Пространственные измерения перфузии, интерстициальный давления жидкости и Липосомы Накопление в солидных опухолях

Измерение внутри опухолевой накопление наночастиц системы доставки лекарственных средств может стать важным инструментом для определения наличия адекватной концентрации цитотоксического препарата была достигнута в опухоли. Развитие «Имидж-состоянии" липосомальных систем позволяет неинвазивным и количественное в естественных условиях обнаружение доставки лекарственного средства транспортного средства с использованием методов визуализации , таких как позитронно - эмиссионной томографии (ПЭТ) ^1, оптической флуоресценции ² и компьютерной томографии (КТ) ^{3, 4} и магнитно - резонансная томография (МРТ) ^5. Обработки изображений используется для определения фармакокинетики и биораспределение липосомальных систем доставки и выявить степень межпредметных и внутри опухолевой гетерогенности в наночастицами накопления ^6,7. Тем не менее, изображения наночастиц в одиночку не идентифицирует биологические барьеры, которые способствовали их плохого накопления и распределения. Это знание имеет первостепенное значение для гАЦИОНАЛЬНЫЙ разработка более эффективных составов, а также стратегии улучшения внутри опухолевой накопления ^8. Было показано , что терапевтические стратегии могут быть применены для модулирования специфические биологические барьеры что приводит к улучшению переноса наночастиц ^9. Кроме того, препараты из наночастиц были разработаны специально для преодоления специфической биологической транспортного барьера ^10. В обоих случаях измерения биологических барьеров могут быть использованы для руководства использования соответствующей стратегии наночастиц для доставки лекарственного средства.

Опухоль микроциркуляции и повышенные ПСИ как полагают, являются двумя ключевыми факторами , определяющими внутриатомного опухолевый накопления наночастиц, такие как липосомы, в солидных опухолях ^9,11. Тем не менее, другие барьеры, чтобы способствовать накоплению плохой липосом включают плотный внеклеточный матрикс, непроницаемый сосудистую сеть , и давление ¹² твердой ткани. Эти барьеры связаны в пространственно-временнойСпособ, с ненормальным кровотока и повышение интерстициального давления жидкости является двумя важными факторами, способствующими первоначальную поставку и кровоизлияние наночастиц. Как уже обсуждалось ранее, установление взаимосвязи между микроциркуляции опухоли, повышенное IFP, и внутриливанской опухолевый накопление липосом является обязательным для правильной интерпретации данных липосомами изображений. При этом количественные методы для измерения отношения между микроциркуляции опухоли, повышенное IFP, и накопление наночастиц в твердой опухоли представлены. Это достигается путем выполнения колокализуются измерений внутри опухолевой распределения КТ липосомная контрастного агента с использованием объемной КТ, опухоль микроциркуляции с помощью динамической контрастности усиливается вычисленный изображений томографии, а также опухоли IFP с использованием изображения наведением роботизированной системы позиционирования иглы, названные робот CT-IFP ^13.

Все эксперименты в естественных условиях были проведены в соответствии с протоколом , утвержденным Institutional уходу и использованию животных комитета университета сеть здравоохранения путем.

1. Животная модель

1. Культура от 5 до 7 х 10 ⁶ MDA-MB-231 опухоли аденокарциномы молочной железы клеток в DMEM вместе с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 100 - кратном разведении пенициллин-стрептомицина.
2. Урожай клетки, когда они 80% сплошности с использованием 0,05% раствора трипсина-ЭДТА. Через 3-5 мин нейтрализации трипсин-ЭДТА с 3-кратным объемом DMEM. Возьмите 15 мкл аликвоты клеток и подсчета использованием гемоцитометра. Центрифуга клетки в гранулы в течение 5 мин при 200g, и повторно приостанавливать в HBS при концентрации 10 х 10 ⁶ клеток на мл.
3. Имплантат подкожно (SC) опухоли путем инъекции 1 до 2 × 10 ⁶ клеток в задней конечности каждой от 8 до 12 недельных самок SCID мышей (п = 5). Используйте стандартный 25 G иглы для инъекций.
4. монитор тumor роста , используя суппорты (объем = 0,5 х длина х ширина ²⁾ и начать измерения , как только опухоли SC достигли объема> 200 мм ³ (приблизительно от 7 до 9 дней).

