Капиллярный электрофорез Контролировать Peptide прививкой на хитозана пленок в режиме реального времени

Бесплатное решение капиллярного электрофореза (CE) представляет собой метод , который отделяет соединений в растворах на основе их заряда к трению отношением ^1,2. Отношение заряда к размеру часто упоминается в литературе, но это упрощение не относится к полиэлектролитов, в том числе полипептидов в этой работе, а также было показано , чтобы не подходить для небольших органических молекул ^3. СЕ отличается от других методов разделения, в том, что она не имеющих стационарной фазы, только фоновый электролит (обычно буфер). Это позволяет технику быть устойчивой в своей способности анализировать широкий спектр образцов со сложными матрицами ⁴ , таких как растительные волокна ^5, брожения варит ⁶ прививаемых на синтетических полимеров ^7, образцы пищи ^8, и практически не растворимые пептиды ⁹ без утомительной подготовки образцов и очистки. Это особенно важно для сложных полиэлектролитов, которые имеют проблемы растворения (ыUCH как хитозан ¹⁰ и геллановой камеди ¹¹⁾ и , следовательно , существуют в виде агрегированных или осаждают в растворе и успешно проанализированы без фильтрации проб. Кроме того, анализ сахара в сухих завтраках участвует инъекционного образцов с частицами образцов злаковых завтрака осаждают в воде ^8. Это также распространяется на анализ разветвленных полиэлектролитов или сополимеров ^12,13. Обширная работа также была завершена в разработке методов CE специально для анализа белков для протеомики ¹⁴ хирального разделения природных или синтетических пептидов ¹⁵ и микрочипов разделений белков и пептидов ^16. Поскольку разделение и анализ происходят в капилляр, только небольшие объемы пробы и растворители используют , что позволяет CE иметь более низкую стоимость , чем другие бега методами разделения , в том числе хроматографии ^5,6,17. Поскольку разделение с помощью CE быстро, это позволяет Monitoкольцо кинетики реакции. Это было продемонстрировано в случае прививкой пептидов на хитозана пленок для улучшения адгезии ¹⁸ клеток.

Хитозан представляет собой полисахарид , полученный из N -deacetylation хитина. Хитозан пленки могут быть использованы для различных биомедицинских применений , таких , как Биоадгезивы ¹⁹ и субстратов для роста клеток ^18,20, вследствие биосовместимости хитозаном в ^21. Прикрепление клеток к специфическим белкам внеклеточного матрикса, таких как фибронектин, коллагены и ламинин, напрямую связана с выживанием клеток ^22. Следует отметить, что различные типы клеток, часто требуют прикрепление к различным белкам внеклеточного матрикса для выживания и нормальной работы. Прикрепление клеток к хитозана пленок было показано, повышена за счет прививке фибронектина ^23; Тем не менее, подготовка, очистка и прививка таких больших белков не является экономически жизнеспособным. В качестве альтернативы ряд небольших пептидов ВГАе было показано, чтобы иметь возможность имитировать свойства больших белков внеклеточного матрикса. Например, пептиды , такие как фибронектин миметики RGD (аргинин - глицин - аспарагиновая кислота) и RGDS (аргинин - глицин - аспарагиновая кислота - серин), были использованы для облегчения и увеличения прикрепление ²⁴ изолята. Ковалентная прививка RGDS на хитозана пленок приводит к улучшению прикрепление клеток для клеток , известных прикрепиться к фибронектина в естественных условиях ^18. Подставив более крупные белки любит фибронектин с меньшими пептидами, которые имеют ту же функциональность обеспечивает значительное снижение затрат.

