В Vivo Двухцветные 2-фотон-изображения генетически-tagged репортер ателье клетки в коже

Липополисахарид (LPS) является эндотоксин, найденный во внешней мембране грамотрицательных бактерий¹. LPS имеет высокое связывающее сродство к платному рецептору 4 (TLR4)/CD14/MD2 рецепторного комплекса². TLR4 является рецептором распознавания образов обычно встречаются на внешней мембране широкого спектра иммунных клеток, мезенхимальных клеток, и подмножество сенсорных нейронов^3,4,5. Активация TLR4, выраженная на иммунных клетках, приводит к тому, что MyD88-зависимые и независимые системы второго мессенджера заканчиваются транслокацией в ядро клетки с ядерным фактором каппа (НФЗБ). Это приводит к тому, что у проститутки иммунной клетки производят и высвобождают провоспалительные цитокины, такие как Интерлейкин (IL)-1, IL-6 и TNF-No⁶. Однако, как другие типы клеток реагируют на стимуляцию TLR4 не так ясно. Фибробласты были вовлечены в широкий спектр патологий, таких как рак и муковисцидоз и недавно было показано, что играют роль моноцита химио-притяжения и содействия воспаление^7,8,9.  Наша лаборатория заинтересована в роли фибробластов в развитии острой и хронической боли, так как ранние данные свидетельствуют о том, что факторы, выделяемые фибробластами (матричные металлопротеиназы (ММП), ингибитор тканей металлопротеиназа (ТИМП) и фибробласт факторы роста (FGFs)) участвуют в невропатической боли¹⁰.

Состояния активации клеток могут быть определены по целому ряду факторов, которые включают: индукцию немедленно ранних генов, измененное выражение белка, пролиферацию клеток и морфологические изменения^11,12,13. Есть много методов, которые существуют, чтобы ответить на вопросы, которые мы можем иметь о том, как активация клеток способствует патологии, но все они имеют свои ограничения. Прототипная иммуногистохимия использует флуоресцентно помеченные антитела для обозначения белков, представляющих интерес в фиксированной ткани, которые могут быть неспецифическими и часто требуют значительных устранения неполадок, прежде чем дать плодотворные результаты^14. Западная промотирование является полезным методом при сравнении уровней экспрессии белка в посмертной ткани; однако, гистологический компонент не хватает в этой технике и исследователи не в состоянии определить какие-либо изменения в морфологии¹⁵. RNA-Seq позволяет нам количественно определить наличие РНК-мессенджера в выборке, которая во многих случаях дает проницательные данные; однако, разрыв между транскрипцией и переводом делает его трудным иметь временное разрешение после стимула^16. Конфокальная визуализация полезна для определения экспрессии и совместной локализации белков, которые существуют в поперечном сечении тканей¹⁷. Часто это не является репрезентативным для всей ткани образца. В отличие от этого, мультифотонные микроскопы позволяют пользователям изображения примерно 1 мм вглубь образца, создавая всеобъемлющее трехмерное представление¹⁸. Таким образом, мы решили сосредоточиться на in vivo, 2-фотонных визуализации preps, так как данные, собранные из этих экспериментов, более непосредственно relatable к высоко пластичной и взаимосвязанной микросреде живой ткани.

Преимущество изучения белково-рецепторных взаимодействий in vivo заключается в том, что мы можем четко запечатлеть, как клетки реагируют на стимул в реальном времени, в их родной среде без вредного и непредсказуемого влияния вскрытия тканей¹⁹. Кроме того, продольные исследования могут быть выполнены для оценки клеточной пластичности и грунтовки, которые могут возникнуть из-за активации.  Используя 2-фотон-изображение, мы сохраняем целостность микроокружения, присутствующего при применении внешнего стимула. Этот протокол обеспечивает способ определить поглощение молекул в фибробластах после периферической инъекции флуоресцентно помеченных LPS в течение нескольких часов in vivo и роль TLR4 в активации фибробластов.