2. CT-липосома Получение и определение характеристик

1. липосом Подготовка
   1. Растворите липидные компоненты (200 ммоль / л) для CT-липосом, в том числе 1,2-дипальмитоил-SN-глицеро-3-фосфохолина (ДПФХ), холестерин (СН), и 1,2-дистеароил-Sn-глицеро-3 -phosphoethanolamine-N-поли (этиленгликоль) 2000 (DSPE-PEG2000) в безводном этаноле при 70 ° с при мольном соотношении 55: 40: 5 DPPC CH: ДСФЭ-PEG2000.
   2. Выпаривают этанол, поддерживая высокую температуру при 70 ° С, а затем добавить КТ контрастное вещество иогексол (300 мг / мл йода) к раствору так, чтобы конечная концентрация липида составляет 100 мМ.
   3. Поддержание раствора при 70 ° С в течение 4 ч с частым встряхиванием.
   4. Для получения однослойных везикул, прессовать образец 5 тимЕ. С. через два уложены 200 размер нм пор мембран при давлении 250 фунтов на квадратный дюйм и выталкивать снова на 5 циклов через два сложенных 80 нм мембран с размером пор при 400 фунтов на квадратный дюйм с использованием 10 мл липидного экструдера. Капают объем 10 мл липосом в экструдер в начале каждого цикла экструзии и собирают в стерильную пробирку или стеклянную пробирку коническим после каждого цикла экструзии.
   5. Удалить неразделанный инкапсулированные иогексол на 16 ч диализа с использованием молекулярной массой 100 кДа, отрезали (MWC) диализный мешок против 250-кратного объема избытка 0,02 мМ HEPES-солевом буферном растворе (HBS, рН 7,4). Например, поместите 1 мл раствора липосом внутри мешка диализом с помощью 250 мл HBS вне мешка в стакане.
   6. Концентрат CT-липосом с использованием 750,000 сономических MWC коммерческую систему тангенциального потока в соответствии с инструкциями изготовителя. Концентрат до конечной концентрации йода примерно 55 мг мл ^-1.
2. липосом Характеристика
   1. Измерить эффективность инкапсулирования путем разрывания CT-липосом с использованием 10-кратного объема избытка этанола , чтобы освободить ioxehol , а затем разбавленным с помощью 100-кратного объема избыток деионизированной воды (т.е. 10 мкл липосом разрываются с использованием 100 мкл этанола , а затем разбавляли до конечного объема 10 мл).
   2. Определить концентрацию йогексола с помощью УФ-спектрометра с детектированием при длине волны 245 нм. Расчет эффективности инкапсулированных, принимая величину коэффициента высвобождаемого иогексола агента к количеству агента, добавленного в процессе приготовления.
   3. Измерьте диаметр и дзета-потенциал гидродинамический с использованием динамического рассеяния света частиц по размерам системы анализатора в соответствии с инструкциями изготовителя. Развести КТ-раствора липосом путем 200x (т.е. 5 мкл липосом в 1 мл конечного объема) в деионизированной воде для облегчения измерений.

3. КТ опухолевой микроциркуляции и CT-липосомраспределение

Примечание: Следуйте инструкциям производителя для выполнения объемного сканирования, если используется другая версия программного обеспечения или оборудования.