Здесь пептид прививкой к хитозана проводили , как ранее опубликованную ^18. Как было показано ранее, этот подход обеспечивает простую и эффективную прививка с использованием сочетающих агентов EDC-HCl (1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимида) и НГС (N -hydroxysuccinimide) для функционализации карбоновой кислоты RGDS быть привитыхитозан фильм. Два преимущества этого метода является то, что прививка не требует какой - либо модификации хитозана или пептида, и оно осуществляется в водной среде , чтобы максимизировать совместимость с будущими приложениями для культивирования клеток ^18,20. Как можно заряжать сочетающие агенты и пептид, СЕ является подходящим методом для анализа кинетики реакции. Важно отметить, что анализ кинетики реакции через CE позволяет осуществлять мониторинг в режиме реального времени реакции прививки, и, таким образом, позволяет одновременно оптимизировать и количественной оценки степени прививки.

В то время как это обычно не нужно, результаты анализа CE могут быть проверены в автономном режиме с помощью прямого измерения пептида прививкой на хитозана пленок с использованием твердотельного ЯМР (ядерный магнитный резонанс) спектроскопии ^25,26 , чтобы продемонстрировать ковалентной прививание пептида на пленку ^18. Тем не менее, по сравнению с твердотельной ЯМР-спектроскопии, в реальном масштабе времени анализ, представленныйCE позволяет количественно оценить потребление пептида в реальном времени и, таким образом, способность оценивать кинетику реакции.

Вышеупомянутый способ прост и позволяет проводить анализ в режиме реального времени пептида прививки на хитозана пленок с непрямым квантификации степени прививки. Продемонстрированный метод может быть расширен, чтобы в реальном масштабе времени количественной оценки различных химических реакций, как долго, как реагентов или продуктов для анализа могут быть заряжены.

1. Получение хитозана пленок

1. Взвешивают 2 г ледяной уксусной кислоты, полный до 100 мл сверхчистой воды.
2. Отвешивают 1,7 г хитозана порошка, добавляют 100 мл 2% м / м уксусной кислоты водного раствора. Смесь перемешивают в течение 5 дней с мешалкой и магнитной мешалки при комнатной температуре либо покрытой алюминиевой фольгой или в темноте.
3. Центрифуга хитозана дисперсии при 1076 х г при 23 ° С в течение 1 часа. Собирают супернатант с помощью шприца и удалите осадок.
4. Для каждого фильма, аликвоты 10 мл хитозана суспензии в 9 см пластиковой чашке Петри при комнатной температуре. Оставьте фильмы, покрытые высохнуть в течение не менее 7 дней.
5. С помощью ножниц вырезать сухие пленки в 1 х 1 см квадратов. Примечание: Эксперимент может быть приостановлена ​​на данном этапе.

2. Подготовка фосфатно-буферном солевом растворе (ФБР)

1. Взвесить 8 г хлорида натрия, 0,2 г хлорида калия, 1,44 г фос динатрия водородаФейт и 0,24 г дигидрофосфата калия.
2. Растворите эти химикаты отвешивают в 800 мл сверхчистой воды и титруют раствор концентрированной соляной кислотой до рН 7,4.
   Примечание: Эксперимент может быть приостановлена ​​на данном этапе.

3. Приготовление 75 мМ бората натрия с буфером при рН 9,2

1. Взвесить 3.0915 г борной кислоты. Растворите его в 75 мл сверхчистой воды.
2. Титрование раствора борной кислоты до рН 9,2 с помощью раствора гидроксида натрия в концентрации 10 мкМ или выше.
   Внимание: концентрированные растворы гидроксида натрия являются коррозионными и должны работать в перчатках.
3. В комплекте с сверхчистой водой, чтобы получить 100 мл раствора. Это дает 500 мМ бората натрия буфера при рН 9,2.
4. Развести 500 мМ бората натрия буфера с сверхчистой водой до 75 мМ буфера бората натрия. Примечание: Эксперимент может быть приостановлена ​​на данном этапе.

4. Получение хитозана Fiдля LMS реакции привитой сополимеризации

1. Полоскание 10 квадратных хитозана пленок (1 х 1 см) в 5 мл PBS в течение 2 ч в чашке Петри при комнатной температуре.
2. За это время подготовить и утвердить капиллярный электрофорез инструмента (этап 5).

