Assay Imaging Люцифераза дополнения в листьях Nicotiana benthamiana временно определения динамики взаимодействия протеин протеина

Для того, чтобы координировать роста с окружающей средой, растения эволюционировали элегантный сигнальные пути чувство, передают и реагировать сигнализации сигналы. Как бегунов в эстафете белки являются необходимыми игроков в сигнальной трансдукции растений. Было широко признано, что взаимодействия протеин протеина (PPI) играет важную роль для сотовой связи. Все зависит от физического взаимодействия между целевого белка и его модификация ферментов фосфорилирование белков, ацетилирования и деградации. Например Жасмонат зим домен белка (JAZ) семьи белки взаимодействуют с транскрипционным фактором MYC2 и подавить его транскрипционный анализ активности^1,2. Учитывая важное значение PPI крупномасштабные белков, которые были interactomes в растениях изучить недавно^3,4,5. Эти interactome результаты далее свидетельствуют о сложных регулирования сети, которая координирует различные клеточные функции.

Есть некоторые установленные подходы для наблюдения за PPI. Assay дрожжей два гибридных (Y2H) является наиболее широко используемым методом для обнаружения PPI. Y2H легко выполнить и подходит для быстрой проверки для изучения взаимодействия протеина. Y2H также широко используется для скрининга неизвестные взаимодействия партнеров для определенного протеина интереса. Однако потому что Y2H полностью осуществляется в дрожжи, он не может отражать реальный сценарий в заводе клетки и приносит высокий уровень ложных положительных. Еще одна аналогичная стратегия является выпадающее assay. В общем две белки являются выразил и очищенного от клеток Escherichia coli и затем смешанные и прикол для обнаружения взаимодействия протеина. Хотя этот метод не требует много времени, он не может получить в естественных условиях результаты взаимодействия либо. Для целей взаимодействия в естественных условиях co иммунопреципитация (co-IP) является наиболее популярным assay, которое требует высокого качества антитела к immunoprecipitate протеин интереса и нельзя исключать возможность косвенного ИЦП. Кроме того из-за сложных экспериментальных процедур в co-IP, результаты обычно зависит от индивидуального опыта.

Журналистом воссоздание анализов сильно заранее обнаружения в vivo PPI. Эти методы включают в себя флуоресценции резонанс энергии передачи (ЛАДА)⁶, bimolecular флуоресценции комплементарности (БМФЦ)⁷и Светлячок Люцифераза дополнения изображений (LCI) пробирного⁸. Хотя эти три подхода являются лучше, чем co-IP отразить непосредственно в vivo PPI, ладу и БМФЦ нужны конкретные микроскопы для обнаружения сигналов флуоресценции и не может легко количественно интенсивности взаимодействия. В отличие от LCI использует Светлячок Люцифераза, которая будет светиться после реакцию с его люциферин субстрата. Что еще более важно PPI интенсивности может быть определена из значения Люцифераза деятельности. Таким образом LCI не только указывает ли две белки взаимодействовать или нет, но также предоставляет информацию о динамике взаимодействия после лечения. Хотя есть некоторые установленные методы для контроля взаимодействия динамики (на основе поверхностного плазмон резонанса или термо стабильность смены)^9,10, эти подходы требуют чувствительные инструменты или конкретных маркировки. В отличие от LCI легче выполнить и обнаружить.

Принцип для LCI это амино- и карбоксильной терминал половинки Люцифераза (называется N-Люк или C-люк, соответственно) были слиты с протеин A и B и эти два синтез белков одновременно были выражены в клетках растений. Если протеин A взаимодействует с белком B, затем две половинки Люцифераза будет преобразован для активного Люцифераза фермента. Люцифераза активности могут быть обнаружены с помощью люминометра или ПЗС камеры. Это не является необходимым для получения стабильной трансформантов для LCI; переходных выражение является достаточно, чтобы получить результат высокого качества взаимодействия.

КОЛЬЦО типа E3 убиквитин лигаза учредительного photomorphogenic 1 (КС1) взаимодействует с множеством факторов транскрипции и способствует их деградации через 26S протеасом¹¹. Некоторые из этих факторов транскрипции, ориентированные на КС1 являются положительные регуляторы для photomorphogenesis. В темноте КС1 взаимодействует с супрессорной фитохрома A-105 1 (SPA1), который повышает КС1 E3 деятельности⁸. После восприятие света фоторецепторов будет отменить взаимодействие КС1-SPA1 ингибируют активность КС1 и затем стабилизировать КС1 субстратов^12,,1314. Этот пример иллюстрирует биологическое значение изучения ИЦП и определение динамики PPI.