1. Обезболить каждой мыши, используя 2% изофлуран, смешанный с медицинским кислородом или воздухом и подтвердить зажимая палец и не соблюдая никакой реакции. Нанесите мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость под наркозом. Зафиксировать животное в положении лежа пластырем лапы к тонкой пластиковой доске.
2. Поместите заказ 27 G катетер, соединенный с 20 см на PE10 трубки, в боковую хвостовую вену и зафиксировать на месте с помощью нескольких кусков ленты.
3. Подготовить 1 мл шприц, чтобы содержать, по меньшей мере, 200 мкл CT-липосом. Подготовьте 1 мл шприц с физиологическим раствором, чтобы использовать для промывки катетера. И, наконец, подготовить 1 мл шприц с, по меньшей мере 150 мкл свободного иогексола, смешанного с физиологическим раствором (9: 1 соотношение по объему).
4. Поместите мышь ничком на микро-КТ планшете сканера. С помощью лазерной системы позиционирования для размещения TUMOR примерно в той же ориентации для каждого сканирования.
5. Поместите CT-липосом шприц в шприцевой насос и прикрепить катетер к шприцу. Установите скорость насоса 10 мкл в секунду.
6. Инициализировать систему, выполняя ярко-темно-калибровочный сканирование с использованием программного обеспечения консоли КТ-сканера. Выберите опцию сканирования ярко-темным для каждого протокола формирования изображения интереса, выберите ярко-темный из выпадающего меню и нажмите на кнопку сканирования, чтобы начать процесс калибровки.
7. Выполните объемный анатомический микро-КТ опухоли до начала любой инъекции контрастного вещества. Посмотрите на индикатор консоли программного обеспечения томограф для обеспечения безопасности КТ-сканера блокираторы были очищены. На КТ сканера консоли выберите сканирования выберите энергию рентгеновского излучения 80 кВ, ток трубки 70 мА, и захватывает 1000 проекции изображения с течением времени 16 сек. Нажмите кнопку сканирования, чтобы начать сканирование.
8. С помощью шприцевого насоса, чтобы ввести болюс КТ-липосом при концентрации 400 мг йода на кг-1. Установите насос для того чтобы придать объем приблизительно 150 мкл (при условии 25 г мыши). Нажмите кнопку "Пуск" на насосе, чтобы впрыснуть. Вручную промойте катетер с 50 мкл физиологического раствора (в два раза объем катетера), чтобы обеспечить весь объем агента посеянный и катетер ясно.
9. Подождите 10 мин после инъекции CT-липосом, а затем выполнить вторую анатомическое сканирование, используя тот же метод и параметры, описанные в 3.5.
10. Выполните сканирование АКД-CT, установив шприцевой насос для впрыска объемом 100 мкл свободного иогексола, смешанного с физиологическим раствором (соотношении 9: 1 по объему) с использованием той же установки скорости впрыска, описанной в разделе 3.3.
    1. На консоли КТ-сканера выберите 5 мин динамическое сканирование, которое использует установку рентгеновского энергии 80 кВ, энергии трубки 90мА, улавливает 416 изображений проекции каждую секунду в течение первых 30 секунд и с последующим приобретением каждые 10 сек , Захват 5 сек данных АКД-CT, а затем нажать кнопку запуска на injectioп насос.
    2. После АКД-КТ выполняют объемную анатомическую микро-КТ.
11. Захват анатомических КТ-изображений между 48 и 72 ч после инъекции CT-липосом, используя те же самые объемные параметры трансформаторов тока, как описано в 3.5 шагов.
12. Восстанавливают анатомические данные КТ и АКД-КТ с помощью программного обеспечения GPU-реконструкции.
    1. Загрузите изображение в программу реконструкции. Выберите интересующую область быть реконструирована рисовании ROI на изображение с помощью мыши. Установить место сохранения и имя файла для реконструированный отображаемого и выбрать выходной тип файла как '.mat'.
       Примечание: Программное обеспечение автоматически установит реконструированного размер воксела к 0,153 х 0,153 х 0,153 мм ³ для анатомических сканирования и 0,153 х 0,153 х 0,462 мм ³ для сканирования АКД-КТ. Нажмите на кнопку "начать реконструкцию».
13. С помощью предварительного впрыска и 10 мин сканирование после инъекции CT-липосом для расчетаПлазма объемная доля , как описано ранее ^3. Кроме того, использование предварительного впрыска и 5 мин после инъекции сканирование иогексола для расчета интерстициальный объемной доли , как описано выше ^7.
14. Получить интенсивность времени кривые (тиков) путем импорта данных АКД-CT в программное обеспечение, которое обеспечивает возможность идентификации области интереса (ROI) в пределах объема опухоли. Затем рассчитывают среднее повышение КТ в ROI в зависимости от времени. В этом эксперименте специальное программное обеспечение было разработано, чтобы определить ROI и рассчитать ТЭП.
15. Получить количественные оценки перфузии и сосудистой проницаемости путем подгонки измеренных ТЭП с использованием кинетической модели двухкамерный копира. Место может быть выполнена с помощью программного обеспечения АКД-КТ анализа и использования априорной оценки объема плазмы фракции и фракции интерстициального объема в качестве фиксированных параметров в кинетической модели двухкамерный копиром. Использование ранее сообщалось о способах получения априорных оценок плазмыа и интерстициальные объемные доли ^14.

