Дрозофилы In Vivo травмы модель для изучения Neuroregeneration в периферической и центральной нервной системы

Неспособность аксоны восстанавливаться после травмы центральной нервной системы (ЦНС), может привести к постоянной инвалидности в больных, а также играет роль в необратимое неврологического дефицита в нейродегенеративных заболеваний^{1,2 ,3,4,5}. CNS окружающей среды, а также способность внутреннего роста нейронов, определяет ли аксоны способны восстанавливаться после травмы. Было показано, что внеклеточных факторов от олигодендроциты, астроглиальных и фибробластический источников препятствуют нейрональных роста^4,6,7,8, но ликвидации этих молекул разрешает только для ограниченной прорастания⁵. Внутренней регенерации сигналы могут влиять регенеративной успеха^5,9 и представляют потенциальных терапевтических целей, но эти процессы еще не четко на молекулярном уровне. Увеличение трофического фактора сигнализации или ликвидация эндогенных тормоза, например Pten фосфатазы¹⁰, может привести к аксональное регенерации в определенных обстоятельствах. Комбинации различных методов оказывается индивидуально эффективной обеспечивают также только ограниченное общее восстановление на сегодняшний день^11,12,,1314. Таким образом есть отчаянная необходимость определить дополнительные пути для целенаправленной терапии. Помимо начала отрастания аксона ли и как аксоны повторно провод правильную цель, реформы синапса специфичность и добиться восстановления функций являются важные нерешенные вопросы.

Таким образом нынешнее понимание механизма, диктуя регенерации аксона до сих пор весьма фрагментарно. Частью проблемы является технической сложности изучения аксона регенерации в организме млекопитающих в режиме реального времени, подход, который является дорогостоящим, длительным и сложным для проведения крупномасштабных генетических экраны. Drosophila melanogaster, с другой стороны, оказалась исключительно мощные системы для изучения сложных биологических вопросов. Плодовая муха сыграла важную роль в определении генов и сигнальные пути, которые поразительно сохраняются в организме человека и была успешной моделью для изучения человека условий, таких как нейродегенеративных заболеваний, через инструменты огромной молекулярной генетики доступно для манипулирования генов функция¹⁵. В частности дрозофил считаются идеальным инструментом для обнаружения генов, участвующих в нейронных травмы и отрастания^15,16. Были разработаны несколько моделей летать нейронных травмы, включая взрослых руководитель или личинок воспалении брюшины шнур (VNC) ножом с иглами, личинок VNC или раздавить нерва с щипцами, личинок нейрон лазер axotomy, удаление нейрон обонятельного рецептора, мозг эксплантов травмы, и поражения периферических нервов, крыло выходное^{15,17,18,19,20,21,,2223}. Возбуждающе последние работы используя дрозофилы травмы модели продвинули наше понимание клеточной и генетической путей, используемых в нервной системе реагировать нейронных травмы, некоторые из которых было показано, быть сохранены в млекопитающих^{24 ,25}. Опять же это подчеркивает полезность этой модели организма для определения новых механизмов нейронных ремонта.