1. Подготовка растений (8 недель)

1. Положите 50 Nicotiana benthamiana семян в одной из труб microcentrifuge 1,5 мл, содержащих 1 мл 5% NaClO и 0,1% раствор Тритон X-100 (V/V) и оставить на 5 минут, чтобы стерилизовать семена.
2. Сполосните семена с стерильной водой 5 раз и приостановить семена в 200 мкл стерильной воды.
3. Тщательно место отдельных семена на поверхность среды (1 L: 1 x фотосинтетическую & Скуг соли, 10 г сахарозы, pH 5,8 (KOH), 1% агар) MS-агар с тонкой советы и магазин среднего пластин в 4 ° C для 3 дней для синхронизации прорастания.
   Примечание: Во избежание микробного загрязнения, выполните этот шаг на лавочке чистой. Это не необходимо встряхнуть трубку во время стерилизации.
4. Место среднего пластин при условиях нормального роста (22 ° C, 80-90 µmolm^-2s^-1 белый интенсивности света) на 10 дней, а затем перенесите проросшие рассады в почву.
   Примечание: Не забудьте вставить корней рассады в почву и не повреждают корни. Крышка лотка с прозрачной пластиковой крышкой на ночь для поддержания влажности.
5. Растут растения в комнате контролируемого роста на 16/8 ч свет/темно цикла и 70% влажности. 7-недельных растений N. benthamiana готовы к Agrobacteriumtumefaciens инфильтрат (рис. 1А).
   Примечание: Водных растений и контроля вредителей, как необходимо сохранить здоровые растения.

2. Переходное выражение в листьях N. Benthamiana (7-10 дней)

1. Доставить 150 нг плазмид (пробирного управления pEGAD ха-Люк плазмида, пустой вектор и построенных плазмиду для LCI, в данном случае мы использовали pCAMBIA1300-Nluc и pCAMBIA1300-Cluc для плазмида строительства) в A. tumefaciens компетентных клеток штамма GV3101 с стандартные электропорации метод.
2. A. tumefaciens культуры на Бертани Лурия (LB) агар среднего (1 L: 10 г NaCl, экстракт дрожжей 5 g, 10 g Триптон, 1,5% агар) содержащий 50 мкг/мл канамицин и 50 мкг/мл рифампицин на 28 ° C в течение 4 дней.
   Примечание: Выбор антибиотиков зависит от вектора и A. tumefaciens штамм используется.
3. Прививать один сингл A. tumefaciens колонии от каждой плиты в 3 мл LB жидкой среды, содержащей 50 мкг/мл канамицин и 50 мкг/мл рифампицина и погрозит 220 об/мин на 28 ° C в течение 24 ч для распространения культуры клеток.
4. Перевести 75 мкл бактериальной культуры в 15 мл свежего LB жидкой среде содержащие 50 мкг/мл канамицин и 50 мкг/мл рифампицина, разбавляя его на коэффициент 200. Культура бактерий на 220 об/мин при 30 ° C для около 8 часов, до тех пор, пока ОД₆₀₀ составляет от 0.5 до 1.0.
5. Передача A. tumefaciens жидкого культуры в 15 мл пробирок и центрифуги на 4000 x g и 4 ° C на 15 мин удалить супернатант и приостановить гранулы в 15 мл раствора преобразования мыть Пелле.
6. Спина трубки на 4000 x g и 4 ° C на 15 минут и удалить супернатант. Стиральная Повторите еще раз.
7. Ресуспензируйте гранулы в 5 мл раствора трансформации и держать в течение 2 ч при комнатной температуре. Регулировка плотности A. tumefaciens Пелле клеток с решения преобразования до конечной концентрации ОД₆₀₀ 0,5, или смесь двух выборок с равным объемом для тестирования парных белковых взаимодействий.
8. Клеток инфильтрата приостановлено в 4^й до 7^th листья с 1 мл шприц безыгольной (Рисунок 1-B-C). После проникновения немедленно накройте растения черную пластмассовую крышку и установите лоток в темноте в течение 12 ч. После этого растут растения как обычно за 2-4 дня до обнаружения Люк деятельности.
   Примечание: Выберите здоровые листья аналогичного размера. Проникновение в четырех различных зон в один лист является штраф.

3. Определение активности Люцифераза (один день)

Примечание: Существует два способа для мониторинга активности Люцифераза. Один основан на визуализации, и другой — количественно измерить Люцифераза активности.