4. Пространственные измерения опухолевого интерстициального давления жидкости

1. Для измерения IFP соединить спинальную иглу 25 G к датчику давления и к системе сбора IFP через 50 см от PE20 полиэтиленовых труб. Промыть всю систему с гепарин сульфат / солевой раствор (1:10). Стерилизовать иглу с 70% изопропилового перед использованием.
2. Включите систему сбора и запустить программное обеспечение сбора IFP и загрузить файлы настроек для калибровки системы измерений приобрести IFP в мм ртутного столба. Нажмите кнопку нажить непрерывно собирать данные IFP.
3. Провести измерения IFP между 48 и 72 ч после инъекции CT-липосом (это соответствует приблизительное время пика накопления КТ-липосом в опухоли), с использованием способов, описанных в пункте 4.8. Присоединить иглу IFP к роботу CT-IFP.
4. Выполнение калибровки сканирования для выравнивания систем координат дляробот CT-IFP и сканер КТ. Добавьте фидуциального вложение маркера для робота CT-IFP и выполнить четыре объемных КТ с нормирующего маркера в четырех различных положениях.
   1. Запуск программного обеспечения контроллера робота CT-IFP, инициализировать робота, и переместите робота на три позиции, введя х, у, z таргетинг позиции и нажав кнопку "Go".
   2. Возьмите КТ по ​​следующему х, у, г координаты: (1) 0,0,0; (2) -10,0,0; (3) 0,7,0; и (4) 0,0,10. Выберите 90 кВ, 10 мА, 16 сек сканирования с помощью программного обеспечения КТ-сканера и нажмите 'Start', чтобы начать сканирование. Реконструировать сканирование, как описано в 3.10.
5. Запустите программное обеспечение выравнивания робота CT-IFP. Нажмите на кнопку "Добавить", загруженную в регионе "Регистрационные данные" и выберите четыре реконструированные регистрации сканирования, полученные в 4.3, затем нажмите кнопку "открытым".
   Примечание: Пиксель расположение нормирующего маркера будет автоматически введен в Softwaчисло рейнольдса
   1. Нажмите на кнопку "Рассчитать" Transform, а затем нажмите кнопку "Применить" Transform. Это генерирует данные выравнивания, которые будут использоваться для преобразования робот CT-IFP системы координат к томографа системе координат. После завершения калибровки, прикрепить платформу животных к роботу CT-IFP.
6. Обезболить каждой мыши, используя 2% изофлуран, смешанный с медицинским кислородом или воздухом и подтвердить зажимая палец и не соблюдая никакой реакции. Зафиксировать животное на платформе робота CT-IFP и расположите мышь таким образом, что опухоль доступна для системы робота CT-IFP. Зафиксировать опухоль с помощью липкой ленты таким образом, что он не двигается во время введения иглы IFP.
7. Провести анатомическую микро-КТ до введения иглы IFP. Реконструировать данные КТ, используя шаги, описанные в 3.10.
8. Загрузите предварительно иглы вставки CT данных в программное обеспечение выравнивания робота CT-IFP. Отрегулируйте окно и уровень визуализации опухоли. Нажмите на гое край опухоли в любом изображении, а затем нажмите на втором месте обода.
   Примечание: Программа будет вычислять ряд позиций вдоль линейной линии между двумя позициями. Обратите внимание, что х, у и г координаты для ряда 5 до 8 равномерно расположенных позиций из списка.
9. Подготовка системы IFP путем промывки иглы с гепарином физиологическим раствором перед введением.
10. Введите первые заранее определенные позиции иглы в х, у, г, в программное обеспечение управления роботом CT-IFP и пресс-перейти на кнопку "Go" для перемещения робота в нужное положение. Нажмите кнопку "Вставьте иглу", чтобы вставить иглу в ткань.
    1. После введения иглы обеспечивают хорошую жидкостную связь между иглой IFP и ткани, зажимая и отпуская PE20 трубки, отметив, что измерение увеличивается IFP и возвращается к предварительно зажимая значение на программном обеспечении приобретения IFP. Отклонить измерения, которые не возвращают к исходному уровню.
11. Приобретатьанатомическое КТ с иглой, вставленной, а затем нажмите кнопку "RETRACT игла" на программное обеспечение управления роботом CT-IFP, чтобы убрать иглу из ткани. Отклонить любые IFP измерения, где значение IFP не возвращается к значению вставки предварительно иглы после извлечения иглы. Это означает, что игла может быть засорены во время измерения. Повторите шаги 4.8 до 4.10 для каждого положения иглы.
12. Определить положение иглы в пределах объема опухоли путем вычисления x, y, и Z позиции иглы порта относительно центра масс объема опухоли, как это определено в пост-вставки объемной КТ иглы.
13. Возвращение животных в клетки после того, как все измерения завершены. Не оставляйте животных без присмотра, и заботиться, чтобы наблюдать за ними, пока сознание не было вновь, и они способны поддерживать грудины лежачее.

