Изоляции F₁-АТФазы от паразитических протисты Trypanosoma brucei

F-типа СПС synthases мембраны прыгните вращающихся multiprotein комплексов транслокации Протон что пара через преобразователя энергии мембраны бактерий, митохондрий и хлоропластов с образованием АТФ. Молекулярные вращательного механизма синтеза АТФ известно главным образом из-за структурных исследований очищенный бактериальных и митохондриальной synthases СПС и их Субкомплексы¹. F-тип АТФ-синтазы организована в внутренние мембраны и мембраны внешняя постановление. Мембраны внешняя часть, известный как F₁-АТФазы, содержит три катализатора сайты, где происходит фосфорилирование аденозиндифосфат (ADP) СПС или обратной реакции. F₁-АТФазы могут быть освобождены экспериментально от мембраны неотъемлемой части молекулы при сохранении ее способность гидролизуют, но не синтезировать, СПС. Мембраны прыгните сектора, называется F_o, посредником транслокации белка, который управляет вращение центральной частью фермента. F₁ и F_o секторов соединены Центральной и периферической стеблей.

Первые попытки очистить F₁-АТФазы от начинающего дрожжей и бычьего сердца митохондрий Дата обратно в 1960-х. Эти протоколы, используемые извлечены митохондрий, которые были сорваны sonication, фракционированный высыпанием аммония или протамина сульфат, следуют необязательные хроматографии шаги и термической обработки^{2,3,4 ,5,6}. Очистки была значительно улучшена и упрощена путем использования метилхлороформа, который легко выпускает F₁-АТФазы от митохондриальной мембраны фрагменты⁷. Хлороформ добыча затем используется для извлечения F₁- ATPases от различных животных, растений и бактерий источников (например, печени крыс⁸, кукуруза⁹, Арум maculatum¹⁰и Escherichia coli ¹¹). Дальнейшей очистки хлороформ выпущена F₁-АТФазы хромотографией сродства или размер исключение (SEC) принесли очень чистый белок комплекс, который подходит для определения структуры с высоким разрешением, рентгеноструктурного анализа, как документально подтверждено структур F₁-АТФазы из сердца быка^12,13 и¹⁴ Saccharomyces cerevisiae. F₁-АТФазы структуры были определены также от организмов, которые трудны для того культивировать и, таким образом, сумма первоначального биологического материала было ограничено. В данном случае, F₁-АТФазы подразделения были искусственно выразил смонтирован в комплекс в E. coli, и весь гетерологичных фермента был очищен, близость хроматографии через тегами субъединицы. Такой подход привел к определению F₁-АТФазы структур из двух термофильных бактерий видов,¹⁵ Geobacillus stearothermophilusи Caldalkalibacillus thermarum^{16, 17}. Однако эта методология довольно непригодна для eukaryotic F₁- ATPases, поскольку он опирается на прокариот protheosynthetic аппарат, Посттрансляционная обработки и сложные Ассамблеи.

Добыча на основе хлороформ ранее использовался для изоляции F₁- ATPases от digenetic одноклеточными паразитами Trypanosoma cruzi¹⁸ и т. brucei¹⁹, важные млекопитающих патогенов, вызывая Америки и Африканские trypanosomiases, соответственно и от Моногенные паразитов насекомых Crithidia fasciculata²⁰. Эти очищения привело лишь к простой описание F₁- ATPases, так как не нисходящие приложения были использованы в полной мере характеризуют состав, структура и ферментативные свойства комплекса. Эта статья описывает оптимизированный метод для F₁-АТФазы очищение от стадии искусственного насекомого жизненного цикла т. brucei. Метод разработан на основании установленных протоколов для изоляции говядину и дрожжи F₁- ATPases^21,22. Процедура дает очень чистые и однородные фермента подходит для в vitro ферментативные и тормозящий анализов, подробные proteomic характеристика по масс-спектрометрии²³и структуры определения²⁴. Протокол очистки и знания о F₁-АТФазы структуры на атомном уровне открывает возможность для разработки экранов для определения малых молекул ингибиторов и помощь в разработке новых лекарств против африканских trypanosomiases. Кроме того, этот протокол может быть адаптирована для очистки F₁-АТФазы от других живых организмов.