1. Метод обработки изображений
   1. Отсоединить проникли листьев и поставить весь буклет на носителе MS-агар.
   2. Спрей люциферин рабочего буфера на adaxial поверхность листьев с 50 мл спрей бутылку. Храните материалы в темноте на 5 минут, чтобы утолить auto флуоресценции хлорофилла.
   3. Используйте мычать свет Охлаждаемый ПЗС imaging аппарат (охлаждение до-30 ° C) для захвата изображения (рис. 2). Свет подала Выдержка составляет 50 мс, и время свечения обнаружения составляет 1 мин.
      Примечание: Настройте параметры согласно руководству машины. Более низкие температуры позволит повысить соотношение сигнал шум для улучшения качества изображения.
2. Кроме того измерения люминесценции непосредственно с коммерческой люминометра.
   1. Тщательно вырезать фрагменты листа (около 0,25 см²) из области инфильтрата N. benthamiana листьев и погрузит листа диска в 100 мкл обессоленной воды в 96-луночных белые пластины (рис. 3).
   2. 10 мкл буфера рабочей люциферин и оставить на 5 мин. Затем выполните конкретные процедуры для изучения динамики взаимодействия протеина.
      Примечание: Обнаружить люминесценции с Люминометр в разное время точек для получения Люцифераза деятельности динамики, которые представляют кинетика белок белковых взаимодействий при определенных лечения. Этот метод имеет преимущества для тестирования большое количество белка пар одновременно. Для тех, кто без коммерческой Люминометр изучить распространённость белка Люцифераза, Западная помарка, поэтому обратитесь к quantitively деятельности люк. Если свет не обязательно требуется, просто держать пластину в Люминометр и измерения люминесценции в разное время точках. В противном случае переместите пластины в камере роста во время обнаружения разрыва. Для получения статистически значимых результатов, используйте по крайней мере три биологических реплицирует. Хотя деятельность люк от проникновения различных зон будет варьироваться, их меняющихся моделей согласуются после нормализации.

В этом протоколе Люцифераза дополнения для изучения белок белковых взаимодействий в естественных условиях, в том числе рост растений, проникновения табака и пробирного Люцифераза можно выделить три основных этапа. Наиболее важным шагом в этом протоколе проникновения жидкости A. tumefaciens в N. benthamiana листья (рис. 1).

Вот пример полезности этой техники, подтверждающие Жасмонат, уменьшение взаимодействий КС1-SPA1. Амино- и карбоксильной терминал половинки Люцифераза были слиты с КС1 (КС1-NLuc) или SPA1 (CLuc-SPA1), соответственно. В дополнения функциональных Люцифераза результате КС1-SPA1 взаимодействия. Люцифераза активности был воспроизведен образ CCD камеры (рис. 2), и ферментативной активности могут быть обнаружены с Люминометр (рис. 3). Чтобы исключить возможность что Люцифераза, сам зависит от лечения, полнометражный Люцифераза (Люк) ген был также временно в N. benthamiana листья в качестве элемента управления. Люцифераза деятельность до начала лечения Жасмонат (время 0) был установлен как 1, а затем каждое значение активности Люцифераза, полученные под Жасмонат лечения нормализовался со временем 0 для получения относительного Люцифераза активности (рис. 4). Результаты показали, что КС1-SPA1 взаимодействий (отражение деятельности Люцифераза) постепенно снизилась в темноте, и что лечение JA дальнейшее сокращение их взаимодействия.

Рисунок 1 . Процесс проникновения N. benthamiana . 
(A) Abaxial и adaxial вид растений до проникновения. (B) представитель изображение, чтобы показать протокол инфильтрации. (C) Abaxial и adaxial вид растений после проникновения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 . Визуализации Люцифераза деятельность под ПЗС камеры. 
(A) представитель изображение одного листа N. benthamiana под нормального светового поля. (B) Обнаружение сигналов люминесценции под ПЗС камеры Показать Люцифераза деятельности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

На рисунке 3. Представитель изображение, чтобы показать, как для измерения люминесценции от вырезать лист диски. 
Проникли листьев диски были вырезать и положить в 96-луночных белые пластины для измерения сигналов люминесценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 . Представитель результаты от одной временной Люцифераза дополнения анализа. 
(A) были указаны продолжительность лечения (время) и оригинальные результаты значение люминесценции (Люк деятельность). Существует три независимых репликация для каждого образца. Для подготовки этой диаграммы, Люк активности в различных лечения время точках нормализовался со временем 0 как относительная активность люк.
(B) количественная оценка деятельности относительной люк, показаны КС1-SPA1 взаимодействия в темноте постепенно снизились, которая может быть уменьшена путем дальнейшего лечения JA. В баре ошибка указывает стандартное отклонение (sd). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы не имеют ничего сообщать.