Создание porcine Ex Vivo Cornea Модель для изучения лечения наркомании против бактериального кератита

Инфекции роговицы являются важными причинами слепоты и происходят в масштабах эпидемии в странах с низким и средним уровнем дохода. Этиология заболевания варьируется от региона к региону, но бактерии составляют подавляющее большинство этих случаев. Pseudomonas aeruginosa является важным патогеном, который вызывает быстро прогрессирующее заболевание. Во многих случаях пациенты остаются с стромальными рубцами, нерегулярным астигматизмом, требуют пересадки или в худшем случае теряют^{глаз 1,2.}

Бактериальный кератит, вызванный P. aeruginosa является трудно глазной инфекции для лечения особенно в связи с увеличением появления противомикробных устойчивых штаммов P. aeruginosa. В течение последнего десятилетия, стало очевидно, что тестирование и разработка новых методов лечения инфекций роговицы, в целом, и те, вызванные Pseudomonas sp., в частности, имеют важное значение для борьбы с нынешней тенденцией в устойчивости к^{антибиотикам 3}.

Для тестирования эффективности новых методов лечения инфекций роговицы, обычные микробиологические методы in vitro являются плохой суррогатной из-за разницы в бактериальной физиологии во время лабораторной культуры и во время инфекций in vivo, а также из-за отсутствия^{интерфейса хозяина 4,5}. В vivo животных моделей, однако, являются дорогостоящими, трудоемкими, может доставить лишь небольшое количество репликаций и поднять озабоченность по поводу благополучия животных.

В этой статье мы демонстрируем простую и воспроизводимую органотипную модель свинины ex vivo, которая может быть использована для тестирования различных методов лечения острых и хронических инфекций. Мы использовали P. aeruginosa для этого эксперимента, но модель также хорошо работает с другими бактериями, и организмы, такие как грибы и дрожжи, которые вызывают кератит.

Альбино лабораторных кроликов были принесены в жертву в лаборатории для других запланированных экспериментальных работ в соответствии с домашним офисом утвержденных протоколов. Глаза не были необходимы для экспериментального использования в этих исследованиях, поэтому они были использованы для этого протокола.

1. Стерилизация

1. CRITICAL STEP: Дезинфицировать все типсы и ножницы, замачивая в течение 1 ч в 5% (v/v) раствор Distel в дистиллированной воде, очистить щеткой, промыть водопроводной водой и стерилизовать в духовке при температуре 185 градусов по Цельсию в течение как минимум 2 ч.
2. Стерилизовать все остальные стеклянные изделия и реагенты, автоклав при 121 градусе по Цельсию в течение 15 минут или подготовить реагенты в соответствии с инструкциями производителя. Выполнить следующие процедуры в кабинете безопасности микробиологии II класса.

2. Сбор образцов

1. Коллекция свиных глаз
   1. Большие белые сеют землю, был использован крест с кабаном Хэмпшира. Звери были ошеломлены электрическим током и глаза были enucleated 2 ч позже в скотобойне.
   2. CRITICAL STEP: После того, как enucleated, передать глаза в лабораторию в стерильный фосфат буферизированный солевой раствор (PBS), чтобы предотвратить их от высыхания и обрабатывать их сразу по прибытии.
2. Коллекция кролика глаза
   1. Акциз роговицы и отправить в лабораторию в стерильных PBS.

3. Подготовка роговицы кнопки

1. Используйте стерильные типсы, чтобы удерживать ткани, окружающие глазное яблоко, и передавать его в чашку Петри. Удалите конъюнктиву и мышечную ткань вокруг глазного яблока на чашке Петри с помощью скальпельного лезвия No 15 и типсов.
2. Аккуратно поднимите глазное яблоко, удерживая зрительный нерв с типсами и перенесите в банку 0,5 л, наполненную стерильным PBS.
3. После того, как все глаза очищены от окружающих тканей, переместить их с помощью стерильных типсов в другой 0,5 л банку заполнены 3% (V / V) povidone йода в PBS и оставить на 1 мин.
4. Перенесите глазные яблоки в другую банку 0,5 л со стерильным PBS.
5. Используйте типсы, чтобы держать глаз еще на чашке Петри и сделать разрез возле роговицы скальпелем лезвие No 10A.
6. CRITICAL STEP: Держите край разреза и используйте ножницы, чтобы подрезать роговицу, оставляя около 3 мм склеры, окружающей роговицу. Убедитесь, что острый конец ножниц не пронзает радужную оболочку или хороидную ткань и находится в надхоровидном пространстве.
7. Держите роговицы кнопку с типсами и использовать другую пару остроконечных конечных типсов, чтобы мягко отделить увеальной ткани.
8. Поднимите роговицу от оставшегося глобуса и кратко промойте ее в 1,5% (v/v) раствора йода в PBS в 12 хорошо пластины.
9. Поместите роговицу кнопку в другой 12 хорошо пластины заполнены стерильными PBS.
10. После обработки всех глаз(рекомендуется максимум 40 глаз в одной партии),поместите каждую роговицу кнопку на индивидуальную чашку Петри (диаметр 34 мм) эпителиальной стороной вверх и влейте в 3 мл среды культуры предварительно разогретую до 37 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Состав среды культуры таков: модифицированная среда орла Дульбекко (DMEM): Хам в «1:1» дополнен 5^{мкгл -1} инсулином и 10^{ng'mL -1} эпидермальным фактором роста (EGF), 10% (v/v) сывороткой теленка плода (FCS), 100^{U'mL -1} penicillin, 100 УМЛ^-1 стрептомицин и 2,5^{мкг-мл -1} амфотерицин Б. В качестве дополнительного шага, среда может быть дополнена 50^{г-л -1} декстран, чтобы предотвратить отек вырезанной роговицы во время дальнейших шагов инкубации.
11. Инкубация при 37 градусов по Цельсию в инкубаторе культуры увлажненной ткани.