5. Подготовка и проверка на капиллярный электрофорез Инструмента

1. Приготовьте 43,5 см голую кварцевую капиллярную с внутренним диаметром 50 мкм (43,5 см является общая длина, эффективная длина для окна обнаружения, как правило, 35 см) путем ослабления полимера наружное покрытие из капилляра на заданной длине с тупые утвари затем щелкать капилляр.
   1. Создать окно для капилляра с помощью зажигалки для сжигания полимерного покрытия на 8,5 см от входа и после того, как он остынет протрите его с этанолом. Ожог покрытие капилляра на каждом конце в течение нескольких миллиметров с зажигалкой, и после того, как он остынет протрите его с этанолом.
   2. Место капиллярная ИНСИде окна обнаружения и установить его в капиллярной кассете, поместив его на равных длинах в входе и выходе и наматывая его шпинделей кассеты. Затем установите кассету в капиллярный электрофорез инструмента.
2. Установка параметров для каждого метода разделения. В программном меню выберите пункт "метод", затем "редактировать весь метод". Установите температуру, время, напряжение и чаш, используемые для разделения (например, 25 ° C, 10 мин, 30 кВ).
   1. В разделе предобуславливание установите последовательные притоки: 10 мин с помощью 1 М гидроксида натрия (в воде), 5 мин с помощью 0,1 М гидроксида натрия (в воде), 5 мин сверхчистой водой и 5 мин с 75 мМ буфера бората натрия при рН 9,2 в течение первого способа серии анализов.
   2. Для последующих методов, установить набор последовательные притоки в секции предварительного кондиционирования: 1 мин с помощью 1 М гидроксида натрия (в воде), 5 мин с 75 мМ буфера бората натрия при рН 9.2.
   3. В разделе впрыска, установить параметры для гидродинамической инъекции с давлением 30 мбар в течение 10 сек для всех методов. В секции разделения, устанавливают условия разделения до 30 кВ при 25 ° С в течение 9 мин для всех методов.
      Примечание: Обратитесь к руководству пользователя конкретного инструмента CE в качестве процедуры для работы с прибором CE может отличаться у разных производителей. Готовят раствор гидроксида натрия 1 М в день.
3. Вводить и отделить нейтральный внутренний стандарт (10 мкл 10% об / об диметилсульфоксид (ДМСО), в водном растворе в 450 мкл 75 мМ буфера бората натрия). Затем вводят и разделить таким же образом стандарт oligoacrylate (растворенного в сверхчистой воде при 10 г ∙ л ^-1, см Перечень материалов) , чтобы проверить правильность капилляра. Пауза последовательность здесь, пока реакция прививка не готов к запуску.

6. Прививка RGDS на Хитозан Film

1. Взвесить пептида (1 мг УВАЖЕНИЕМ)и соединительные средства (3 мг EDC-HCl и 2 мг NHS).
2. 2 ч после начала хитозана замачивания пленки в PBS, растворить пептид и сочетающих агентов в 5 мл PBS.
   1. Возьмите 50 мкл аликвоты этого раствора. Добавляют 2 мкл 10% об / об ДМСО в воде в качестве внутреннего стандарта нейтрального в аликвоту. Анализ аликвоты с CE (см шаг 7).
3. Удалите 5 мл PBS использовали для промывки хитозана пленок из чашки Петри. Добавляют 5 мл раствора пептида и связывающих агентов в чашку Петри, содержащую хитозана пленок.
4. Накройте чашку Петри с парафиновой пленкой и поместить его на орбитальном шейкере при комнатной температуре. Принимать по 50 мкл аликвоты реакционной среды в установленное время.
   Примечание: Общее время анализа с CE составляет 15 мин, при этом аликвота можно принимать каждые 15 мин (или каждые 30 мин , если две реакции отслеживаются параллельно, и т.д.).
   1. Добавляют 2 мкл 10% об / об ДМСО в воде в качестве внутреннего стандарта нейтрального к каждому Aliquot.
      Примечание: аликвоты должны быть проанализированы с CE, как только они будут приняты (этап 7).
5. Через 4 часа тряски и удаления аликвоты, удалите чашку Петри из шейкера. Удалите реакционную среду из чашки Петри. Добавьте 5 мл PBS для промывания хитозана пленок.
6. Удалите PBS из чашки Петри, промойте хитозана пленку с сверхчистой водой и дайте им высохнуть в течение ночи. Удалите сверхчистой воды и хранить пленки при -20 ° С в пластиковом Петри.