Описанные здесь — это двух Фотон лазерных дрозофилы личиночной сенсорных нейронах травмы модель. Двух фотона лазерного был впервые использован для резки аксоны в zebrafish в естественных условиях в 2003 году²⁶. В том же году первый dendriotomy лазера была исполнена в дрозофилы с помощью лазерной импульсной азота²⁷. Вскоре после этого несколько C. elegans лаборатории используется для определения модели регенерации аксона²⁸фемтосекундных лазеров. В 2007 году Ву и коллеги по сравнению и сообщил различия между лазерной травм в C. elegans индуцированных различные виды лазеров²⁹. В 2010 году регенерации аксона после лазерной axotomy был впервые показан в дрозофилы³⁰. Опираясь на эту литературу травмы обширная лазерная, мы разработали модель fly нейронных травмы с помощью двух Фотон лазер, который позволяет точно индукции травмы на целевые сайты с минимальными возмущений соседних тканей, обеспечивая относительно чистым системы для изучения внутренние и внешние свойства neuroregeneration с одной ячейкой резолюции. В частности, мы создали набор методов травмы для сенсорных нейронов дендритных арборизация (da) в обоих периферической нервной системы (ПНС) и ЦНС. Да нейроны могут быть сгруппированы в четыре различных класса, главным образом отличают их сложности разветвления дендритов: класс I до IV³¹. Наша опубликованные работы показывает, что да нейрон регенерации напоминает млекопитающих травмы модели на фенотипическую и молекулярном уровне: Да нейронов отображать свойства класса конкретных регенерации, с класса IV, но не класса I или III да нейронов экспонируется регенерации в ПНС; Класс IV да нейрон аксоны регенерировать надежно на периферии, но их регенеративный потенциал резко сократилось в ЦНС, таким образом, напоминающие Спинной корень нейроны ганглии (DRG) млекопитающих; повышение активности mTOR через Pten удаления или Akt гиперэкспрессия способствует регенерации аксона в лету ЦНС¹⁹. Используя эту модель травмы, мы выполняют генетических экраны и определили обработки фермент РНК Rtca как эволюционно сохранены тормозящий фактор для регенерации аксона, связывание аксона травмы клеточного стресса и изменения РНК²⁰ .

В представленных парадигме травмы индуцируется через лазерной axotomy/dendriotomy личинок класса IV или III да нейронов, обозначены ППК CD4-tdGFP или 19-12-Gal4, бас-CD4-tdGFP, репо Gal80, соответственно. Травмы осуществляется на 2-^й до 3^rd instar личинок на около 48-72 ч после откладки яиц (h AEL). Для ПНС axotomy поражения предназначена для секции аксона ~ 20-50 мкм от клеток тела, для ЦНС axotomy площадью ~ 20 мкм в диаметре на стыке спайки в VNC и dendriotomy точки первичных дендритных филиала. Же нейрон отображаемого в 8-24 ч после травмы (AI), для подтверждения полного перерезка и на 48-72 ч AI для оценки регенерации. Через промежуток времени конфокальная томография, со временем может контролироваться дегенерация и регенерации отдельных аксоны/дендритов, которые были потерпевшего в естественных условиях .

1. Подготовка культуры пластин и бутылки

1. Подготовка плиты агара виноградного сока
   1. Добавьте 10 g агар порошок, 200 мл виноградного сока и 192 мл ddH₂O в стакан и СВЧ для около 4-5 мин, помешивая периодически до тех пор, пока полностью не растворится агар.
   2. В Зонта охладьте вниз решение около 60 ° C. Добавление 4.2 мл этанола 95% и 4,0 мл уксусной кислоты кристаллизированной. Отрегулируйте общий объем раствора до 400 мл с ddH₂O. Mix хорошо.
   3. Для каждой пластины 35-мм добавьте около 2-3 мл раствора. Сделайте около 120-150 пластины для в общей сложности 400 мл раствора агар виноградный сок.
   4. Ждать 10 минут для охлаждения плит и затвердеть агар решение. Пакет виноградный сок плиты агара в самостоятельной запечатанном ziplock мешки и хранить при 4 ° C для использования в будущем.
2. Подготовка дрозофилы культуры бутылок
   1. Используйте лезвия ударить стороне 1,5 см Длина треугольной отверстие на одной стене дрозофилы культуры бутылки и заполнить отверстие с 2-2,5 см диаметр шар хлопка для вентиляции.
   2. Подключите бутылку с табличкой агар виноградный сок, дополнена около 0,5 см³ пасты дрожжей.