1. буферов и решения

1. Подготовка решения, перечисленные ниже. Дега все буферы для жидкостной хроматографии. Добавление ADP, benzamidine и ингибиторы протеазы непосредственно перед использованием.
   1. Подготовка буфера A: 50 мм буфер Tris с соляной кислоты (Tris-HCl) pH 8.0, 0,25 М сахарозы, 5 мм benzamidine, 5 мм Аминокапроновая кислота (ACA) и ингибиторы протеазы (10 мкм amastatin, 50 мкм bestatin, 50 мкм pepstatin, 50 мкм leupeptin и 50 мкм diprotin A).
   2. Подготовка буфера B: 50 мм трис-HCl рН 8,0, 0,25 М сахарозы, 4 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), 5 мм benzamidine, 5 мм ACA, 1 ADP и ингибиторы протеазы (10 мкм amastatin, 50 мкм bestatin, 50 мкм pepstatin, 50 мкм leupeptin и 50 мкм diprotin A).
   3. Подготовить Q-столбца буфера: 20 мм трис-HCl рН 8,0, 4 мм ЭДТА, 10 мм MgSO₄, 5 мм benzamidine, 5 мм ACA и 1 мм ADP.
   4. Подготовить Q-колонки Элюирующий буфер: Q-столбца буфера с 1 M NaCl.
   5. Подготовить SEC буфера: 20 мм трис-HCl рН 8,0, 10 мм MgSO₄, 100 мм NaCl, 1 ADP.
   6. Подготовьте хлороформ, насыщенных с 2 М трис-HCl рН 8,5. Смесь хлороформ с 2 М трис-HCl рН 8,5 в соотношении примерно 1:1 в бутылке колпачок, встряхнуть, пусть органических и водной фазы отдельно, и измерения pH в верхней водный слой с полосы pH индикатор бумаги. Хранить при комнатной температуре. Непосредственно перед использованием встряхнуть снова и пусть отдельных фаз. Используйте нижний слой хлороформа.
      Предупреждение: Хлороформ летучих и раздражает глаза и кожу. Работа в зонта. Используйте очки безопасности при встряхивании.

2. Подготовка суб митохондриальной частиц

1. Ресуспензируйте митохондриальной везикулы (mitoplasts), изолированные гипотонический лизис²⁵ от 1 х 10¹¹ до 2 х 10¹¹ клетки procyclic т. brucei в 5 мл ледяной буфер A. Держите образец охлажденным до шага 3.2.
2. Определите концентрацию белка в подвеске, bicinchoninic кислоты (BCA) белка пробирного²⁶ согласно инструкциям производителя.
   1. Используйте серию разрежения бычьим сывороточным альбумином (БСА) в ультрачистая вода для построения калибровочной кривой. Разбавьте небольшим количеством образца 20 - 100 раз с ультрачистая вода вписываются в диапазоне BSA стандартов.
   2. Рассчитать сумму общего белка в образце и довести концентрацию белка до 16 мг/мл путем разбавления с дополнительного буфера а.
3. Фрагмент mitoplasts в Перевернутый везикулы и мембраны штук, sonication подвески 7 x 15 s с общей энергии от 70 до 100 J за импульса с microtip с диаметром 3,9 мм. Если ультразвуковой гомогенизатор не отображает выход энергии, запустите оптимизацию на 50% максимальной мощности. Проинкубируйте образцы на льду для 30 s между импульсами. После sonication подвеска становится немного темнее.
4. Отложений мембраны отломков ultracentrifugation на 54000 x g для 16 h или 98 000 x g для 5 h при 4 ° C. Сцеживаться супернатант и продолжить извлечение хлороформ, или отложений флэш замораживание в жидком азоте и храните его при температуре-80 ° C.

