Простая генерация высокой урожайности культуры искусственных нейронов из фибробластов кожи взрослого человека

Разработка эффективных методов лечения неврологических расстройств сдерживаются ограниченным доступом к живые клетки мозга человека для выполнения механистический исследования и функциональных анализов. Около десяти лет назад эта ситуация радикально изменилась с развитием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) технологии^1,2. Это, в сочетании с более глубокое понимание механизмов нейронных дифференциации, происходящих во время нормального человеческого развития, позволила для генерации определены и различных нейрональных подтипы от пациента и болезни конкретного материала. С таким материалом это теперь возможно изучить лежащие в основе неврологических заболеваний и потенциал различных соединений, чтобы облегчить эти патологические особенности³внутриклеточных механизмов.

В то время как iPSCs был революционным в области неврологии, один главный недостаток этих клеток является, что их старения подпись удаляется в процессе перепрограммирования таким образом, что помолодевшим нейрон не сохраняют уязвимость, связанная с старение^4,5,6. Эта особенность нейронов, которые производятся может в конечном итоге решающее значение для изложив многие аспекты внутриклеточных патогенных Каскад, особенно в случае заболеваний, для которых старости является важным фактором риска.

Прямые, нейронные перепрограммирования – это технология, где соматической клетки преобразуется непосредственно в в без прохождения через плюрипотентных промежуточные стадии. Это позволяет для быстрого поколения человеческих нейронов в vitro который может быть как пациента, так и конкретных болезней. Замечательной особенностью прямых перепрограммирования, что начальный возраст донора клеток поддерживается, и с тем, ее уязвимость к процессы старения, таких как увеличил производство Оксидативный стресс^4,7. В результате Син от больных с неврологическими заболеваниями связанные с старения, такие, как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, хорошо подходят для широкого спектра биомедицинских приложений, включая болезни, моделирование, наркотиков скрининговых анализов и токсикологических исследований .

Основные предостережение, что помешало iNs пациентов с нейродегенеративных расстройств широко используется является, что они не являются легко перепрограммировать, и это становится еще более сложным с расширением фибробластов. В результате поколения в клетках в количествах, необходимых для этих типов приложений не был достигнут пока лишь недавно⁸. Теперь мы разработали простой метод для перепрограммирования фибробластов от доноров любого возраста очень эффективным образом. Этот метод сочетает в себе принудительного выражение нейрональных транскрипционных факторов, Ascl1 и Brn2 с нокдаун репрессор белки RE1 глушителей транскрипционного фактора (REST) с помощью одного вектора. Здесь мы описываем различные шаги, ведущие к поколение модулей, преобразованные из фибробластов кожи биопсию пожилых доноров.

Взрослые фибробласты дермы были получены от исследований болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона клиник в центре Джона Ван Geest для ремонта мозга (Кембридж, Великобритания) и используются под местные этические утверждения (REC 09/H0311/88). Дополнительные сведения о процедуре отбора проб биопсии кожи смотрите ссылку⁸.

1. Подготовка фибробластов кожи для перепрограммирования

1. С помощью автоматизированной ячейки, размораживания системы или ванну воды 37 ° C, оттепель взрослых человека фибробластов дермы (aHDFs) и тарелка 200000 в колбу (счетчик с автоматизированной клеток счетчиком) T75 в 10 мл среды фибробластов (см. таблицу 1) при 37 ° C в 5% CO₂.
2. Выполнение полного среднего изменения с фибробластов среднего на следующий день.
3. Изменение среднего фибробластов каждые 3 – 4 дня до 95% confluency клетки.
   Примечание: Один вырожденная настой будет содержать около 1 000 000 ячеек. AHDFs могут быть заморожены построить акции клеточной линии (раздел 2) или непосредственно повторно покрытием готовых для перепрограммирования (раздел 3).