Процедуры для животных были одобрены Техасским университетом в Далласе Институциональный комитет по уходу за животными и использования и были в соответствии с Национальными институтами здравоохранения руководящих принципов.  Все эксперименты проводились с использованием 8-12-недельных мышей мужского и женского пола, выведенных в доме на фоне C57BL/6. Трансгенные мыши с крем-рекомбиназой,управляемый фибробластом-специфическим протеином-1, были приобретены на коммерческой основе (Jackson, 012641) (FSP1cre) и скрещены с tdTomato ^lox-stop-lox мышей, также приобретенных на коммерческой основе ( Джексон, 007914) и (FSP1cre) tdTomato^lox-stop-lox и FSP1cre^-/-; tdTomato^lox-stop-lox мышей были выведены в доме на c57BL/6 фон(Рисунок 1A,B, C). Фибробласт-специфический белок 1 является эндогенным белком, выраженным примерно на 72% фибробласта и представляет собой эффективный драйвер кре в дермальной ткани^20. Мышей групповывали и давали ад-либитум доступ к пище и воде. Температура в помещении была сохранена на уровне 21 и 2 градусов по Цельсию. В то время как мы использовали C57BL/6 скрещенных мышей мужского и женского пола на 8-12 недель, мы не считаем, что возраст, пол или генетический фон являются необходимыми требованиями для запуска многофотоновых экспериментов. Мышей глубоко обезболели сразу после эксперимента и усыпили.

1. Подготовка препаратов

1. Подготовьте раствор липополисахарида-FITC (см. таблицуматериалов) в стерильных 1x PBS (pH 7.4) см. Vortex запас решение со средней интенсивностью в течение минимально 30 секунд, чтобы обеспечить однородное смешивание для равной концентрации во всем растворе до пипеттинг (LPS является клейкой молекулы).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не помещайте LPS в стеклянный контейнер, если это возможно, используйте силиконовые микроцентрифуги трубки. Держите на льду до использования.

2. Настройка изображений

1. Настройка многофотонной системы (см. Таблицаматериалов) для двухцветной визуализации. Это требует использования двух отдельных возбуждательных лазеров (см. ТаблицаМатериалов), набора кубиков фильтра GFP/RFP (см. таблицу материалов) и 25x (1,05 NA) цели погружения воды (см. ТаблицаМатериалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователи могут изменить эти настройки, чтобы лучше соответствовать альтернативным установкам и возможностям мультифотонного микроскопа. Таковы параметры, используемые в экспериментальном протоколе. Для получения более подробной информации можно ознакомиться с таблицей материалов.
2. Поместите стереотаксический аппарат (см. ТаблицуМатериалов) на сцене мультифотонического микроскопа. Подключите это к аппарату доставки анестезии (см. Таблицаматериалов), чтобы обеспечить животных под наркозом в течение всего эксперимента. Поместите кусок матовой черной бумаги на поверхность аппарата в качестве точки соединения для мышиной лапы.
3. Выберите резонансный сканер с фиксированной областью сканирования 512 мкм х 512 мкм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не выполняйте эксперименты в этом протоколе с помощью сканера гальванометра. Из-за более медленной частоты выборки, будет искажение в z-стек замедленного видео из-за дыхания животного, что является неизбежным.
4. Настройте два возбуждающих лазера на волне возбуждения GFP и RFP, 930 нм и 1100 нм соответственно, и направьте световой путь обоих возбуждающих лазеров к одной цели с помощью дихромного зеркала 690-1,050 нм, позволяющего 930 нм-настроенный excitation лазер для отражения в основной сканер и 1100 нм настроенных лазеров, чтобы пройти непосредственно в основной сканер (Рисунок 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Можно изменить эти длины волн возбуждения в зависимости от установки пользователя.
5. Установите лазерную мощность FITC до 5% и GFP до 20%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта установка обеспечивает оптимальное соотношение сигнала к шуму (SNR) в этих экспериментах. Обнаружение сигнала с помощью многощелочных фотомультипликаторных трубок (ПМТ); однако детекторы GaAsP могут использоваться в экспериментах с высокой чувствительностью.
6. Подготовьте помещение для визуализации в темных условиях без рассеянного света.