7. Мониторинг прививкой реакции с использованием CE

1. Вдохнуть и отдельные аликвоты реакционной среды немедленно после извлечения из чашки Петри, используя условия анализа, как и в разделе 5.2.
2. После завершения разделений промыть капилляр сверхчистой водой в течение 10 мин. Сушат ее через вровень с пустой флакон (воздух) в течение 10 мин.
   Примечание: Эксперимент может быть приостановлена ​​на данном этапе.

8. Треа данных tment для CE

1. Проверьте правильность каждого разделения, проверяя, что и ток во время разделения и время миграции электроосмотического маркера подвижности (ДМСО в данном случае) сходны с теми, которые использовались дл стандартного разделения oligoacrylate.
   Примечание: до 10-15% вариации приемлемо от ожидаемого значения тока около 50 мкА и миграции временной стоимости 1,3 мин (электрофоретические значения подвижности следует использовать вместо того, чтобы время миграции, если требуется более высокая повторяемость).
2. Для каждого успешного разделения, экспортировать необработанные данные из электрофорез программного обеспечения капиллярного путем выбора определенного набора данных, щелкнув правой кнопкой мыши на экспорт и выбрав соответствующий сигнал.
3. Преобразование исходных данных, записанных с помощью CE (представлены в виде УФ-поглощения в зависимости от времени миграции). Преобразование X-ось (временная миграция т _м) в электрофоретической подвижности ц следующим уравнением 1:
   п 1 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54549 / 54549eq1.jpg "/> (1)
   где L _D длина до детектора, L _T является общая длина капилляра, V является напряжение, и т _EO время миграции нейтрального монете (внутренний стандарт ДМСО в данном случае) ^27.
   Преобразование Y-ось необработанных данных (поглощение в а.е.) к распределению электрофоретических подвижностей W (i) следующим уравнением 2: ²⁸
   (2)

9. Дополнительная характеристика пептидных привитым пленок ¹⁸

1. Вставьте пептидные привитым хитозана пленок, свернутые вокруг себя, в 4 мм твердотельного ЯМР ротора. Наполните ротор с фосфатным буферным солевым раствором для набухания пленок, и закройте ротор. Подождите несколько часов.
2. Анализ фильма с ^{13 <}/ SUP> С ЯМР - спектроскопии ^18.

CE хорошо подходит для мониторинга прививка пептидов (например, УВАЖЕНИЕМ) на хитозана пленок. Подходящие связующие агенты включают в себя EDC-HCl и НГС , которые активируют пептидом привит на хитозана (рисунок 1). СЕ способен отделить различные молекулы, представляющие интерес из реакционной среды. Для назначения пиков на electropherogram, чистые УВАЖЕНИЕМ, EDC-HCl и НГС были распущены, впрыскивают и разделяют по отдельности. После пика задания, реакционную среду вводят и различные реагенты были идентифицированы (рисунок 2). ВДГ-HCl , реагирует в виде побочного продукта ЭДГ-HCl (3 - (((этиламино) (гидрокси) метилен) амино) - N, N -dimethylpropan-1-амин). Диметилсульфоксиде (ДМСО), используется в качестве внутреннего стандарта для цветоделения CE. Хитозан присутствует в привитой эксперименте в виде нерастворимых пленок и, таким образом, не вводили или наблюдается в СЕ. Обратите внимание, что для всех исходных данных, тон записал ось времени миграция превращается в электрофоретической подвижности оси (уравнение 1) , а ось поглощения УФ в распределении электрофоретической подвижности W (i) (уравнение 2).