4. Обслуживание кукурузных кнопок

1. Через 24 часа используйте асептический метод для удаления мультимедиа и замены 3 мл свежих предварительно разогретых средств культуры, содержащих антибиотики. Держите роговицы кнопки в средствах массовой информации с антибиотиками в течение 48 ч для дезинфекции роговицы. Инкубация при 37 градусов по Цельсию в инкубаторе культуры увлажненной ткани.
2. CRITICAL STEP: После 48 часов, удалить средства массовой информации и промыть роговицы с 2 мл PBS. Затем держите кукурузные кнопок в без антибиотиков средств массовой информации в течение как минимум двух или в идеале за три дня до экспериментальной инфекции, чтобы удалить остаточные антибиотики из ткани.
3. Инкубация при 37 градусов по Цельсию в инкубаторе культуры увлажненной ткани. Изменение средств массовой информации по крайней мере еще раз в течение этих трех дней. Откажитесь от роговицы, если какая-либо мутность развивается в среде, свободной от антибиотиков.

5. Подготовка инокулума

1. Налейте 10 мл бульона LB в коническую колбу 50 мл с пенопластовой пробкой.
2. Передача колонии P. aeruginosa штамм PAO1 или штамм PA14 из свежей пластины агара и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 3-4 ч, пока бактерии находятся в середине этапа журнала.
3. Перенесите культуру бактерий в трубку и центрифугу 50 мл при 3000 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторно приостановить гранулы клетки в PBS.
4. Повторите шаг 5.3 еще два раза, чтобы вымыть клетки. Повторно приостанавливайте гранулы клеток в PBS и отрегулируйте оптическую плотность на 600 нм примерно до 0,6, используя стерильный PBS в качестве пробела.

6. Заражение роговицы кнопку

1. Удалить средства массовой информации из чашки Петри и промыть роговицы дважды с 1 мл стерильных PBS.
2. Аккуратно сожмите типсы, удерживая роговицу между ними. Используйте скальпель 10A, чтобы сделать четыре разреза - два вертикальных, два горизонтальных - в центральной части роговицы кнопки через эпителиальный слой к основной строме.
3. Поместите стерильную стеклянную форму в 6-хорошо пластины с широкой частью вверх и место роговицы в середине стеклянной формы, эпителия стороны лицом вниз. Сделайте разрез прямо в центре нижней части стеклянной формы.
4. CRITICAL STEP: Налейте 1 мл 1% (w/v) низкой точки плавления агара, растворенного в DMEM, чтобы полностью заполнить стеклянную форму роговицей.
5. Разрешить агар установить, а затем инвертировать стеклянную форму так, что эпителий роговицы сталкивается вверх.
6. Pipette 15 йл бактериальной культуры с OD_600nm 0,6 (для P. aeruginosa это приравнивается к примерно 1 х^{10 7 единиц} колонии формирования (CFU) в 15 йл) непосредственно в разрезе области, а затем добавить 85 йЛ PBS к вершине, чтобы сохранить эпителий роговицы влажной. Разбавить оставшуюся бактериальную культуру и пластину на агаре, чтобы посчитать колонию, образуя единицы для инокулума.
7. Добавить 1 мл DMEM без антибиотиков на дно каждого хорошо со стеклянной плесенью. Инкубировать 6-хорошо пластины с инфицированными роговицы кнопки в увлажненной инкубатор при 37 градусов по Цельсию с 5% CO₂ на срок до 24 ч.
8. Настройка неинфицированных контроля роговицы наряду с каждым экспериментом. Чтобы настроить неинфицированный контроль, замените 15 МКЛ бактериальной культуры в шаге 6.6 стерильным PBS.