3. выпуск F₁-АТФазы от мембраны, хлороформе

1. Ресуспензируйте Пелле митохондриальных мембран в буфере B с помощью небольшой гомогенизатор Dounce. Рассчитать объем буфера B на основе общее количество буфера используется в формуле 2.1 и 2.2, используя следующие шаги: объем (буфера B) = объем (буфер A) x 12/21. Передать подвеска 15 или 50 мл Конические трубки.
2. Удалить образец из льда и теперь держать образца и все решения для использования при комнатной температуре.
3. Добавить хлороформ, насыщенных с 2 М трис-HCl рН 8,5; объем хлороформ добавляемый равняется половины объема подвески. Плотно закройте крышку. Встряхнуть ровно 20 s. Центрифуга сразу на 8400 x g 5 мин при комнатной температуре.
4. Передача верхней облачно водной фазе 1.6-мл пробирок. Добавление ингибиторов протеазы (10 мкм amastatin, 50 мкм bestatin, 50 мкм pepstatin, 50 мкм leupeptin и 50 мкм diprotin A), для замены ингибиторы, удалены, хлороформ лечения. Центрифугуйте образцы на 13 000 x г за 30 мин при комнатной температуре. Передать супернатант свежих пробирок и повторите центрифугирования для удаления любых нерастворимый материал.

4. Анионообменная хроматография

1. Сбалансировать столбце обмен (Q) 5-мл анион, прилагается к системе быстро белка жидкостной хроматографии с Q-столбца буфера потока скоростью 5 мл/мин до поглощения в 280 Нм и проводимости стабилизации (примерно 50 мл буфера).
2. Загрузить супернатант из шага 3.3 на столбце уравновешенной потока со скоростью 1 мл/мин ждать до поглощения в 280 Нм стабилизируется на фоне. Примените линейный градиент 25 мл Q-столбца буфера от 0% до 100% при скорости потока сбора фракций 1 мл 0,5 мл/мин.
3. Анализа отдельных фракций, соответствующих основных элюции пик гидролитическая деятельности СПС Pullman АТФазы пробирного² при pH 8.0. Использование 10 мкл каждой фракции на 1 мл реакционной смеси. Бильярд фракции, которые проявляют активность АТФ-азы. При необходимости, отделить 10 мкл каждой фракции на натрия Додециловый фосфат электрофореза геля полиакриламида (SDS-PAGE) и пятно гель по Кумасси синий для визуализации отдельных F₁-АТФазы субъединиц и загрязняясь протеины.
4. Концентрат, Объединенный образец ультрафильтрационные мембраны, с помощью столбца спин с 100000 MWCO PES фильтр для 200-500 мкл. приступить к SEC или магазина образца на ночь при комнатной температуре.

5. размер-гель-проникающей хроматографии

1. Сбалансировать SEC колонки, подключенные к системе жидкостной хроматографии с по крайней мере 48 мл (два столбца томов) SEC буфера со скоростью потока 0,5 мл/мин.
2. Применение образца на столбце и запуск хроматографии потока со скоростью 0,25 мл/мин сбор 0,25 мл фракций.
3. Запуск 10 мкл фракций, которые соответствуют вершины трассировки поглощения УФ_280nm на SDS-PAGE и выведение их путем Кумасси синим. Первый основной пик содержит F₁-АТФазы. Пробирного фракций, соответствующий этот пик для ATP гидролитическая активности и азид чувствительности по Пробирной Pullman АТФазы. Определите концентрацию белка, BCA assay.
4. Храните очищенную F₁-АТФазы при комнатной температуре и использовать его в течение 3 d после очистки для нисходящие приложения. Кроме того концентрат образца с помощью столбца спин с 100000 MWCO PES фильтр > 1,5 мг / мл, осадок его, смешивая его с насыщенным сульфат аммония скорректирована до pH 8.0 (1.2 x тома) и хранить при 4 ° C.

