Спирального ганглия Нейрон эксплант и электрофизиологии на многопроцессорных электродных Массивы

По данным Всемирной организации здравоохранения, 360 миллионов человек во всем мире страдают от потери слуха с серьезными последствиями для профессиональной и личной жизни. Слуховые аппараты позволяют восстановить сенсорную функцию при умеренных формах тугоухости; однако в самых тяжелых случаях наиболее эффективным вариантом лечения является протезирование, называемое кохлеарным имплантатом (КИ). КИ содержат линейную электродную решетку, состоящую из 24 электродов, которая хирургическим путем вводится в барабанную перепонку улитки. Электроды непосредственно стимулируют спиральные ганглиозные нейроны, образуя слуховой нерв ¹.

С более чем 300 000 имплантированных устройств по всему миру, КИ являются очень успешными медицинскими имплантатами и входят в число самых экономически эффективных процедур, когда-либо зарегистрированных. Несмотря на свой успех, кохлеарный имплант все еще имеет ограничения, такие как пониженное частотное разрешение по сравнению с физиологическим слухом. Это может привести к дефициту эффективной коммуникации в группах или шумной обстановке, а также к способности расшифровывать очень сложные звуки, такие как музыка. Это снижение частотного разрешения, вероятно, связано с разрывом между электродами CI и спиральными ганглиозными нейронами, что приводит к стимуляции больших групп нейронов. Этот разрыв находится в пределах сотен микрометров ^2,3. Устранение этого разрыва будет способствовать стимуляции меньших групп нейронов на электрод, тем самым увеличивая частотное разрешение и общую производительность устройства4.

Чтобы изучить влияние зазора между электродом и нейроном и влияние различных оптимизированных протоколов стимуляции, мы разработали биоанализ in vitro, основанный на неинвазивной электрофизиологической характеристике SGN на многоэлектродных массивах (MEA) ⁵. Кроме того, MEA можно легко модифицировать для изменения формы, размера, материала и шероховатости поверхности электродов для оптимизации границы нейрон-электрод. Ниже приведен пошаговый протокол для воспроизводимого получения записей из культур спиральных ганглиозных нейронов мышей и оценки зависимости от вышеупомянутых параметров.

Уход за животными и эксперименты проводили в соответствии с руководящими принципами швейцарских местных властей (Amt für Landwirtschaft унд Natur суд кантона Берн, Швейцария).

1. Подготовка решения для экспериментов

1. Приготовьте раствор для покрытия внеклеточного матрикса (ECM) (см Таблица материалов, пункт 6): Оттепель ECM смесь на льду. Развести ECM смесь в соотношении 1:10 в основной культуральной среде (без нейротрофических факторов или эмбриональной телячьей сыворотки (FBS)) и хранить на льду.
2. Подготовка питательной среды (см Таблица материалов, пункт 1): Подготовьте запас среды Neurobasal не содержащей FBS или головного мозга нейротрофического фактора (BDNF). Дополнение Neurobasal СМИ со свежими FBS (10%) и BDNF (5 нг / мл) непосредственно перед добавлением к культуре клеток.
3. Подготовьте внеклеточный раствор (см Таблица материалов, пункт 2).

2. Мойка и Стерилизация МЭС

(рис 1E). Каждый электрод имеет размеры 40 х 40 ^мкм2 с шагом 200 мкм от центра до центра. Электроды изготовлены из платины. Электроды соединены с соответствующими контактами схемой из оксида индия и олова. Эта схема изолирована слоем 5 мкм SU-8. Смотрите таблицу материалов для дополнительной информации о поставщике. Другие макеты MEA могут быть пригодны для этих экспериментов.

1. Для новых МЭС: Промыть их погружением в 70% этаноле в течение 30 сек и промывают дистиллированной водой в течение 30 сек. Работа в ламинарном потоке.
2. Пусть MEA высохнуть в течение 30 мин в ламинарном потоке.
3. Положите каждый MEA в индивидуальную стерильную чашку Петри (35 мм х 10 мм) и запечатать фольгой. МЭС могут храниться до использования.
4. Для используемых МЭС: Выдержите МЭС в чашке Петри (35 мм х 10 мм), содержащего 1 мл ферментативной Solutиона (см Материалы таблицу, пункт 6) O / N на орбитальном шейкере при комнатной температуре для удаления биологического материала. Затем продолжите как в шаге 2.1.
   Примечание: Обращаться МЭС с осторожностью с помощью щипцов с обрезиненным советами.

