ^5. Этот протокол был эффективно применен для определения функциональных последствий совместного колонизации / инфекции.

1. HSV Штаммы и регулировать

Примечание: Рекомбинантный нерасплывающихся ВПГ-1 (KOS) gL86 и HSV-2 (нокаутов) 333gJ ^- с репортером активности бета-галактозидазы , используемой были предоставлены В. Twiari ^36,37.

1. Использование вируса из одной партии и хранят при -80 ° С в соотношении 1: 1 среды Игла в модификации Игла (DMEM) с 20% фетальной телячьей сыворотки (FBS) и не обезжиренного молока до использования. Перед вирусной хранения много, определяют концентрацию вируса с помощью о - нитрофенил-бета-D-галактопиранозида (ONPG) и 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозида (X-Gal) для анализа.
2. Определение жизнеспособности вируса и множественности заражения (MOI) по X-Gal окрашивания для каждого экспериментального прогона анализа с использованием анализа проникновения вирусов репортер, как описано ранее (рисунок 1) ^14.
3. Развести вирус (Opt-MEM) до нужной МВД России. Fix монослоя (параформальдегид; 0,5 мл / лунку) перед окрашиванием. Поместите контроль жизнеспособности вируса в отдельном microtiтер пластины параллельно с Полимикробные планшеты для анализа.

2. HeLa 299 Cell Погрузочно-разгрузочные работы

1. Расти при температуре 37 ° С, 5% СО ₂ в DMEM с 4,5 г / л глюкозы, 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (ФБС), гентамицин (50 мкг / мл) и L-глутамина. Пассаж клетки на 80% слияния с раствором трипсина (этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0,53 М ЭДТА; 0,05% трипсина; 5 мл / колба).

3. С. Albicans Погрузочно - разгрузочные работы

Примечание: C. Albicans , полученные из клинической лаборатории источника хранят при -80 ° С в Remmel обезжиренного молока 2x среды.

1. Культура замороженной на Сабуро декстроза (37 ° C). Через 24 часа субкультуры C. Albicans на среду Fungisel (37 ° С; 48 ч) для использования.
2. Сформировать зародышевой трубку (GT) формы (выбрать репрезентативные колоний, FBS 3 мл, 3 ч, 37 ° C; Abs _600, 0.3). После инкубации, моют GT (HBSS; 2x; 4000 XG). Добавьте промытый GT к подогретой HBSS (37 &# 176; C; 0.32 Abs _600). GT формы должны быть 99% клеток, наблюдаемых как определено по количеству гемоцитометра.
3. Сделать вид дрожжей (YF) маточные суспензии, подбирая репрезентативные Fungisel колоний (HBSS, 3 мл, 0,32 Abs _600). Подсчитайте количество YF форм / мл микроскопически с помощью гемоцитометра. YF формы должны быть 99% клеток, наблюдаемых как определено по количеству гемоцитометра.
4. Сделайте работает грибковой запас (250 мкл GT или YF запаса в 25 мл HBSS; 37 ° C; 10 ⁵ КОЕ / мл)

4. С. стафилококк Погрузочно - разгрузочные работы

1. Магазин С. стафилококка ATCC 25923 (-80 ° C; Remmel обезжиренного молока 2 раза). Культура на агаре с овечьей крови (5%; 37 & deg; С; 24 ч). Выберите представительные колонии и переносят в маннита солевую среду, в течение 2-х дней на складе (37 ° С; 18 ч).
2. Сделать S. стафилококк сток подвеска (3 мл HBSS; 1,32 Abs _600; 10 ⁸ КОЕ / мл)
   1. Совместная работа С. стафилококк акции (100 мклзапаса в 25 мл HBSS; 10 ⁵ КОЕ / мл).

5. Кандида и S. стафилококк Суспензии

1. Сделать смешанный C. Albicans и S. стафилококк суспензию (250 мкл YF или GT запасов и 100 мкл золотистого стафилококка запас в 25 мл HBSS).