Типичный очистки (рис. 1) начинается с митохондриальных везикулы (mitoplasts), изолированные на Percoll градиент от hypotonically лизированных 1 х 1011 11 procyclic 2 x 10 т. brucei клетки25 культивировали в стандарте Глюкоза богатые SDM-79 средних27. Mitoplasts являются разрозненными, sonication, развернулся, и матрицы содержащих супернатант отбрасывается. Митохондриальные мембраны обращаются с хлороформом освободить F1-АТФазы. После центрифугирования органические фазы и осажденный межфазной отбрасываются. Водной фазе фракционированный на ионообменной хроматографии на четвертичного аммония, сильный анионит (рис. 2A). Фракции, которые соответствуют основным элюции пик и содержат F1-АТФазы объединяются и сосредоточены. Этот материал служит в качестве входных данных для SEC, который устраняет остаточные примеси. Основным загрязнителем является dihydrolipoyl дегидрогеназа, которая elutes от SEC столбца как дискретные пик, отмечен темно-зеленой панели на рисунке 2B. F1-АТФазы elutes в первый пик доминирующей, основном симметричный (рис. 2B).

Процесс очистки следуют BCA assay протеина (или другой общей assay протеина), SDS-PAGE и мониторинг деятельности АТФазы. Pullman АТФ, восстанавливающий проба2, основанный на уменьшение поглощения НАДН в сочетании реакции измеряется скорость гидролиза АТФ. Азид натрия, установленным ингибитор F1-АТФазы, используется в концентрации 2-мм для определения доли F1-АТФазы-конкретные гидролиза АТФ. Как правило шихтовый материал содержит примерно 150-300 мг митохондриальных белок, в зависимости от количество ячеек, которые используются как источник митохондриальной везикулы. Азид чувствительных доля общей активности АТФазы составляет около 30% до 40% на данном этапе. После извлечения хлороформ, более 90% активность АТФ-азы в образце способствовала F1-АТФазы. Очищенный F1- АТФазы практически полностью чувствителен к азид лечения (минимальной остаточной АТФазы активности можно объяснить Автолиз фон АТФ) и составляет около 1% от массы ввода белка, с приблизительную мощность 1 - 1.5 мг1F-АТФазы за 1 х 1011 клетки (Таблица 1). Типичная группа шаблон после разделения очищенного F1-АТФазы на следуют Кумасси синим Пятнать геля SDS-PAGE показан на рисунке 2 c. Белки были определены пептид массовой дактилоскопии и подробно характеризуются подходы различных масс-спектрометрии23. Спорадические слабых полос видны выше группа β-субъединица представляют Субкомплексы α3β3 головной убор (димеры и олигомеров α - и β-субъединиц) и лишены любых загрязнений, обнаруживаемые методами чувствительных масс-спектрометрии. Очищенный F1-АТФазы может храниться до нескольких дней в буфере SEC при комнатной температуре. Кроме того, F1-АТФазы, сосредоточены ≥2 мг/мл может осаждают равное количество насыщенных сульфат аммония в буфере SEC, с рН скорректирована до 8.0 и хранить при 4 ° C. По крайней мере шесть месяцев после высыпания активный фермент с без очевидных деградации любого подразделения можно получить путем redissolving осажденного материала в SEC буфер или аналогичного решения. Однако хранения дольше одного месяца не подходит для кристаллизации, как определяется эмпирически.

Рисунок 1 : Схема процедуры очищения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Очистки двухступенчатый хлороформ выпущена F1-АТФазы, жидкостная хроматография. (A) профиль элюции Анионообменная хроматографии (Верхняя панель) и отдельных фракций разделены на 10% - 20% гель трис глицин SDS-PAGE, окрашенных с Кумасси синий краситель (Нижняя панель). Синий след: УФ поглощения в 280 Нм; красный след: концентрация NaCl в Элюирующий буфер; Вход: F1-АТФазы, выпущенное хлороформе; FT: проточные. (B) профиль элюции сек (Верхняя панель) и отдельных фракций разделены на геля SDS-PAGE, окрашенных с Кумасси синий краситель (Нижняя панель). Вход: объединение фракций от Анионообменная хроматографии, содержащие F1-АТФазы. Цветных баров в панели A и B Марк фракций в элюции профили, которые были проанализированы SDS-PAGE и соответствующие полосы в соответствующих гель. (C) тождества отдельных белков изолированных F1-АТФазы, определенных по масс-спектрометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1: Пример типичного прогресса и доходность F1-АТФазы очистки из митохондрий изолированных от 1 x 1011 procyclic т. brucei клеток.

Авторы не имеют ничего сообщать.