Эта рукопись описывает простой и быстрый экспериментальной процедуры для определения белок белковых взаимодействий на основе измерения Люцифераза деятельности.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Assay Imaging Люцифераза дополнения в листьях Nicotiana benthamiana временно определения динамики взаимодействия протеин протеина
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Белок белковых взаимодействий являются основополагающие механизмы для передачи сигнала в наиболее клеточных процессов; Таким образом идентификация мониторинга динамики взаимодействия белков и Роман протеин взаимодействия пары представляют особый интерес для выявления как растения реагируют на факторы окружающей среды и/или развития сигналов. Множество подходов были разработаны для изучения взаимодействия протеин протеина, в vitro или в естественных условиях. Среди них недавно созданной Люцифераза комплементарности изображений (LCI) пробирного является простой и быстрый метод для демонстрации в естественных условиях белок белковых взаимодействий. В этот assay белок или белков B сливается с амино терминал или карбоксильных терминал половины Люцифераза, соответственно. Когда белок взаимодействует с белком B, две половинки Люцифераза будет преобразован для формирования функциональных и активных Люцифераза фермента. Люцифераза активности могут быть записаны с помощью люминометра или ПЗС камеры. По сравнению с другими подходами, LCI assay показывает белок белковых взаимодействий, как качественно, так и количественно. Agrobacterium инфильтрации в листьях Nicotiana benthamiana является широко используемой системой для переходных белков. С сочетание LCI и переходных выражения эти подходы показывают, что физическое взаимодействие между КС1 и SPA1 было постепенно сокращено после Жасмонат лечения.
Введение
Для того, чтобы координировать роста с окружающей средой, растения эволюционировали элегантный сигнальные пути чувство, передают и реагировать сигнализации сигналы. Как бегунов в эстафете белки являются необходимыми игроков в сигнальной трансдукции растений. Было широко признано, что взаимодействия протеин протеина (PPI) играет важную роль для сотовой связи. Все зависит от физического взаимодействия между целевого белка и его модификация ферментов фосфорилирование белков, ацетилирования и деградации. Например Жасмонат зим домен белка (JAZ) семьи белки взаимодействуют с транскрипционным фактором MYC2 и подавить его транскрипционный анализ активности1<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка растений (8 недель)
- Положите 50 Nicotiana benthamiana семян в одной из труб microcentrifuge 1,5 мл, содержащих 1 мл 5% NaClO и 0,1% раствор Тритон X-100 (V/V) и оставить на 5 минут, чтобы стерилизовать семена.
- Сполосните семена с стерильной водой 5 раз и приостановить семена в 200 мкл стерильной воды.
- Тщательно место отдельных семена на поверхность среды (1 L: 1 x фотосинтетическую & Скуг соли, 10 г сахарозы, pH 5,8 (KOH), 1% агар) MS-агар с тонкой советы и магазин среднего пластин в 4 ° C для 3 дней для синхронизации прорастания.
Примечание: Во избежание микробного загрязнения, выполните этот шаг на лавочке чист....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В этом протоколе Люцифераза дополнения для изучения белок белковых взаимодействий в естественных условиях, в том числе рост растений, проникновения табака и пробирного Люцифераза можно выделить три основных этапа. Наиболее важным шагом в этом протоколе проникновения жидкости A. tumefaciens в N. benthamiana листья (рис. 1).
Вот пример полезности этой техники, подтверждающие.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол, описанные здесь простой и воспроизводимый для изучения в естественных условиях белок белковых взаимодействий и особенно подходит для выявления динамики взаимодействия белков под экзогенными лечения. Ключевым шагом в этот assay является проникновение N. benthamiana . Для обеспечения успеха инфильтрации, растения должны быть очень здоровым. Еще одним важнейшим фактором является когда проверить Люцифераза активности после проникновения. Существует не правильный ответ на этот вопрос. Исследователи.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Эта работа была поддержана естественных наук фонд провинции Цзянсу (BK20140919), Национальный фонд Китая естественных наук (31470375), приоритет академические программы развития Цзянсу высших учебных заведений и Цин Интернет проекта.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>раствор для трансформации | |||
| 10 мМ морфолинэтансульфоновая кислота | VETEC | V900336 | |
| 27,8 мМ глюкозы | VETEC | V900392 | |
| 10 мМ MgCl2× 6H2O | VETEC | V900020 | |
| 150 μ М Ацетосирингон | ОЛДРИЧ | D134406 | |
| pH 5,7 | |||
| <сильный>Люциферин рабочий буфер | |||
| 5 мМ Люциферин калийная соль | GOLD BIOTECHNOLOGY | LUCK-100 | |
| 0,025% Triton X-100 | VETEC | V900502 | |
| H2O до 10 мл |
Ссылки
- Thines, B., et al. JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling. Nature. 448, 661-665 (2007).
- Chini, A., et al. The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling. Nature....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