Указанный протокол должен давать CT-липосом с инкапсулированным концентрацией иогексола, средний диаметр липосом и дзета - потенциал 55 мг мл -1, 91,8 ± 0,3 нм и -45.5 ± 2,5 мВ соответственно. На рисунке 1а включает в себя репрезентативную АКД-КТ результаты, получая временные ряды объемных данных, которые показывают временные изменения в внутри опухолевого накопления иогексола. Выбор ROI в пределах опухоли дает TIC , которая может быть определена количественно с использованием методов кинетического моделирования трассирующие для получения оценок перфузии, проницаемости сосудов, плазмы объемной доли и интерстициальной объемной доли (рис 1b). В этом исследовании, кинетическая модель двухкамерный трейсер использовали и подтянутым к измеренной ТЭП с использованием нелинейной кривой подгонки рутина , реализованный в Matlab 14. Сегментация объема опухоли на несколько областей, представляющих интерес одинакового размера позволяет количественно оценить тон пространственное распределение гемодинамических параметров в пределах объема опухоли (рис 1в). Сегментация может быть выполнена либо вручную, что отнимает много времени и трудно, или автоматически, как выполняются здесь, используя алгоритм, который делит опухоль в нескольких трансформирования одинакового размера с помощью сферической системы координат. Методы АКД-CT обеспечивают количественные оценки пространственного распределения перфузии, проницаемости сосудов, плазменной объемной доли и интерстициальной объемной доли. наблюдались эти параметры, чтобы быть пространственно неоднородны с более высоким уровнем перфузии, плазмы и интерстициальной объемных долей по периферии по сравнению с центральным объемом опухоли.

Метод объемной визуализации КТ выявляет биораспределение и внутри опухолевой распределение CT-липосом. На рисунке 2а показаны биораспределение CT-липосом на 48 ч после инъекции. Агент по-прежнему циркулирует в год сосудистой системы, при значительном поглощении наблюдается в селезенке и печени. Внутриизмерительные опухолевый накопление КТ-липосом наблюдалось гетерогенна, с преимущественно периферического накопления по сравнению с центром, как обозначено ярких областей в пределах объема опухоли (2б).

Объемный КТ изображения может использоваться для отслеживания местоположения измерений IFP с использованием установки робота - СТ-IFP. На рис.3 показано размещение иглы IFP в пределах объема опухоли , как визуализируют с помощью высокого разрешения микро-КТ. Игла может быть четко определены в объеме опухоли , позволяя для пространственной локализации IFP измерений в пределах объема опухоли (рис 3b). Можно сформировать пространственную карту IFP по всей опухоли путем выполнения нескольких IFP измерений в пределах объема опухоли. Пространственное IFP затем могут быть соотнесены с соответствующими измерениямимикроциркуляция опухоли и накопление КТ-липосомами.

Объемный КТ томография позволяет общей системе отсчета , дающими возможность совместно локализовать измерения гемодинамики, IFP, и накопление КТ-липосомами. Рисунок 4 приведен пример пространственно колокализуются измерений КТ-липосом накопления, IFP, перфузия, проницаемость сосудов, плазма объемная доля, и интерстициальный объемная доля. Было отмечено, что перфузию и объем фракции плазмы значимо коррелировали с интра-опухолевый накопления КТ-липосом в подкожных MDA-MB-231 опухолей. Кроме того, радиальное распределение IFP коррелирует с гемодинамическими измерений. Эти результаты указывают на сложный пространственно-временная связь существует между микроциркуляции опухоли, IFP и внутрибрюшного опухолевое накопления липосом 14.

Рисунок 1: ДСЕ-КТ опухоли микроциркуляции (а) представитель серии временных КТ - изображений , собранных в пределах объема опухоли, изображающая кинетику контрастный агент , как функции от времени.. Красный контур представляет собой ROI, где измеряется кривая интенсивности времени (TIC). (Б) TIC годен с использованием двухкамерной кинетической модели копира , чтобы получить количественные оценки гемодинамических параметров в пределах ROI. (С) представитель пространственное распределение количественных параметров гемодинамики в опухоли. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Объемный КТ-визуализации липосом Accumul вания. (а) представитель 3D - объем-воспроизводимое изображение демонстрирует биораспределение CT-липосом. (Б) представитель осевые, корональной и сагиттальной срезы , взятые через центр опухоли , показывающий внутрисетевой опухолевое накопление КТ-липосом на 48 ч после инъекции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рис . 3: Изображение Ведомый IFP Измерения (а) Представитель 3D объемного изображение из системы робота CT-IFP (зеленый цвет) вставки после иглы в подкожной опухоли на 48 ч после инъекции CT-липосом (оранжевый). (Б) представитель КТ изображение вставки после иглы./54226/54226fig3large.jpg "Целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4:. Колокализуются Измерения опухолевого микроциркуляции, IFP, и накопление КТ-липосом панель , показывающая репрезентативную пространственное совместной локализации КТ-липосом накопления приняты 48 ч после инъекции, IFP, перфузии, проницаемость сосудов, объемной фракции плазмы и интерстициальный объемная доля. Повторная печать с разрешением от 14 лет . Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Авторам нечего раскрывать