2. сбор личинок дрозофилы

1. Настройка кресты взрослых мух
   1. 10 место девственной женщины и 5 взрослых мужчин летит вместе в бутылке культуры, подключено с тарелкой агар виноградный сок.
   2. Поместите дно бутылки при 25° C, так что мухи будет откладывать яйца на тарелке агар виноградный сок. Измените пластину с пастой из дрожжей по крайней мере один раз в день. На период 2-h коллекции, который позволяет уборки личинки однородных стадии развития, начните с более чем 20 девственной женщин и 10 мужчин на этапе 2.1.1.
   3. Культура пластины при 25° C в чашке Петри 60-мм с влажной ткани, например, смоченной в растворе пропионовой кислоты 0,5%. Организовать ткани, так что он не блокирует поток кислорода.
      Примечание: Пропионовой кислоты раствор используется для поддержания влажности в блюдо и избежать рост плесени.
2. Личинки урожая определенного возраста
   1. Используйте пару щипцы для переноса личинок желаемого стадии, например, 2-^й до 3^rd instar личинок в 48-72 ч после откладки яиц (AEL), к новой пластинкой агар виноградный сок без дрожжей пасты.
   2. Удаление дрожжей из личинки кожи, позволяя им обхода вокруг на новой пластины, чтобы предотвратить потенциальные вмешательства дрожжей с лазерной axotomy и изображений. Кроме того тщательно очистите личинки, мыть их в блюдо PBS и сушки кратко на кусок оберточной бумаги.