3. Подготовка МЭС для экспериментов культуры

1. Удалите предохранительную фольгу и оставить MEA в чашке Петри (35 мм х 10 мм) в течение всего эксперимента.
2. Покрыть МЭС с раствором, приготовленным в 1.1: Используйте холодный 200 мкл кончиком пипетки (хранили при -20 ° C) до пипеткой 50 мкл раствора для покрытия к каждому MEA, покрывая всю площадь электрода.
3. Разрешить МЭС пальто в течение 30 мин до 1 ч при комнатной температуре.
4. Удалите раствор для нанесения покрытия с помощью пипетки. Применить 100 мкл культуральной среды с добавлением 10% FBS и 5 нг / мл BDNF и не оставить его при комнатной температуре, пока покрытие ткани.
5. Место 2 чашки Петри, содержащие МЭС с покрытием в большую чашку Петри (94 мм х 16 мм) и добавить третий небольшую чашку Петри, содержащую 1,5мл фосфатно-буферном солевом растворе (ФБР) для увлажнения воздуха.
   Примечание: Добавление небольшую чашку Петри (этап 3.5), содержащий PBS имеет решающее значение, чтобы значительно уменьшить испарение культуральной среды.

4. спирального ганглия Вскрытие

Примечание: Гросс рассечение может быть сделано за пределами ламинарный (шаг 4.1 до 4.4). Для тонкой рассечение стерильных условиях (ламинарный поток капот) являются обязательными (начиная с шага 4.5).

1. Эвтаназии животных (5-7 день старых мышей) путем декапитации без предварительного анестезии.
2. Стерилизовать голову опрыскиванием 70% -ным этанолом.
3. Держа голову, разорвите соединение между кожей и черепом с острым / острым ножницами вдоль сагиттальной линии.
4. Вырезать череп сагиттальной и извлечь мозг, используя острый / тупой стороной ножниц.
5. Нарезать височных костей из черепа и поместить те, в чашку Петри, содержащую стерильный лед холодный Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS).
6. Использование dissecционный микроскоп, рассекают барабанной буллу с использованием тонких щипцов и изолировать внутреннее ухо.
7. Удалите кости улитке, с использованием тонких щипцов.
8. Удалите винтовую связки и полоской vascularis (SV) вместе, удерживая пинцетом базальную часть спирального ганглия (SG) и SV и медленно разматывать SV от основания -в-вершине
9. Изолировать орган Корти (OC), СГ и Modiolus (рис 1A - C)
10. Отделить OC от SG и Modiolus, удерживая пинцетом базальную часть SG и OC и медленно разматывать OC от основанием к вершине.
11. Вырежьте боковые эксплантов ( от 200 до 500 мкм в диаметре) из спирального ганглия все еще прикреплены к Modiolus (рис 1D) с помощью щипцов и микро скальпелем.

5. спирального ганглия эксплант на МЭС

1. Поместите два спиральных эксплантов ганглиев рядом с электродами на СМЭ предварительно приготовленной с 100 мкл культуральной среды.
2. Поместите орган Корти примерно 5 мм от площади электрода.
3. Используйте пинцет, чтобы прикрепить эксплантов и орган Корти на СМЭ, избегая при этом повреждения ткани.
4. Поместите МЭС осторожно в инкубатор и культуры при 37 ° С и 5% СО _2. На следующий день, визуально проверить, что эксплантаты приложили к СМЭ.
   Примечание: Если эксплантаты не прилагается O / N, они редко делают это в течение ближайших дней. OC помещается рядом с культурой для трофической / нейротрофического поддержки.
5. Добавляют 100 мкл культуральной среды, содержащей 10% FBS и BDNF в день в течение 5 последовательных дней.
6. На 6-й день добавляют 2 мл культуральной среды, содержащей 10% FBS и 5 нг / мл BDNF и культуры ткани в течение еще 13 дней.

6. Электрофизиологические записи по расследованию спонтанным и электродный Стимуляция Зависимая активность

1. Вымойте MEA культуру с внеклеточной таклюция, полученного на стадии 1.3, при комнатной температуре.
2. Сухие контакты с тканью и установите MEA на установке MEA.
   Примечание: Чтобы сохранить культуру влажной во время монтажа, добавить небольшую каплю внеклеточного раствора к культуре.
3. Добавьте 300 мкл раствора внеклеточной и ждать в течение 10 минут перед записью, чтобы позволить системе стабилизации.
4. Запись спонтанной активности в течение 2 мин со всех электродов, нажав на кнопку записи программного обеспечения / приобретения и идентификации записи электродов.
5. MEA электрод стимуляции: Выберите амплитуду / длительность / форму стимула на соответствующее программное обеспечение и применить к нескольким электродам последовательно , как описано ^13. Выберите электроды, основанные на них, показывающие спонтанную активность (как на этапе 6.4). Запись от всех остальных электродов.
6. Для исключения стимуляции артефакт, стимулируют из того же электрода 10 раз. Если культура отвечает по крайней мере, 8 из 10 раз, то можно предположить, какПоложительный ответ на электрод индуцированной стимуляции.
7. Чтобы определить фоновый шум, применять тетродотоксин (ТТХ) к cultureat в концентрации 1 мкМ, чтобы блокировать напряжения натриевых каналов и запись в течение 2 мин. Используйте эту функцию для выполнения шипа обнаружения (7.1 и 7.2).

