Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Чик цилиарной ганглии (CG) являются частью парасимпатической нервной системы. Нейронные культуры цыпленка CG нейронов было показано, что эффективные модели клеток в изучении взаимодействия мышц нерва. Мы описываем подробный протокол для вскрытия, диссоциации и культуры in vitro нейронов CG от эмбрионов птенцов.

Abstract

Чик цилиарной ганглии (CG) являются частью парасимпатической нервной системы и отвечают за иннервацию мышечных тканей, присутствующих в глазу. Этот ганглия состоит из однородной популяции цилиарных и хороидальных нейронов, которые иннервировать полосатые и гладкие мышечные волокна, соответственно. Каждый из этих нейронных типов регулирует определенные структуры глаз и функции. На протяжении многих лет, нейронные культуры цыпленка цилиарных ганглиев было показано, чтобы быть эффективными моделями клеток в изучении мышечно-нервной системы взаимодействий, которые общаются через холинергические синапсы. Ciliary ганглия нейроны, в большинстве, холинергические. Эта модель клеток была показана, чтобы быть полезным сравнительно ранее использовались неоднородные модели клеток, которые состоят из нескольких типов нейронов, кроме холинергических. Анатомически, цилиарный ганглия локализована между зрительным нервом (ON) и трещиной хороида (CF). Здесь мы описываем подробную процедуру вскрытия, диссоциации и культуры in vitro цилиарных ганглиев нейронов из эмбрионов птенцов. Мы предоставляем пошаговый протокол для получения высоко чистых и стабильных клеточных культур нейронов CG, подчеркивая ключевые этапы процесса. Эти культуры могут поддерживаться в пробирке в течение 15 дней, и, таким образом, мы показываем нормальное развитие cg культур. Результаты также показывают, что эти нейроны могут взаимодействовать с мышечными волокнами через нейро-мышечные холинергические синапсы.

Introduction

Цилиаровые ганглия (CG) нейроны принадлежат к парасимпатической нервной системы. Эти нейроны холинергические, будучи в состоянии установить muscarinic или никотиновых синапсов^1,2,3. Анатомически, CG расположен в задней части глаза между зрительным нервом (ON) и трещины сосудистой системы (CF) и состоит из около 6000 нейронов в ранних эмбриональных стадиях^1,4. В течение первой недели в культуре, цилиарные ганглия нейроны представляют многополярную морфологию. Через неделю они начинают переходить в однополярное состояние, при этом один неврит расширяется и образует аксон^5. Кроме того, примерно половина нейронов CG умирают между^8-м и 14-м днем развития эмбриона цыпленка, через запрограммированный процесс клеточной смерти.^th Это снижение числа нейронов приводит к общей популяции цилиарного ганглия около 3000 нейронов^6,7,8. В пробирке, нет сокращения числа нейронов CG, когда выросли с мышечными клетками⁹ и CG нейроны могут быть культивируется в течение нескольких недель^1,9.

Цилиарный ганглия состоит из однородной популяции цилиарных нейронов и хороидальных нейронов, каждый из которых представляет половину популяции нейронов в CG, иннервируя мышцы глаза. Эти два типа нейронов структурно, анатомически и функционально отличаются. Ciliary нейроны innervate полосатые мышечные волокна на радужной оболочке глаза и хрусталика, будучи ответственным за сокращение зрачка. Хороидальные нейроны иннервировать гладкую мышцу сосудистой^1,10,11,12.

Культуры куриных цилиарных ганглия нейронов было показано, что полезные инструменты для изучения нервно-мышечных синапсов и формирования синапса^1,5,9. Учитывая, что нервно-мышечные синапсы являются холинергические¹³, используя нейронной популяции, которая холинергический – CG нейронов – возникла в качестве потенциальной альтернативы предыдущим моделям клеток¹⁴. Эти модели состояли из неоднородной нейронной популяции, в которой лишь небольшая часть является холинергической. Кроме того, цилиарные ганглия нейроны развиваются относительно быстро in vitro, и примерно через 15 часов уже образуют синапсы¹. CG нейроны были использованы в качестве модели системы на протяжении многих лет для различных исследований, из-за его относительно легкости изоляции и манипуляции. Эти приложения включают в себя оптогенетические исследования, развитие синапса, апоптоз и нервно-мышечные взаимодействия^14,,15.

Мы описываем подробную процедуру вскрытия, диссоциации и культуры in vitro цилиарных ганглиев нейронов из эмбриональных эмбрионов 7 дня (Е7). Мы предоставляем пошаговый протокол для получения высоко чистых и стабильных клеточных культур холинергических нейронов. Мы также выделяем ключевые шаги протокола, которые требуют особого внимания и которые улучшат качество нейронных культур. Эти культуры могут поддерживаться в пробирке, по крайней мере 15 дней.