6. Полимикробные биопленки Пробирной

1. Семенной 96 - луночные планшеты с 200 мкл 2 х 10 ⁵ HeLa клеток / мл (85%) уровень впадения. Рок пластины (30 - 45 мин; 37 ° С) до инкубации (37 ° C, 5% СО ₂ инкубаторе; 18 ч). Вымойте монослоя (1x; Opt-MEM) , то Семя с HSV (ВПГ-1 (KOS) gL86 или HSV-2 (КОС) 33 ГДж ^- в 100 мкл Opt-MEM; MOI 50 и 10). Инкубируйте пластины (3 ч, 37 ° С, 5% СО _2). Используйте только один штамм вируса в день.
2. Промыть зараженных монослоев (1x, фосфатно - солевой буфер (PBS) , с Mg ^{+ 2} и Са ^+2; 100 мкл). Заменить PBS с теплой HBSS оставив 25 & #181; л в каждую лунку.
   1. Добавить Ю.Ф., GT и / или S. Aureus рабочих суспензий (100 мкл, что мишень в соотношении клеток = 5: 1, N = 16). Как указано в таблице 1 Инкубируйте пластины (статические; 30 мин; 37 ° С, 5% СО _2).
3. После инкубации аспирата один столбец в то время , немедленно заправку с 300 мкл PBS с Mg ^{+ 2} и Са ^+2. Повторите этот шаг дважды затем добавить радио-иммунопреципитация буфера для анализа лизиса (РИПО, стерилизовали через фильтр; 200 мкл 1:50 разведения).
4. Быстро растирают клеточный лизат HeLa затем поместите 50 мкл на маннита солей (MS) и / Fungisel (F) средства массовой информации или (рисунок 2). Распространение лизата с использованием гнутого стекла стержня под углом 90 °. Инкубируйте пластин (18 ч при 37 ° С). Вручную подсчитывают количество колоний на чашку. Органы управления состоят из S. стафилококк и / или C. присоединение Albicans к HSV-неинфицированных клеток HeLa.

7. Исследования визуализации </ Р>

1. Промыть каждый круглый покровного стекла (12 мм, 50 мл ацетона в 100 мл химический стакан). Сухие и стерилизовать покровные (Kimwipes; стеклянные чашки Петри). Поместите сухие стерильные покровные в лунки стерильных 24-луночные планшеты с алкоголем пламени стерилизованных пинцетом.
2. Добавить клетки HeLa (1 мл; 5x объем используется для 96-луночных планшетов) в лунки 24-луночных планшетах, содержащих вымытые стерильные круглые покровные стекла. Добавьте вируса, бактерии и грибы , в соответствии с шаблоном (таблица 2) на скорости 5х Объем , используемый для 96 - луночные планшеты, а затем инкубировать и процесс , как описано в пунктах 6.2.1 до 6.4 выше.
3. После последней промывки, фиксации клеток для микроскопии при затоплении слайд с метанолом и позволяя ей испариться. Храните пластины при комнатной температуре до окрашивания.
4. Для светлой микроскопии (1,000x окончательное исходное увеличение) заполняют лунки, содержащие метанол фиксировали покровные деионизированной водой. Немедленно аспирация воды. Обложка каждого покровное с кристаллическим фиолетовым граммах, Вымойте покровные свободным от не связанного красителя (деионизированная вода). Сухие покровные в месте затем придерживаться их с монтажной средой с меченым слайде жесткий набор (рисунок 3).
5. Для флуоресцентной микроскопии (100x цели; 1,000x окончательное исходное увеличение) мыть покровные свободный от метанола, по существу, как описано в пункте 7.4. Сухие покровные в лунках.
   1. После сушки, снимите крышку слипы и поместите их на меченых горками. Затем добавьте достаточное количество 1:20 разбавления флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) -conjugated вируса простого герпеса типа 1 + 2 антитела Б-г, чтобы покрыть покровным (1 - 5 мкл).
   2. Инкубируйте слайдов в камере влажности при 37 ° С в течение 30 мин. После инкубации промойте покровные в 4-х изменений PBS.
   3. После последней промывки, возвращают покровное к меченым слайд. Пятно с 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI; камере влажности; 37 ° С в течение 30 мин). После инкубации промыть покровные в 4 чанGES ФБС, а затем прикрепить к меченым слайде с трудноизвлекаемыми установленной монтажной средой.
   4. Дайте гистологическая среда для отверждения в течение 24 ч при комнатной температуре в темноте. Изучите покровные по цели нефти на любом светлом поле микроскопа или флуоресцентного микроскопа с FITC и DAPI среза фильтров. Изучите фотографии , по крайней мере 50 полей (100 клеток на организм минимум) для совместной локализации (рисунок 4).