3. два Фотон травмы и конфокальная томография

1. Настройка микроскопа
   Примечание: Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп с двух фотона лазерного был использован для эксперимента, но другие системы с эквивалентной установки также будет достаточно. Двух Фотон лазер (930 Нм) использовался для доставки травмы и Аргонового лазера (488 нм) был использован для конфокальная томография GFP.
   1. В начале каждой сессии, включите два фотона лазерного или конфокальной laser(s) и Микроскоп. Откройте изображений программное обеспечение.
   2. Для двух Фотон травмы, установите следующие параметры для визуализации GFP с двух Фотон лазера на 930 Нм (1950 МВт).
      1. Выберите режим сканирования линии. Откройте всю дорогу обскуры. Увеличение интенсивности лазерного ~ 20% (390 МВт).
      2. Выберите 512 x 512 как кадр сканирования. Используйте максимальный скорость сканирования (обычно с пиксель продолжительность на 0,77 МКС). Убедитесь, что среднее число 1 и разрядность 8 бит.
      3. Усиления ~ 750, и смещение до 0.
      4. Сохранить этот предварительный набор экспериментальный протокол как 2 P GFP 930 абляции, что позволяет легко использовать повторно в будущем экспериментов.
   3. Для конфокальная томография, установите следующие параметры для визуализации GFP с Аргонового лазера на 488 нм:
      1. Выберите вкладку приобретения и затем Z-стека.
      2. Под «лазер» включите питание для 488 нм Аргонового лазера.
      3. Перейти в каналы, выберите лазер 488 мм и увеличить мощность лазера до 5-10%. Для точечным Используйте светлые блок 1-2 (АС). Отрегулируйте усиление до 650.
      4. В Режиме приобретениявыберите 1024 x 1024 сканирования кадра, используйте максимальную скорость, среднее количество 2 и разрядность 8 бит.
      5. Сохраните этот предустановленных экспериментальный протокол как GFP Imaging.
2. Личинки анестезии с диэтиловым эфиром и монтажа
   1. В Зонта Поместите блюдо 60-мм стекла в 15-см пластиковой чашке Петри. Складки и кладут кусок оберточной бумаги в нижней части стекла блюдо, затем поместите плита агара виноградного сока на ткани. Добавьте диэтиловый эфир в стеклянную посуду, до точки, где папиросной бумаги промокли и есть слой жидкого эфира, оставаясь в блюдо. Держите крышку на на все времена.
   2. Подготовка стекла слайд с одной капли галоидоуглеводородов 27 нефти в центре. Добавьте 4 пятна вакуумных смазки на четырех углах слайда, чтобы позднее поддержки coverslip.
   3. Используйте корнцанг подобрать larva уборка и поместите его на плите агар в 60-мм стеклянную посуду. Обложка блюдо стекла с крышкой и подождать до тех пор, пока личинка перестает двигаться. Для ПНС травмы/изображений как только его хвост останавливается твичинг вывезти личинка. Для ЦНС, подождите, пока весь личинка становится неподвижно, особенно головы сегментов.
      Примечание: Время эфира воздействия имеет решающее значение. См.
   4. Тщательно подобрать наркотизированных личинка и поместите его голову в вертикальном положении в каплю масла галоидоуглеводородов на слайде. Добавьте coverslip поверх слайда. Используйте нежное давление надавите на coverslip, пока он не коснется личинка (рис. 1A).
   5. Отрегулируйте положение личинка нажатием нежно coverslip к левой или правой ролл личинка, так, что нейрон/аксона/дендритов интерес на вершине и ближе к объектива микроскопа.
   6. Для ПНС травмы смонтируйте личинка спинной стороне вверх, так что видны оба трахеи. Затем ролл личинка ~ 30 градусов влево для класса III да нейрон аксоны (рис. 1B и 1 C), 90 градусов для ранив класса IV да нейрон аксоны (рис. 1B и 1E) или ~ 30 градусов для ранив дендритов нейронов () класса IV да Рисунок 2A).
   7. Для травмы ЦНС положение личинка быть совершенно вентральной стороне вверх (рис. 3A), так что региона интерес ближе к объектива микроскопа в плоскости z.
3. Травмы, два фотона лазерного
   1. Поместите слайд с личинки под микроскопом и закрепите его на месте с слайд владельца на сцене. Цель использования 10 X (0,3 NA) чтобы найти личинки.
   2. Переход к 40 X (1.3 NA), добавьте 1 каплю объективных масла на coverslip цель и настроить фокус.
   3. Переключитесь в режим сканирования и повторно использовать экспериментальный протокол 2 P GFP 930 абляции. Убедитесь, что отверстие открыт всю дорогу.
      Примечание: Настройки необходимо быть оптимизированы на основе индивидуальных систем.