Protocol

1. Подготовка реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы, необходимые для этой процедуры являются следующие: щипцы (no 5 и Noo 55), хирургические пинцет, рассечение Петри блюда (черное дно), 24-хорошо пластины, пластиковые пастерская пипетки, огонь полированного стекла Пастер пипетки, 10 мл шприц, 0,22 мкм шприц фильтр.

1. Подготовка и стерилизация всех материалов, необходимых для протокола, включая стекло крышки, щипцы (No 5 и No 55), хирургические пинцет, Петри блюда (черное дно), дистиллированной H₂O, пипетки и материал для хирургии.
2. Приготовьте раствор 0,1 мг/мЛ Poly-D-Lysine (PDL).
   1. Восстановление PDL в буфере 0,1 М бората (рН 8.2) к концентрации 1 мг/мл (10x раствор).
   2. Разбавить 1:10 в буфере 166,6 мМ бората (рН 8,2) для получения конечной концентрации 0,1 мг/мл.
3. Приготовьте 10 мкг/мл ламинин раствора.
   1. Разбавить 1 мг/мл ламинина в простой нейробазальной среде до конечной концентрации 10 мкг/мл.
4. Подготовка сбалансированного раствора соли Хэнка (HBSS): 5.36 mM KCl, 0,44 мМ_{ХК 2}PO₄, 137 мМ NaCl, 4,16 мМ NaHCO3, 0,34 мМ На₂HPO₄2H₂O, 5 мМ глюкозы, 1 мМ натрия пируват, 10 мМ HEPES буфер, 0,001% фенол красный. Отрегулируйте рН до 7.2.
5. Подготовьте 0,1% трипсин решение.
   1. Растворите 5 мг трипсина 1:250 порошок в 5 мл HBSS для окончательной концентрации 0,1%.
   2. Поместите в роликовый миксер при 4 градусах Цельсия до полного растворения.
   3. Фильтр с помощью шприца 10 мл и фильтра шприца 0,22 м.
6. Подготовка цилиарной ганглии неполной среды:нейробазальной среды без глутамина, 1X B27 (фото-чувствительной), 10% тепло-инактивированной сыворотки лошади, 2% теплоинактивированных FBS, 12,5 U /mL пенициллин / стрептомицин (0,25x) и 2 мМ глутамин. Используйте стерильные реагенты и подготовьте среду в стерильных условиях.
7. Подготовка цилиарной ганглии полной среды (дополненной факторами роста): к неполной среде, добавьте 5 нг/мЛ GDNF и 5 нг/mL CNTF.

2. Приготовление стеклянных крышков для 24-х пластин

1. Поместите нужное количество стеклянных крышков внутри кислотоустойчивого контейнера и добавьте 65% азотной кислоты до тех пор, пока все крышки не будут погружены в воду. Поместите контейнер в орбитальный шейкер и инкубировать на ночь при комнатной температуре (RT) со скоростью 1000 об/мин.
2. На следующий день тщательно перенесите азотную кислоту в небольшой резервуар и храните для дальнейшего использования. Азотная кислота может быть повторно использована 2-3x.
3. Аккуратно добавьте дистиллированный H₂O в крышки, чтобы удалить оставшуюся азотную кислоту. Место в агитации в течение 30 минут, отбросить стиральный раствор и повторить это 5x.
4. Промыть крышки с 75% этанола в два раза.
5. Тщательно отделить и поместить отдельные крышки в металлическую стойку, покрытую алюминиевой фольгой и инкубировать при 50 oC в течение 10-15 минут или до тех пор, пока полностью высохнет.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не автоклав стекла coverslips, как они будут придерживаться друг к другу.
6. Стерилизовать крышки под ультрафиолетовым светом в течение 10-15 минут. Поддерживать крышки стерильными для культуры нейронных тканей.

3. Покрытие стеклянных крышков для 24-ну пластин

1. Используя стерильный пинцет, поместите один покрывало в каждый колодец 24-хорошо пластины.
2. Добавьте 500 мл 0,1 мг/мл PDL и инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию.
3. На следующий день, промыть крышки дважды с стерильной дистиллированной H₂O. Затем добавьте 500 мл дистиллированной воды в каждый налокотый листок и оставьте на 30 минут при комнатной температуре.
4. Отбросьте воду и добавьте 350 мл 10 мкг/мл ламинин раствора в каждом колодце.
5. Поместите в инкубатор с 37 градусами по Цельсию на 2 ч.
6. Перед клеточным покрытием, удалить раствор ламинина и промыть дважды с простой нейробасальной среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы крышки не высыхали в любое время.
7. Добавьте 300 мл полной среды и оставьте в инкубаторе при 37 градусах Цельсия и 5% CO₂ до времени покрытия. Перед покрытием клеток, удалить эту среду.