3. In vivo изображений

1. Поместите мышь в индукционную камеру системы доставки анестезии и используйте 5% изофлуран (см. Таблица Материалов) при скорости потока 2 л/мин кислорода, чтобы поместить мышь под глубокую анестезию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется носить все соответствующие СИЗ во время эксперимента.
   1. Передача мыши в стереотаксический аппарат с доступом к носовому конусу для поддержания анестезии на протяжении всего эксперимента. Уменьшите изофлуран до 1,5%-2% и сохраните скорость потока постоянной.
   2. Твердо прикрепите заднюю лапу к листу черной бумаги с черной лентой на участках, как проксимальных, так и дистальных в области интереса (это уменьшает влияние дыхания мыши на качество изображения), убедившись, что подошвенная поверхность лапы беспрепятственно и облицовка к цели. Убедитесь, что головка мыши стабильна в носовой конус, прикрепленный к аппарату.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мониторинг мыши для любых признаков бедствия или обезвоживания на протяжении всего эксперимента и настроить изолюран соответственно.
2. Поместите щедрое количество стерильной смазки на водной основе (гель, см. Таблицаматериалов) на подошвенной поверхности лапы и прикоснитесь к цели к ней, чтобы создать столб жидкости между лапой и целью.
3. Используйте свет возбуждения FITC, чтобы сосредоточиться на кожном слое лапы. Убедитесь, что tdTomato-tagged фибробласты визуализировать перед продолжением (этот шаг имеет важное значение в определении правильной фокусной плоскости для изображения).
   ПРИМЕЧАНИЕ: кожный слой лапы составляет около 100-150 мкм в лапу.
4. Изображение области клеток, расположенных чуть ниже подошвенной поверхности задней лапы с 930 нм и 1100 нм настроенных лазеров и приобрести 15-минутный промежуток времени около 5-10 z-ломтиков примерно 1 мкм на ломтик, чтобы установить представление окружающей среды до инъекция с LPS-FITC.
5. Выполните внутриплантарную инъекцию 5 мкг/20 ЛПС-ФИТК на заднюю лапу мыши, используя 25 л стекающих шприцев Гамильтона (см. Таблицу Материалов) и 30G иглу (см. ТаблицаМатериалов), заботясь, чтобы не нарушать положение лапы.
6. Изображение области клеток, расположенных чуть ниже подошвенной поверхности задней лапы с 930 нм и 1100 нм настроенных лазеров и приобрести 60-120 минут промежуток времени около 5-10 z-ломтиков примерно 1 мкм на ломтик, чтобы определить поглощение LPS-FITC клетками.

Первоначально мы вводили LPS-FITC в заднюю лапу мышей дикого типа, чтобы визуализировать поглощение LPS-FITC во всех типах клеток, присутствующих в дермальном слое лапы. После наблюдения множество клеток в кожном слое задней лапы поглощения флуоресцентно помечены LPS в дикий тип мыши (Видео Рисунок 1, 2), мы попытались конкретно целевой фибробластов, поскольку они являются основным направлением в наших исследованиях. Перед визуализацией лапживотных животных, вводимых LPS-FITC, мы хотели пояснить, что в кожном слое нет присущей флуоресценции клеток. Это необходимо для того, чтобы после инъекции, изображения, которые мы принимаем истинные взаимодействия клеток с флуоресцентно помечены LPS, а не любые артефакты изображения (Видео Рисунок 3, 4). После инъекции LPS-FITC, только FSP1и фибробласты, выражающие TLR4 связывать и поглощения вводили белок, с высоким уровнем совместной локализации с тегом tdTomato, выраженным этими клетками (ВидеоРисунок 5). В отличие от мыши, которые TLR4 выбил из всего тела (TLR4KO) не связывают и поглощения LPS после инъекции. Как видно на видео, силуэты клеток видны после инъекции LPS-FITC, которая указывает на то, что препарат рассеивается в интерстициальной жидкости вокруг клеток, но на самом деле не связан рецептором (Видео Рисунок 6).

Подводя итоги, мы покажем, in vivo, что после инъекции LPS-FITC, в FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox клеток конкретных активированных животных только фибробласты взаимодействуют с и поглощения LPS. В отличие от этого, нокауты всего тела TLR4 не связывают и поглощения LPS-FITC после инъекции.