   4. Запустите режим Live найти региона интерес (ROI) и тонкую настройку параметров для достижения хорошее качество изображения с соответствующим увеличением.
      Примечание: Цель этого шага заключается в том, чтобы найти нейрон/аксона/дендритов травмировать, а не принимая лучшее качество изображения. Таким образом используйте минимальные параметры достаточно, чтобы визуализировать целевой области, с целью избежать чрезмерного или Фотообесцвечивание.
   5. Остановите проверку Live , таким образом, чтобы кнопка культур станут доступны. Пусть все еще изображения служат в качестве «дорожной карты». Выберите функцию культур и настроить окно сканирования сосредоточиться на цели получают ранения.
   6. Сокращение ROI будет размер потенциальных сайта травмы. Например просто перекрывать ширину аксон или дендритов, для обеспечения точности травмы и уменьшать ущерб, наносимый соседние ткани. При желании, увеличьте рентабельность перед кадрированием, позволяет для более точного травмы.
   7. Откройте новое окно визуализации. Уменьшить скорость сканирования и увеличения интенсивности лазера. Определите увеличение интенсивности лазера на основе сигнала флуоресценции ткани, проверяемых в режиме Live .
   8. Как правило задайте два фотона лазерного света, начиная с 25% для ПНС травмы и 50-100% для VNC травмы. ПНС аксона травмы, убедитесь, что интенсивность лазерного ~ 480 МВт и пиксель время задержки является 8.19 МКС. Для VNC аксона травмы обеспечить продолжительность лазерной интенсивности и пикселей обычно 965-1930 МВт и 8.19-32.77 МКС, соответственно.
   9. Начало непрерывного сканирования. Оставьте курсор при наведении на кнопку непрерывно . Храните закрыть глаза на изображении и остановить сканирование, как только наблюдается резкое увеличение флуоресценции.
      Примечание: Внешний вид пика флуоресценции обусловлено auto флуоресценции в месте травмы.
   10. Переключитесь обратно в режим Live путем повторного использования параметров. Найти область интереса, который только что был мишенью фокусировки.
       Примечание: Хорошим показателем успешной травмы является появление небольшой кратер, кольцо как структура или локализованные мусор прямо на месте травмы.
   11. Перейти к следующему нейрон и повторите шаг 3.3.5, нанести несколько нейронов в одном животном. Или повторить шаг 3.3.5 при постепенно увеличить мощность и/или снижение скорости сканирования, если первоначальной травмы был недостаточным.
       Примечание: В случае, что мощность лазера является слишком высокой, большой поврежденной области будет в изображении живой сканирования после травмы. Слишком много травмы может привести к смерти личинка.
   12. Восстановите личинка, тщательно удалив coverslip и передачи потерпевшим личинка на новую пластину с пастой из дрожжей. Дитч несколько пещер на пластину агар с щипцами; Кроме того сделать остров агар в пластину вместо целую тарелку, чтобы уменьшить возможность обхода из плиты личинка.
   13. Положите пластину в чашке Петри 60-мм с мокрой ткани (смоченной 0,5% пропионовой кислоты) и культуры при комнатной температуре или 25° C.
       Примечание: Личинка останется в личиночной стадии приблизительно дополнительный день при комнатной температуре (22° C) по сравнению с 25° c.
4. После травмы конфокальная томография
   1. Изображения раненых личинка в нужное время точках путем подготовки личинка, используя ту же процедуру анестезии и монтажа как 3.2 шаг, затем изображений с Конфокальная лазерная.
      Примечание: Изображение личинка на 24 ч после травмы (AI) для подтверждения аксональное травмы и 48 h AI (класс IV да нейроны) или 72 h AI (класс III да нейроны) оценить регенерации.
   2. Найдите личинка, используя цель 10 X, а затем переключиться на 25 X (0.8 NA) цели. Повторное использование экспериментальный протокол, GFP Imaging.
   3. Нажмите кнопку Live и найти же нейрон, ранены ранее.
   4. Установите первый и последний Z позиции в окне живой сканирования. Нажмите кнопку stop и нажмите кнопку начать эксперимент получить изображение Z-стека.
      Примечание: Убедитесь, что нормализации (точка аксон сходящихся) включен, когда захват изображения так, что количественная оценка регенерации возможен (рис. 1 d, 1F) – этот вопрос обсуждается более подробно в разделе анализ данных.
   5. Переключиться на Обработке изображений, выберите изображение, только что принятым и генерировать проекция максимальной интенсивности. Сохраните как z стека, так и максимальной интенсивности проекции изображения.