7. Анализ данных

Примечание: анализ данных был ранее описан подробно в ⁶ и ^5. Для специфики на программное обеспечение , используемые в данном исследовании см Материалы Таблица, пункт 7.

1. С помощью соответствующего программного обеспечения обнаружения спонтанной активности для каждого электрода, использующего детектор на основе стандартных отклонений и последующем дискриминатора. Эта процедура описана в ^6. Активность выступает как быстрые броски напряжения (<5 мс).
2. Выберите пороговое значение, что приводит к отсутствию активности при анализе ТТХ обработанного samples.Adapt пороговое значение для каждого эксперимента, чтобы различать ложных POSITIVе и ложноотрицательных обнаружений.
3. С помощью соответствующего программного обеспечения наблюдения за обнаруженной нейронную активность каждого электрода в виде растрового сюжета в соответствии со стандартными процедурами (смотри рисунок 2A - C).
4. Определить и показать общую сетевую активность путем суммирования всех обнаруженных событий в пределах скользящего окна 10 мс, смещенные с шагом 1 мс.
5. Обнаружение стимуляции индуцированной активности путем отображения необработанных данных с использованием соответствующего программного обеспечения для анализа. Определить отдельные шипы отсутствует вручную. Одиночные шипы появляются как быстрые броски напряжения, возникающие после стимуляции артефакта (стрелка головы на рисунке 2Е). Пример показан на рисунке 2Е.
6. В зависимости от эксперимента, анализировать количество реагирующих электродов, пороговое значение , необходимое для достижения ответа, количество потенциала действия на электродах и других интересующих параметров ^5.

8. Tissue Фиксирование и Иммunohistochemistry

Примечание: Процесс окрашивания уничтожит МЭС. См таблицу материалов (пункт 4) для реагентов.

1. Сразу же после записи мыть культур с температурой 37 ° С теплым PBS три раза. Выбросите PBS и применить 4% параформальдегида (PFA) (в PBS), предварительно нагретый до 37 ° С в течение 10 мин.
   ВНИМАНИЕ: PFA является токсичным. Работа в химической капюшон с соответствующей защитой и сброшенных решения в соответствии с руководящими принципами.
2. Промыть Культуру трижды PBS и блок с 2% -ным бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS (0,01% Тритон-X100) в течение 2 ч.
3. Добавить первого антитела (анти-βIII тубулине, туй антитело), ​​разведенного в PBS (2% BSA и 0,01% Triton-X100) и оставить O / N при температуре 4 ° С. Вымойте культуры три раза PBS.
   Примечание: С этого момента держать образец в темноте, как можно чаще, чтобы свести к минимуму обесцвечивание вторичного флуоресцентно-меченых антител.
4. Добавить вторичные антитела, разбавленный в PBS (2% БСАг 0,01% Тритон-Х100) и инкубируют в течение от 1 до 2 ч при комнатной температуре. Для того, чтобы окрасить ядра добавить 1: 10000 DAPI (1 мг / мл запаса) в течение 10 мин.
5. Промыть три раза PBS и смонтировать образцы назад к тонким промахов крышки (24 х 50 мм ²⁾ с использованием монтажной среды (см Материалы таблицу, пункт 4). Изображение с помощью флуоресцентного микроскопа с 5-кратным и 20-кратным увеличением.

На рисунке 1 приведена процедура для изоляции тканей, подготовки и культуры на СМЭ. Мы покажем последовательные стадии рассечения тканей , чтобы изолировать спирального ганглия (SG) из сенсорного эпителия органа Корти (OC) и полоской vascularis (SV) и прилагаемые к нему спиральной связки (Рисунок 1 - C). Спирального ганглия эксплантаты (3-4 числа) срезают с микро-ножниц из ганглия , как схематически показано на рис 1D и размещены на MEA (рис 1E), поверх электродных занимаемой площади (2,2 мм 2). ОК размещается в непосредственной близости, за пределами поверхности электрода. Рост культуры можно наблюдать во времени (рис 1G). Принципиальная схема протокола показан на рисунке 1F. Электрофизиологические активность может быть обнаружена через 6 дней культуры, которые увеличивают с длительным временем культивирования. Мы гecommend оценки 18 -й день культуры , которые производят значительно более высокие количества регистрирующих электродов по сравнению с более ранними временными точками 5.