2. Замораживание фибробластов кожи

1. Поместите контейнер контролировать скорость замораживания в коробке со льдом или в холодильнике при температуре 4 ° C.
2. Разбить ячейки с 0,05% трипсина (1,5 мл на колбу T75) при 37 ° C для 3-5 мин.
3. Добавьте средне фибробластов (содержащие плода бычьим сывороточным (ФБС)) для нейтрализации трипсина (3 мл очищаемых за флакон T75) и собирать отдельные ячейки в 15 мл, смыв клетки в колбу дважды.
4. Подсчет количества ячеек, используя счетчик автоматизированных клеток; (рекомендуется) заморозить около 500 000 aHDFs за флакон.
5. Спин вниз клетки на 400 x g за 5 мин.
6. Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл замораживания среды (см. таблицу 1) и передача в криогенных трубку. Место труб непосредственно в контролируемых скорость замораживания контейнер.
7. Храните руемой скорости замораживания аппарат в-80 ° C на ночь. На следующий день, передача трубы в морозильной камере-140 ° C и хранить до тех пор, пока требуется.

3. покрытие для перепрограммирования (день −1)

Примечание: Рекомендуется использовать покрытие желатин для краткосрочных экспериментов (до 30 дней); Кроме того для экспериментов в долгосрочной перспективе рекомендуется начать на поли L-орнитин, фибронектин и Ламинин (PFL) покрытие.

1. 60 мин до покрытие aHDFs для перепрограммирования, пальто 24-ну плита с 0,1% желатина (250 мкл/а) и Инкубируйте на 37 ° C.
2. Аспирационная фибробластов средство на aHDFs. Мыть раз с DPBS. Разбить ячейки с 0,05% трипсина (1,5 мл на колбу T75) при 37 ° C для 3-5 мин.
3. Добавьте фибробластов среднего для нейтрализации трипсина (3 мл очищаемых за флакон T75) и собирать отдельные ячейки в 15 мл, смыв клетки в колбу дважды.
4. Спин вниз клетки на 400 x g для 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл среды фибробластов.
5. Подсчет количества ячеек, используя счетчик автоматизированных клеток (для обеспечения хорошего качества преобразования убедитесь, что жизнеспособность клеток выше 90% с Трипановый синий окрашивание).
6. Для полного 24-ну плита готовить подвеска 1,320,000 клеток в 13,2 мл среды фибробластов добиться приостановления 100000 клеток/мл среды (или 55 000 клеток/колодец в 550 мкл среды фибробластов, умноженное на количество скважин необходимо).
7. Аспирационная желатин с плиты и мыть дважды с DPBS. Добавить 500 мкл суспензии клеток в каждой скважине и инкубировать на ночь при 37 ° C в 5% CO₂.

4. вирусные трансдукции (день 0)

Примечание: Работа с лентивирусные частиц требует 2 категории оборудования и использования агента для нейтрализации вируса. Также настоятельно рекомендуется носить двойной пары перчаток.

1. Разминка 13.2 мл фибробластов средних 37 ° C.
2. Оттепель лентивирусные вектор, содержащий факторов транскрипции, Ascl1 и Brn2 с двумя шпильки короткие РНК (индуцируемый) ориентация отдых при комнатной температуре.
   Примечание: Обратитесь к ссылки⁸; Конструкция доступен в репозитории плазмиды. Для подробной информации о процедуре производить lentiviruses обратитесь к ссылка⁹.
3. Добавьте необходимый объем человека заразить aHDFs на обилие инфекции (МВД) 20 средних без каких-либо трансдукции усилителей.
   
4. Заменить средний в пластине 24-ну фибробластов носитель, содержащий лентивирусные вектор (500 мкл/а) и инкубировать на ночь при 37 ° C в 5% CO₂.
5. Следующий день, замените свежие фибробластов среднего без лентивирусные вектор средних в скважинах.
   Примечание: Средство считается инфекционных за 7 дней и как таковой, адекватной защиты и процедуры обработки должны использоваться в течение первой недели после вирусных трансдукции.

5. техническое обслуживание преобразования ячеек

Примечание: После того, как начинается преобразование клетки чувствительны к отмене; Позаботьтесь, чтобы наконечник пластину и использовать 1000 мкл пипетки, когда удаление средств массовой информации, чтобы избежать клетки отсоединение.

1. На 3 день, удалите средство фибробластов и 500 мкл ранних нейронов преобразования среды (см. таблицу 1).
2. Два-три раза в неделю, вывезти 225 мкл старой среды из колодца и -в 250 мкл свежие ранних нейронов преобразования среды.
3. В день 18, удалить все среды из каждой скважины и заменить 500 мкл конце нейрональных преобразования среды (см. таблицу 1).
4. Продолжайте изменять половина среды как выше с конца среднего нейрональных преобразования каждые 2-3 дня до дня 25 или эксперимент конечной точки (Рисунок 1A).
   Примечание: Если не клетки покрыты в каждый хорошо для эксперимента, заполните пустые скважин с PBS или воды для предотвращения испарения открытой среды и свести к минимуму различия между скважинами.