4. анализ данных

1. Процесс и количественно изображений с помощью программного обеспечения обработки изображений или ImageJ.
2. Количественная оценка регенерации аксона в ПНС
   1. Вычислите процент регенерации, которая относится к % регенерации аксоны среди всех аксонов, которые были пораженного. Оценка аксон как регенерирующее, пока он отрастает за пределами места повреждения.
   2. Мера длины регенерации, которая является увеличение длины аксон. При количественной оценке с ImageJ, инструмент Сегментирована линия проследить регенерации аксона и использовать меру в раскрывающемся меню Analyze для получения длины строки, представляющие регенерации аксона.
   3. Рассчитайте Индекс регенерации, которая является увеличение длины нормализованных аксон.
      Примечание: Длина Axon нормируется расстояние между тела клетки и аксон, сходящихся точки (DCAC) – Длина/DCAC аксона (рис. 1 d и 1F). Это значение позволяет учетной записи для любого аксональное роста, что обусловлено личиночной масштабирования. Положительное значение представляет регенерации, значение 0 означает не регенерации и отрицательное значение означает втягивание.
3. Количественная оценка дендритов регенерации
   1. Рассчитайте процент регенерации, что процент нейронов да среди всех тех, кто разорвала показывают очевидных дендритов отрастания.
      Примечание: Dendrite отрастания оценивается как позитивные, если новые дендритов вырастить из от отозванные дендритных стволовых и за пределами места повреждения. Места повреждения определяется, достопримечательности и в некоторых случаях, легко видимый из-за остаточного травмы индуцированной аутофлюоресценция.
   2. Рассчитайте увеличение точек филиала, который подсчитывает добавлением новых точек дендритных филиала после травмы.
   3. Рассчитайте увеличение длины всего дендритов, который является совокупный длина всех новых дендритов, добавлены после травмы.
4. Количественная оценка регенерации аксона в ЦНС
   Примечание: Если сайт поражения показывает дегенерации в первой точке времени, отображаемого (рис. 3B), она будет включена в анализ регенерации длины и скорости.
   1. Мера длины регенерации, который является длина немного отрастут аксон.
      Примечание: Немного отрастут аксона одного поражения сайта определяется как она исходит от первоначального маршрута аксона до травмы.
   2. Рассчитайте Длина нормализованные регенерации, которая нормализует регенерации Длина Длина сегмента спайки - продольное расстояние между спаек («Y» в рисунке 3а и 3Б).
      Примечание: Это значение помогает устранить эффект личиночной размер различия.
   3. Вычислить скорость регенерации, что процент регенерировать сегментов среди всех сегментов, которые были пораженного, чтобы отразить регенеративная способность конкретного генотипа.

Да нейронов шоу дифференциального регенерации потенциал между периферической и центральной нервной системы, а также специфики класса. Это обеспечивает уникальные возможности для новых факторов, которые требуются для регенерации аксона (с помощью класса IV PNS травмы), а также те, которые ингибирующее для регенерации (с травмы ЦНС IV класса и класса III PNS травмы).

Регенерации аксона в ПНС

В качестве примера описан характеристика регенерации класса III и класса IV да нейронов. Эти нейроны расположены на двустороннем уровне в каждом сегменте тела. Несколько нейронов может быть ранен в же личинка; как правило 3-4 нейронов в правой части брюшной полости сегментов A7-A2. Класс III и класса IV да нейроны могут быть визуализированы на 19-12-Gal4, бла-CD4tdGFP, репо Gal80 и ППК CD4tdGFP, соответственно. Анестезировать и смонтировать 48-72 ч AEL личинки, как описано, регулируя положение личинок, так что да нейронов интерес вверх (рис. 1A и 1B). Мы обычно травмировать ddaF класса III и IV класса v'ada нейронов (Рисунок 1 c и 1E). Выполнить axotomy и восстановить личинки, как описано. Вскоре после травмы (AI) личинки будет оправились от хирургии и выставку нормального передвижения. Выживаемость здесь, как правило, составляет более 80%. Выбросите личинки, которые являются мертвыми или больными. Перемонтировать остаток, как описано и оценить дегенерации. 24 h AI дистальной аксоны должны завершить дегенерации в это время пункт19, и аксон стволовых будет легко видимой (рис. 1 d и 1F). Reimage же личинки на 48 h AI для класса IV да нейронов или 72 h AI для класса III да нейронов оценить регенерации. Мы обычно направлены на оценку по меньшей мере 20 раненых нейронов в экспериментальной условие. В WT (дикого типа) животных, тогда как обычно ~ 70% да разорвала класса IV, которую нейронов будет заново за пределами места повреждения (Рисунок 1F), класс III да нейроны не вырастить, свидетельствует рост конуса сваливания (рис. 1 d).