Рисунок 1 . tdTomato выражается только в FSP1и Фибробласты в Cre-зависимых Маннер. A) FSP1cre трансгенных мышей, выведенных на фоне C57BL/6 пересекаются с tdTomato мышей, выведенных на C57BL/6 фон для создания мышей, выраженных tdTomato в FSP1и фибробласт в cre-зависимых моды. B) Представитель PCR результаты, изображающие как положительные, так и отрицательные мыши FSP1cre, выражающие tdTomato. C) Представительная пиктограмма кожных фибробластов во внеклеточном пространстве, расположенном в мышиной лапе. FSP1- мыши выражают красный флуоресцентный белок только в фибробластах, в то время как FSP1- мыши нет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2 . Световой путь двухцветного 2-фотон-микроскопа. Изображение световой дорожки, созданной для 2-цветного 2-фотона эксперимента. Лазер 1 настроен до 930 нм, чтобы возбудить FITC-конъюгированный LPS и Лазер 2 настроен до 1100 нм, чтобы возбудить tdTomato, найденный в фибробластах. Возбуждаемый свет от лазера 1 отражается дихроарным зеркалом (690-1050 нм), в то время как возбуждательный свет от лазера 2 проходит через главный сканер. Возбуждение света от обоих лазеров отражается набором зеркал на второе дихроическое зеркало (650 нм), позволяя возбуждая свет проходить через цель и в ткани, чтобы возбудить флюорофоры. Свет излучается из возбужденных флюорофоров и захватывается 25-кратной целью и отражается дихроарным зеркалом (650) в многощелочные фотомультипликаторные трубки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3 . Экспериментальная диаграмма потока 2-фотонной микроскопии. Мыши обезвражаются и обездвижены с помощью низкоточной анестезии системы и стереотаксического аппарата. Подошвеет поверхности лапы сталкивается с целью и изображением в течение 15 минут. Интраплантарная инъекция в размере 5 мкг/20 ЛЛ LPS-FITC выполняется на обезглавленной мыши, и лапа затем скачывается в течение периода времени, необходимого для цели эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Видео Рисунок 1. Стек Видео LPS-FITC поглощения в клетках в диком типе C57BL/6 мышей. Видео дермального слоя задней лапы мыши C57BL/6 перед инъекцией LPS-FITC. Подошвенный аспект мышиной лапы дикого типа был изображен в течение 15 минут до инъекции с LPS-FITC для контроля для автофлюоресценции, производимой в канале GFP. Существует практически нет сигнала в канале GFP, указывающих нет автофлюоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)

Видео Рисунок 2. Видео дермального слоя задней лапы мыши C57BL/6 после инъекции LPS-FITC. Подошвенный аспект мышиной лапы дикого типа был изображен в течение 1,5 часов после lpS-FITC инъекции для визуализации поглощения LPS-FITC всеми клетками, выражающими TLR4. Как видно из видео, множество клеток связывают и поглощение LPS-FITC на протяжении всего эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)

Видео Рисунок 3. Видео дермального слоя задней лапы FSP1cre; tdTomato мышь перед инъекцией LPS-FITC. Подошвенный аспект FSP1cre; tdTomato мышь лапа была изображена в течение 15 минут до инъекции с LPS-FITC для контроля для автофлюоресценции производится в канале GFP. Существует практически нет сигнала в канале GFP, указывающих нет автофлюоресценции. tdТо-положительные фибробласты визуализированы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)

Видео Рисунок 4. Видео дермального слоя задней лапы мыши TLR4KO перед инъекцией LPS-FITC. Подошвенный аспект мышиной лапы TLR4KO был изображен в течение 15 минут до инъекции с LPS-FITC для контроля для автофлюоресценции, производимой в канале GFP. Существует практически нет сигнала в канале GFP, указывающих нет автофлюоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)

Видео Рисунок 5. Видео дермального слоя задней лапы FSP1cre; tdTomato мышь после инъекции LPS-FITC.  Подошвенный аспект FSP1cre; tdTomato мышь лапа была изображена в течение 1,5 часов после LPS-FITC инъекции визуализировать поглощение LPS-FITC tdTomato-положительных фибробластов, выражающих TLR4. Как видно из видео, весьма специфическое поглощение LPS-FITC через TLR4, выраженное на tdTomato-положительных фибробластах, видно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)

Видео Рисунок 6. Видео дермального слоя задней лапы мыши TLR4KO после инъекции LPS-FITC.  Подошвенный аспект мышиной лапы TLR4KO был изображен в течение 1,5 часов после LPS-FITC инъекции, чтобы визуализировать, если поглощение LPS-FITC клетками в нокаут еле всего тела TLR4 возможно. Как видно на видео, не поглощение LPS-FITC не видно клетки в кожном слое задней лапы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.