Таблица 1: состав различных средств массовой информации используется. Полное описание состава для всех средств массовой информации, необходимой в настоящем Протоколе, включая средний фибробластов, замораживание среднего, ранних нейронов преобразования среды, конце нейрональных преобразования средних и СУИМ буфера.

6. стекла Coverslips для электрофизиологических записей

Примечание: Рекомендуется носить пальто лаборатории, очки, двойные перчатки и завершить всю работу в зонта. Этот протокол является адаптирована из ¹⁰.

1. Место coverslips стекла в нижней части стекла блюдо без перекрытия.
2. Добавление общего Лаборатория очистки моющим средством, чтобы потопить все coverslips без рискуя переполнения во время встряхивания (около 30 мл). Поместите на орбитальный шейкер на медленной скорости за 2 ч.
3. Вымойте шесть раз (30 мин) автоклавного деионизированной водой.
4. Добавьте этанола 95% за 2 ч.
5. Удаление этанола и ждать, пока coverslips сухой.
6. После высыхания, передачи coverslips в стеклянный стакан и добавить 70% азотной кислоты, до тех пор, пока coverslips погружены.
7. Место стеклянный стакан в sonicator ванну для 60 мин.
8. Удаление азотной кислоты и мыть три раза газобетона деионизированной водой.
   Предупреждение: Всегда добавьте кислоты воду, никогда не другой путь вокруг, как это может привести к бурной реакции.
9. Удалить столько воды из стакана как можно и добавить концентрированной соляной кислоты (HCI), до тех пор, пока coverslips будут погружены в воду; водоворот, стакан и крышку с парафином фильм.
10. Sonicate 60 мин (50 – 60 Гц, 30 Вт).
11. Удалите столько HCI из coverslips как можно скорее и место в соответствующей мусорное ведро. Промыть газобетона деионизированную воду дважды.
12. Взять coverslips из капюшона и промыть 20 раз (или более) автоклавного деионизированной воды до тех пор, пока все HCI будет удалена.
13. После высыхания, место coverslips в стерильных пластин 24-хорошо.
14. Поместите пластины под ультрафиолетового (УФ) света на ночь. Следующий день coverslips готовы к использованию.
    Примечание: Если используется стекло coverslips, рекомендуется использовать покрытие PFL. Просто поместите один coverslip в каждую лунку 24-ну плиты (с использованием стерильный пинцет) и следовать протоколу как показано ниже.

7. PFL покрытие для долгосрочной перспективе культуры

1. Слой 24-ну пластины с поли L-орнитин (500 мкл/а) и оставить на ночь при 37 ° C в 5% CO₂.
2. Аспирационная поли L-орнитин и подождать до тех пор, пока он достаточно сухой, в форме капель на вершине.
3. Сделайте падение (примерно 60 мкл) Ламинин в центре каждого Ну и распространился на всю поверхность coverslip. Оставьте на 2 ч 45 мин при 37 ° C в 5% CO₂.
4. Промыть DPBS три раза.
5. Добавить фибронектина (500 мкл/а) и оставить на ночь при 37 ° C в 5% CO₂.
6. Мыть раз с DPBS перед добавлением клетки.
   Примечание: PFL покрытие может использоваться для долгосрочной термин культуры iNs (свыше 100 дней), хотя прогрессивный клеточную смерть следует ожидать от дня 30.

8. СУИМ

Примечание: Чтобы повторно пластины клетки после СУИМ сортировки PFL-покрытием плиты 48 h заранее подготовить. Клетки могут быть отсортированы с помощью нейронных клеток сцепления молекул (NCAM) антитела от 20-й день года после трансдукции.