7. Гомогенизация роговицы для сбора бактерий

1. Отбросьте среду DMEM из нижней части пластины 6 хорошо и добавить 1 мл стерильных PBS для полоскания нижней части хорошо.
2. Снимите PBS осторожно, трубя, не касаясь центральной части роговицы кнопки. Снимите стеклянное кольцо с помощью стерильных типсов и поместите его в 5% Distel.
3. Аккуратно промойте верхнюю часть роговицы с помощью 1 мл PBS дважды .optional.
4. Держите край роговицы кнопку с тонкой типсы кончика и отделить его от агара под ним.
5. Перенесите роговицу в трубку 50 мл, наполненную ледяным холодом 1-2 мл PBS.
6. Используйте тонкий кончик гомогенизатора, чтобы чисто верхней части инфицированной роговицы. Ткань не должна быть полностью ликвидирована. Гомогенизатор помогает отделить бактерии от эпителия роговицы и области разреза.
7. Vortex роговицы в PBS в течение нескольких секунд, чтобы смешать содержимое.
8. Добавьте 20 МКЛ гомогената в 180 МКЛ PBS и выполните серийные разбавления в пластине 96 хорошо.
9. Серийно разбавляют суспензию до 10^-4 и 10^-5 разбавления и пипетки 10 МКЛ разбавленного гомогената бактериями на агарную пластину крови. Инкубировать тарелку в течение 8 часов и подсчитать количество CFU. При тестировании эффекта противомикробных препаратов, соответствующий фактор разбавления должны быть прибыли в экспериментальном порядке.

Дизайн стеклянных форм являются инновационной и оригинальной идеей, использование которой позволило нам настроить модель в последовательной моды с минимальными / нет проблем с загрязнением. Формы были подготовлены стеклодувом в Университете Шеффилда на основе дизайна(рисунок 1A). Экспериментальная установка поддерживает вытявную форму роговицы и держит бактерии на верхней части эпителия, где происходит инфекция(рисунок 1B).

Свиные роговицы обычно набухают после нескольких дней в среде. Это нормально, и мы обнаружили, что не было никакой существенной разницы между роговицы с и без добавления декстрана, который обычно добавляется для предотвращения отек роговицы (Рисунок 1H). Роговицы, как правило, ранены, чтобы помочь бактериям проникнуть в эпителий. Хотя не было существенной разницы в прогрессе инфекции между ранеными (вырезать) и раскручивается (необрезанный) роговицы, мы заметили больше различий между репликациями в необрезанных роговицы (Рисунок 1C). Мытье роговицы дважды с PBS удаляет избыток бактерий, которые не прикрепляются к эпителию. Существовала значительная разница в CFU между промытой и немытой свиной роговицы инфицированных P. aeruginosa PAO1 в течение 24 часов(рисунок 1D). Не было существенной разницы в подсчетах CFU между свиной и кролик роговицы инфицированных PA14 и PAO1(рисунок 1E,1F). Результаты для обеих моделей были воспроизведены. После 24 часов, роговица инфицированных либо Pseudomonas штамм всегда развивается непрозрачность и разрез области становится более заметным и открытым по сравнению с неинфицированных роговицы (Рисунок 1G).

Рисунок 1: Ex vivo роговицы инфицированных Pseudomonas aeruginosa. (A) Схематическая картина стеклянной формы, используемой для поддержания формы роговицы и облегчения введения бактерий и лечения. Толщина стеклянных форм составляет 1,5 мм и такая же, как толщина пробирок из борозиликатного стекла. (B)Схематическая картина экспериментальной настройки. (C) Тестирование влияния раны на окончательный отсчет CFU после гомогенизации. Необрезанные (n No 16) и разрезанные (n No 28) роговицы были инфицированы P. aeruginosa PAO1 и P. aeruginosa PA14 в течение 24 часов. Роговицы промыли 1 мл PBS до гомогенизации. Бары ошибок указывают на стандартное отклонение. (D) Тестирование эффекта мытья роговицы с 2 х 1 мл PBS (n No 6) и не мыть (n No 6) на окончательный отсчет CFU после заражения P. aeruginosa PAO1 в течение 24 часов. Бары ошибок указывают на стандартное отклонение. (E ) Окончательный отсчет CFU в свиной роговицы инфицированных P. aeruginosa PAO1 и P. aeruginosa PA14 в течение 24 часов (n No 10). Корнеи промыли и порезали. Бары ошибок указывают на стандартное отклонение. (F ) Окончательный отсчет CFU в роговицах кролика зараженных P. aeruginosa PAO1 и P. aeruginosa PA14 в течение 24 часов (n No 6). Корнеи промыли и порезали. Бары ошибок указывают на стандартное отклонение. (G) Фотографии ex vivo свиней роговицы, инфицированных P. aeruginosa PAO1 в течение 24 часов. Контроль был ранен, но никаких бактерий не было добавлено. Зараженные роговицы были ранены и 107 CFU были добавлены в сторону разреза. Нет CFU были извлечены из контроля роговицы. (H) Окончательный CFU выздоровел после 24 часов инфекции с P. aeruginosa PAO1 от роговицы лечение декстрана (n No 2) и те, без декстрана (n No 9). Корнеи промыли и порезали. Бары ошибок указывают на стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Авторов нечего раскрывать.