Уровень надежности данных , полученных из системы , описанной в настоящем докладе показано на рисунке 2 аф 38. С помощью этой системы модуляции стафилококковой и грибковой взаимодействия с инфицированных вирусом клеток и их влияние на соблюдение друг друга может быть разграничены. Такого рода исследования требуют микроскопическое исследование взаимодействия , как показано на рисунках 3 и 4 на 38, чтобы определить , является ли полимикробными взаимодействие происходит на одних и тех же клетках. В этом исследовании взаимодействия различных клеток наблюдается в результате HSV-модуляции стафилококковой и грибковой присоединение что вирусный специфичны по видам.

С. стафилококк и С. Albicans (GT и YF) присоединились к тем же контрольными клетками HeLa HSV-неинфицированных. Эта совместная локализация на клетках указывает на отсутствие Phys скую умозаключение друг друга соблюдения HeLa клеток и того, что измеренные уровни дифференциального соблюдения измеренными, вероятно ВПГ-опосредованный (Фигура 3А, А1) 38. Тем не менее, при HSV-1 или HSV-2 не инфицированных клеток HeLa не совместной локализации стафилококков и C. Albicans наблюдалось. (Фиг.3В, В1, В2, В3, C1, C2). С помощью флуоресцентной микроскопии (FITC-конъюгированные анти-ВПГ-Б - жьей моноклональное антитело) также подтвердил , что С. стафилококк - видимому , не ко-локализуются с C. Albicans ни ВПГ-1 или ВПГ-2 (фиг.4А, А1, А2, А3, А4, В1, В2, В3). Это сотрудничество между HSV и кандида распространяется на обоих дрожжей и зародышевых форм трубки (рис 2A-F) С. Albicans. Эта специфика ассоциации между триады микробов отражает специфику колонизации видели в гораздо более широком масштабе в принимающей oronasopharynx слизистую оболочку.