1. Удалите средства массовой информации с 1000 мкл пипетки (не мыть, чтобы избежать отсоединение клетки).
2. Добавить ячейку отделения агент (250 мкл/а), оставить на 10-20 мин до клетки лифта и поплавок как отдельные клетки.
3. В это время подготовьте СУИМ буфера.
4. Нарезанных нежно с 1000 мкл пипетки. Если остаются некоторые сгустки, Инкубируйте немного дольше.
5. Как только одну ячейку подвеска получается, удалите его из скважины и место в 1,5 мл трубку.
6. Заподлицо хорошо дважды с конца нейрональных преобразования средних и место в том же 1,5 мл трубку.
7. Спин вниз на 400 g x 5 минут и удалить супернатант.
8. Ресуспензируйте Пелле клеток в 200 мкл буфера СУИМ.
9. Спин вниз клетки на 400 g x 5 минут и удалить супернатант.
10. Повторите шаги 8.8 и 8,9 дважды.
11. Ресуспензируйте Пелле клеток в 50 мкл буфера СУИМ, содержащих человеческие антитела CD56 (NCAM) в концентрации 1:50 для 15 мин на льду. Защищайте от света.
12. Спин вниз клетки на 400 x g за 5 мин.
13. Ресуспензируйте 200 мкл буфера СУИМ мыть и спин вниз клетки на 400 x g за 5 мин.
14. Повторите шаг 8.13.
15. Ресуспензируйте в 200 мкл буфера СУИМ, содержащий пропидий йодидом (PI; 10 мкг/мл). Сортировать NCAM положительные (iNs) и PI отрицательные (live) клетки с помощью СУИМ, строб, основанный на уровень интенсивности флуоресценции контрольных образцов, которые не были окрашены с NCAM антитела или PI.
16. Соберите NCAM положительные клетки в тубы конце среднего нейрональных преобразования.
17. Подсчет количества ячеек, используя счетчик автоматизированных клеток и повторно пластины клетки на высокой плотности (50 000 клеток/см²) в конце среднего нейрональных преобразования в блюдо PFL покрытием.
18. Продолжайте изменять половина среды 2 – 3 раза в неделю с конца нейрональных преобразования среднего до конечной точки эксперимента (рис. 1A).

Четкое изменение в морфологии клеток должен быть виден с дня 5 года (рис. 1B). Некоторые смерти клетки ожидается после вирусных трансдукции, хотя не открыто. От каждой скважины в пластине 24-ну ячейке доходность 20 000-40 000 ячеек следует ожидать в день 25, из которых около половины должен был стать нейронов. Важно отметить, что урожайность и чистоты может варьироваться по всей линии клеток, а также с сериями государства и вирус болезни.

Клетки будут выражать большинство стандартных маркеров нейронов, включая MAP2 и Тау (рис. 1 c) на день 25 в дополнение к выставке зрелых нейронов морфологии. Это позволяет получить чистый населения, делая СУИМ, основанные на маркер NCAM (см. ссылки8,11). Клетки могут впоследствии быть либо повторно покрытием на тройной покрытия PFL (см. ссылку10) или непосредственно замороженных биомолекулярных анализа.

Если клетки не сортируются, иммунофлюоресценции маркировки с MAP2 или Тау должны быть выполнены для идентификации успешно преобразованных ячеек и совместно помечены протеина интереса.

Рисунок 1: эволюция в преобразования над временем. (A) Хронология эксперимент и карта конструкции, упакованы в Лентивирусы, используемый для перепрограммирования взрослых фибробластов дермы. Каждая черная стрелка представляет собой средний изменение. (B) представитель этап контрастность изображения изображающие изменениям в морфологии клеток во время процесса преобразования между день 0 день 22 (как указано в верхнем правом углу каждой группы). Изображения были взяты на микроскопе контраст фазы с использованием 10 X цель. (C) образ иммунофлюоресценции Тау и MAP2 двойной пятнать в день 35 после трансдукции. Клетки были зафиксированы в параформальдегида 4% и permeabilized с 0,1% Тритон в DPBS за 10 мин клетки были заблокированы на 30 мин в сыворотке 5% раствор в DPBS. Антитела были разводят в преграждая разрешение и применяется на ночь при 4 ° C. Флюорофор конъюгированных вторичные антитела были разводят в преграждая разрешение и применять за 2 ч. клетки были counterstained с DAPI 15 мин, следуют 3 стирок с DPBS. Изображения были взяты на Перевернутый флуоресценции микроскопа с помощью 20 X цель. Масштаб баров = 100 мкм (B, C). Сокращения: ENM: ранних нейронов среднего; LNM: поздно нейронов среднего. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы не имеют ничего сообщать.