Рисунок 1. Клеточные культуры подготовки. (A) свеже расчлененный мыши внутреннее ухо. Белая пунктирная линия указывает местоположение улитке, черная пунктирная линия указывает на вестибулярный область. (Б) Мышь внутреннее ухо после снятия кохлеарного костистых стенки. Кохлеарные повороты обозначены белыми пунктирными линиями. (C) спирального ганглия (SG) и Modiolus, орган Корти (OC) и полоской vascularis (SV) и спиральные связок показаны после рассечения. (D) Схема SG и OC Вскрытие и подготовка SG эксплантов {адаптировано из фигурного 5 с одобрения от издателя}. (Е) Иллюстрация многозвенных массива электродов , используемых в данном исследовании. ПерешифроватьЭлектроды организованы в виде прямоугольной сетки в центре и занимают площадь 2,2 мм 2. 4 заземляющих электродов и боковые контакты иллюстрированы. (F) Схема протокола культуры. Записи выполняются в день 18. (G) репрезентативные изображений (светлое поле изображений) и схем SG эксплантов на MEA мониторинг в культуре в 1 -й день, 6 и 18. Масштабные полоски = 400 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию эта фигура.

Спонтанная активность может быть обнаружена на СМЭ и показан в виде растрового участка, на котором каждая линия сюжета представляет обнаруженный всплеск. Характерным примером показывающий спонтанную активность , обнаруженный из нескольких электродов (разных цветов на графиках) показан (фиг 2А, 2В и 2С).

(рис 2D), 5 ответившие электроды (красные следы) и не отвечающие электроды (синие следы) показан на рисунке 2Е. Для этих экспериментов один электрод был использован для стимуляции и всех остальных электродов для записи. Одиночные потенциалы действия появились 1 мс после стимуляции артефакта (черная стрелка головы). МЭУ может быть иммунологически в конце процедуры с целью оценки охвата нейрональных процессов по площади электрода. Электрод , отмеченная зеленым на рисунке 2F использовался для стимуляции, а электроды , указанные в красном цвете были использованы для записи ответов (Рисунок 2E).

Рисунок 2. Запись данных на СМЭ. (A </ Сильный>) Следы оригинальных записей шести из 63 электродов, показывающих спонтанную активность. (B) Растр участок из шести электродов фигуре 2А после обнаружения пика. Каждый столбик представляет собой один потенциал действия. (С) Растровое участок , включая все электроды (как в А и Б) Активность фиксируется от 63 электродов (каналов номер 0-63) в течение 2 мин. (D) двухфазный стимул общей продолжительностью 80 мкс и амплитудой 80 мкА использовали для стимуляции культуры от одного электрода (E58 на рисунке 2F). (E) Представитель пример необработанных данных , полученных следов после стимуляции от электрода 58 , показывающий потенциалы действия (красные следы) или без ответов (синие следы) после стимуляции (черная стрелка-голова). (F) Спиральный культура ганглий на MEA иммуноокрашиванию для нейронального маркера туй (зеленого цвета) в конце эксперимента , чтобы визуализировать нейро NAL покрытие площади электрода {фигура заимствована из 5 с согласия издателя}. Электрод 58 используется для стимуляции обозначается зеленым цветом, ответившие электроды обозначены красным цветом. Шкала бар = 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

И, наконец, установка MEA позволяет для изучения возможной модификации поверхности электрода, что может привести к увеличению чувствительности записи. Два коммерчески доступные MEA электроды были использованы в данном исследовании с двумя различными платиновых поверхностей: Серый платины (Серый Pt), состоящий из 150 нм толщиной слоя Pt (сопротивление: 400 кОм / 1 КГц) и Black Platinum, (черный, Pt), полученный методом электрохимического осаждения Pt в конце микро-процесса изготовления (импеданс: 20 кОм / 1 кГц). См материалы таблица (пункт 6) для деталей.

Рисунок 3. Сравнение Grey против электродов Black Pt. Два типа электродов (серый и черный Pt), сравнивали бок о бок с использованием 12 независимых МЭС культуры, 6 на каждого типа MEA. (A) Общее число повторноствующие электроды на эксперимента. (В) Амплитудный порог , чтобы вызвать реакцию, измеренная с помощью независимых 30-35 пар электродов в 6 независимых экспериментах MEA показано. Данные представлены в виде среднее +/- SD. (Т - критерий Стьюдента р <0,001) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Авторам нечего раскрывать.