По мере того как аликвоты берутся из реакционной среды, их помещают в прибор CE и впрыскивают. Степень реакции контролируют путем уменьшения пика , связанного с RGDS (рисунок 3). Кроме того, можно видеть, что пик EDC-HCl, уменьшается, а пик увеличивается ЭДГ-HCl в течение долгого времени. Важно отметить, что нет никакого сигнала, который может быть назначен к продукту из боковой реакции пептида, таким образом, предполагается, что УВАЖЕНИЕМ удаляется из реакционной среды, в настоящее время прививают на хитозана пленку. Наложенные электрофореграммы (фиг.3А) позволяют количественно оценить потребление пептида от начала до конца реакции. Следует отметить, чтохотя кинетика первоначально была измерена в течение 18 часов (рис 3б), 4 ч, является достаточной для реакции протекать в его максимальной степени. Для того, чтобы позволить количественному оптимальный объем впрыска необходим для обеспечения сигнала к шуму , достаточно высока , в то время как предотвращение перегрузки (фиг.4А) и в случае RGDS, инъекции должны быть завершены в режиме реального времени , чтобы предотвратить поликонденсации (фиг.4В ).

Методика CE на основе описанной здесь, чтобы проанализировать пептид прививкой к хитозана пленок быстро и просто; Тем не менее, это не количественную оценку процесса прививки непосредственно. ЯМР-спектроскопии используется для демонстрации прививка; Это измерение не может быть сделано в режиме реального времени (как правило, это занимает несколько часов), и должна быть завершена постреакционной. Качественное сравнение хитозана пленок до и после прививки показывает успешную прививку пептидов Throтьфу появление сигнала на 70 частей на миллион в привитых пленках , соответствующих амидной связи между хитозаном и пептида (рисунок 5).

Рисунок 1. Схема реакции прививки. Химическая схема реакции , показывающая активацию EDC-HCl и НГС кислотной функциональной группы карбоновой RGDS с последующим его прививка на поверхности пленки хитозана в. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры ,

Рисунок 2. Назначение Пик частиц , присутствующих в реакционной среде. А. Разделение и пик назначение для решений частично гидролизованного EDC -HCl (Розовый), УВАЖЕНИЕМ (красный), ГСЗ (синий), а также для PBS (фиолетовый) и реакционную среду (черный). B. электрофореграммы из реакционной среды (черный) , представленный как функция времени миграции (электрофоретическая мобильность должна быть использована для преодоления плохой повторяемости во времена миграции). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Контроль CE потребления УВАЖЕНИЕМ. (A) , облицованная пептидные пики при времени реакции 30 мин (фиолетовый сплошная линия), 60 мин (пурпурного прерывистая линия), 90 мин (синяя сплошная линия), 120 мин (зеленая пунктирная линия), 150 мин (красная сплошная линия) и (в) кинетика прививкой завершена в течение 18 часов в повторах (квадрат и круг).pload / 54549 / 54549fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. Наложенные пептидные пики в реакционной среде , показывающие результаты неоптимальные (А) Различная (гидродинамическая) время впрыска:. 5 сек (синяя линия), 10 сек (черная линия), 20 сек (красная линия) и 30 сек (пурпурная линия) , (B) реакционной среды остаются во флаконе CE в течение длительного периода времени перед инъекцией: 30 мин . (Красная линия) и 90 мин (синяя линия) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5. 13C опухшие состояния ЯМР - спектры пленок хитозана. Сравнение пленок до (черная линия) и после (синяя линия) пептида прививка. Сигналы , присутствующие только в спектре , зарегистрированного после прививки обозначены звездочками. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.