Дендритов регенерации

Мы обычно выполняют dendriotomy на класс IV да нейронов ddaC (рис. 2A). Как показано в схематической диаграмме, травмы пристрелно к точке первичного дендритных филиала. Основываясь на опыте, когда травму на 48 ч AEL, ~ 50% ddaC нейронов регенерировать их дендритов (рис. 2B). В оставшиеся 50% соседних дендритов вторгнуться и охватывают вакантных площадей. Кроме того потенциал регенерации этих нейронов уменьшается, если ранения на позднее стадии развития.

Регенерации аксона в ЦНС

Для VNC аксона травмы выживаемость личинок существенно варьируется и зависит от возраста, в котором индуцируется травмы. Основываясь на опыте, личинки 48-72 ч AEL обычно имеют самый высокий показатель выживания (> 60%) среди различных этапов испытания. Личинки моложе 48 h AEL плохо выжить после травмы, в то время как в тех, кто старше 72 h AEL трудно представить травмы в VNC. Кроме того, это проще вызвать травмы на задней спайки сегментов чем передней, как эти заднего сегментов VNC ближе к вентральной поверхности и таким образом более доступным лазером (Рисунок 3А).

Травмировать класса IV да аксоны нейронов в ЦНС, смонтируйте личинки как описано выше (рис. 3A). Под микроскопом найдите лестница как структура аксона расслоений, составляющих часть VNC (Рисунок 3А) и выполнить axotomy, как описано. Дегенерация подтвержденных в 8 ч AI и регенерации оцениваются в 24 и 72 h AI. Как показано на рисунке 3B, аксоны в 8 h AI уже начал вырождаться, и 24 h AI, регенерации аксона наблюдается Хотя Аксон мусора еще можно найти вокруг сайты травмы. Аксоны WT Показать ограниченное отрастания в VNC и не подключить пробелов, порожденных травмы (рис. 3B). Для количественной оценки способности регенерации раненых аксонов, волоски длиной после травмы измеряется и длину сегмента спайки (Y в рисунке 3A) используется для нормализации (рис. 3 c).

Рисунок 1: Да регенерации аксона нейрон в периферии отображает специфику класса. (A и B) Схема, рисунок, показывающий положение личинок. (C) схема, чертеж класса III да нейронов. (D) аксоны класса III да ddaF нейронов, помечены 19-12-Gal4, бас-CD4-tdGFP, репо Gal80 / +, не восстанавливаются. (E) схема, чертеж класса IV да нейронов. (F) аксоны v'ada нейронов да класса IV, помечены ППК CD4-tdGFP / +, вырастить за пределами сайта поражения. (D и F) Красная линия показывает длину аксона хотя зеленой пунктирной линией знаменует расстояние между тела клетки и аксон, сходящихся точки (DCAC). Синяя точка отмечает точку конвергенции аксон. Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: Да нейрон дендритов регенерации. (A) иллюстративный представление класса IV да нейронов. (B) иллюстративный представление дендритов регенерации в класс IV да нейрон ddaC, обозначены ППК CD4-tdGFP / +. Лазерная абляция предназначен для точку основного филиала и проводится на 48 ч AEL. На 24 h AI травмы подтверждается перерезка neurite, и на 72 h AI количественно регенерации. Дендритов нейронов ddaC демонстрируют значительные отрастания, с новой дендритных ветвями, прорастания из разъединенных ствола для мозаичного заполнения вакантных площадей. Стоит отметить, что новый терминал ветви постоянно добавляются ранен дендритов на этой стадии развития. Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: Да регенерации аксона нейрон в VNC. (A) схематический чертеж larva дрозофилы монтируется на слайде и образы под микроскопом. Класс IV да аксоны нейронов в VNC, визуализируется в ППК CD4tdGFP / + личинки. Два кандидата спайки сегменты приводятся в увеличенное изображение и схематический чертеж. Каждый из них имеет две травмы сайтов (красные круги). (B) конфокальный изображения одного потерпевшего сегмента, отображаемого на 8, 24 и 72 ч после травмы (МА). Красные линии показывают немного отрастут аксоны. (C) измерение и нормализации отрастут аксоны. Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы не имеют ничего сообщать.