1 ">
Рисунок 1. X-гал Окрашивание Фотографии Лекарственная Зависимая HSV-1 инфекции в клетках HeLa. HeLa клетки , инфицированные ВПГ-1 при различных MOI и X-Gal , окрашенном. (A) HeLa клеток в лунку 96 - луночного планшета с X-Gal , окрашенном макете-инфицированных клеток HeLa контроля; 20x начальное увеличение; (Б) HeLa клеток в лунку 96 - луночного планшета с X-Gal окрашенном HeLa клеток , инфицированных ВПГ-1 при множественности инфекции (MOI) 10; 20x начальное увеличение; (C) HeLa клеток в лунку 96 - луночного планшета с X-Gal окрашенном HeLa клеток , инфицированных ВПГ-1 при множественности инфекции (MOI) 50; 20x начальное увеличение; Шкалы относится ко всем. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Файлы / ftp_upload / 54162 / 54162fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Влияние ВПГ-1 (панели A, C, E) и ВПГ-2 (панели B, D, F) при кратностей инфекции (MOI) 50 и 10 на прилипание S. стафилококк и / или C. Albicans к HeLa клеток. (A) S. стафилококк (Са) связывание с HSV-1 - инфицированных клеток в присутствии C. Albicans ростовых трубок (GT) или дрожжевые формы (YF); (В) С. стафилококк (Са) связывание с HSV 2-инфицированных клеток в присутствии C. Albicans ростовых трубок (GT) или дрожжевые формы (YF); (С) С. Albicans ростовых трубок (GT) связывание с HSV-1 - инфицированных клеток в присутствии S. стафилококк (Sa), (D) C. Albicans ростовых трубок (GT) связывание с HSV 2-инфицированных клеток в присутствии S. стафилококк (Sa); (Е) С. дрожжевые формы Albicans (YF) связывание с HSV-1 - инфицированных клеток в присутствии S. стафилококк (Sa); (F) C. дрожжевые формы Albicans (YF) связывание с HSV 2-инфицированных клеток в присутствии S. стафилококк (Sa). Все точки данных среднее +/- SEM, п = 16 нормированы на безвирусного контроля. * = Значительно отличается (р <0,05) от неинфицированных контроля HeLa клеток. # = Значительно отличается (р <0,05) от парного точки, указанной кронштейном; Шкалы относится ко всем. 38 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Отсутствие S. стафилококк и C. Albicans взаимодействий на HSV-1 и HSV-2 инфицированных клеток HeLa. HSV-1 и HSV-2 инфицированных (MOI 50) монослоя клеток HeLa с S. стафилококк и C. Albicans (5: 1 мишень для ячейки). Для получения светлого поля микроскопия, клеточные монослои окрашивали кристаллическим фиолетовым по Граму, затем исследовали с помощью световой микроскопии. Клетки , которые были положительными для Candida или S. стафилококк (100 индивидуальных клеток на сигнал микроба / на покровное) были вторично сканируется на наличие дополнительных сигналов микроб совместной локализации (1,000x начальное увеличение). (A & A1) S. стафилококк (Sa) и C. дрожжевые формы Albicans (YF) или формы росток трубки (GT) совместно локализуются на неинфицированных клеток HeLa; (A2, вставить). Процент HeLa клеток с колокализуются или отдельных микробов; (B - B3) Отсутствие S.. стафилококк и C. Albicans совместная локализация в присутствии HSV-1; (C - C2) Отсутствие S. стафилококк и C. Albicans совместная локализация в присутствии HSV-2. Среднее значение ± SEM; Шкалы относится ко всем. 38rget = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. Отсутствие совместной локализации S. стафилококк с C. Albicans на HSV-1 или HSV-2 инфицированных клеток HeLa. HSV-инфицированных HeLa клеток монослоев вызов с S. стафилококк и C. Albicans (5: 1 мишень для клетки) окрашивают (FITC-конъюгированные анти ВПГ Б - г антитела, и DAPI). Фотографии являются репрезентативными результатами скрининга клеток , которые были положительный сигнал для HSV затем проверяется на Candida и S. стафилококк (100 индивидуальных клеток на микроба сигнала на покровное) , которые затем были вторично сканируемого на наличие дополнительных сигналов микроб совместной локализации (1,000x начальное увеличение; Nikon). (A - A4) C. Albicans (A2, вставка; DAPI окрашивание) совместно локализуется с HSV-1; (В- B3) C. Albicans колокализуются с HSV-2 (B1, вставка, C. Albicans DAPI окрашивание). Среднее значение ± SEM; Шкалы относится ко всем. 38 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

1

2

3

4

6

7

8

9

10

11

12

трубы

GT

Ю.Ф.

MSSA

GT / MSSA

YF / MSSA

GT

Ю.Ф.

MSSA

GT / MSSA

YF / MSSA

СМИ

F

F

МИЗ

МИЗ

F

МИЗ

F

F

F

МИЗ

МИЗ

F

МИЗ

F

В

С

D

Е

F

г

ЧАС

Таблица 1.
Общие шаблона Определение микробной адгезии в Полимикробные взаимодействий GT = Кандида Albicans фенотип зародышевых трубки. YF = C. Albicans формы дрожжей фенотип; MSSA = метициллин чувствительного золотистого стафилококка; MS = маннитол соли среда; F = Fungisel среда. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

>

пластина 1	1	2	3	4	5	6
	только HeLa клетки	HeLa + GT	HeLa + YF	HeLa + Sa	HeLa + GT + Sa	HeLa + YF + Sa
В
С
D
пластина 2
HSV	HeLa клетки + HSV	HSV + HeLa + GT	HSV + HeLa + YF	HSV + HeLa + Sa	HSV + HeLa + GT + Sa	HSV + HeLa + YF + Sa
В
С
D

Таблица 2.
Общие Шаблон для визуального анализа Полимикробные взаимодействий с HSV-инфицированных и неинфицированных клеток HeLa GT = Candida Albicans росток трубки фенотип. YF = C. Albicans формы дрожжей фенотип; SA = метициллин чувствительного золотистого стафилококка; HSV = вирус простого герпеса.ve.com/files/ftp_upload/54162/54162table2.xlsx "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Авторам нечего раскрывать.