4. Культура цилиарных ганглиев из куриного эмбриона (эмбриональный день 7)

1. Вскрытие цилиарных ганглиев (CG)
   1. Удалить яйца из инкубатора и распылить их с 75% этанола.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца хранятся при 16 градусах Цельсия перед инкубацией при 37,7 градусов по Цельсию в течение 7 дней (или желаемой эмбриональной стадии). Яйца, используемые здесь, относятся к видам курицы Росса.
   2. Вырезать верхнюю часть яйца с ножницами и вынуть эмбрион с помощью ложки. Поместите эмбрион в чашку Петри с ледяной HBSS и отделить голову от тела путем резки в области шеи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как только эмбрион удаляется из яйцеклетки, он может производить протеазы, которые отвечают за гибель клеток. Важно быстро отделить голову от тела, как только эмбрион находится за пределами оболочки, чтобы свести к минимуму гибель клеток.
   3. Держите голову эмбриона в ледяной HBSS.
   4. Держите эмбрион голову вверх и исправить его в клюве цыпленка с no 5 щипцами. Затем с No 55 щипцами, начать удалять тонкий слой кожи вокруг глаза.
   5. Аккуратно удалите глаз и поверните его, чтобы получить доступ к задней части. Отделяя глаз от головы птенца, обратите внимание на оптический нерв, сеченный. Это поможет локализовать цилиарный ганглия.
   6. Как только глаз отделен, держать его с задней стороной вверх и обратите внимание на цилиарный ганглия, прилегающая к секционированному зрительному нерву и трещине сосудистой системы. Предганглионный нерв все еще может быть прикреплен к цилиарный ганглия, что облегчает его идентификацию.
   7. Вскрыть цилиарный ганглия от каждого глаза и очистить очень хорошо, удалив избыток ткани вокруг каждого ганглия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы иметь выход в размере 1×10⁶ ячеек/мЛ, вскрыть 70 КГ. Обратите внимание, что полученная популяция клеток содержит негенные клетки. Чтобы уменьшить количество ненегенальных клеток и, как следствие, повысить чистоту нейрональной популяции, очень важно максимально очистить цилиарные ганглии, удалив все лишнее ткани.
2. Диссоциация и культура цилиарной ганглии
   1. Соберите все цилиарные ганглии в трубку 15 мЛ с помощью стерильной пластиковой пастерской пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно предварительно промокнуть пастер пипетки, чтобы свести к минимуму крепление ганглиев к стене пипетки.
   2. Центрифуга цилиарных ганглиев в течение 2 минут при 200 х г.
   3. Осторожно, удалите все средства HBSS с помощью пастер-пипетки, а затем микропиетты P1000. Добавьте 1 мл 0,1% раствора трипсина и инкубировать в течение 20 минут при 37 градусах на водяной бане, без волнения.
   4. Центрифуга в течение 2 минут при 200 х г.
   5. Немедленно снимите раствор трипсина и добавьте 1 мл неполной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неполная среда содержит сыворотку, которая немедленно остановит эффект трипсина.
   6. Центрифуга в течение 2 минут при 200 х г и удалить все средние.
   7. Добавьте 350-500 мл полной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимый объем для разъединить клетки зависит от количества полученных килианых ганглиев и, таким образом, от полученного размера гранул. Для 70 CG рекомендуется использовать 500 мл среднего.
   8. Разъединяют CG путем pipetting вверх и вниз 10-15x сперва используя P1000 последовав за 10-15x используя fire-polished стекло Пастер pipette. Избегайте образования пузырьков воздуха, чтобы свести к минимуму потерю клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите сотовую подвеску на льду до покрытия.
   9. Определите плотность сотовой связи с помощью синего раствора Трипан и стандартной камеры Neubauer.
   10. Плита 1 х 10⁴ клетки/мл в каждом колодце 24-хорошо пластины путем разбавления соответствующего объема клеточной суспензии в 500 мл полной среды (дополнено 10 м 5′-FDU).
   11. Инкубировать клетки в 37 кк, 5% CO₂ инкубатора.

5. Иммуноцитохимия и анализ изображений цилиарных нейронов

1. Выполните иммуноцитохимию анализа, представленного в этой работе, как описано ранее^16,17.
2. Используйте следующие первичные антитела: моноклональный б-III тубулин мыши (1:1000, T8578), куриный моноклональный нейрофиламент М (1:1000, AB5735), мышиный моноклональный SV2 (1:10000, AB2315387).
3. В качестве вторичных антител, использовать Alexa Fluor 568-конъюгированных коза анти-мышки антитела (1:10000, A11031), Alexa Fluor 568-конъюгированных козы анти-куриные антитела (1:1000, A11041), Alexa Fluor 647-конъюгъюратный коза анти-мышелов антитела (1:1000, A22135).
4. Гора крышки с использованием монтажа среды с DAPI, для ядерного окрашивания (P36935).

Representative Results

Discussion

В этом протоколе мы продемонстрировали, как подготовить и культуры CG нейронов. Идентификация и вскрытие цилиарского ганглия может быть затруднено для неопытных пользователей. Поэтому мы представляем детальную и пошаговую процедуру, чтобы эффективно вскрыть е7 цыпленка цилиарной ганглии, разъединить ткани и подготовить нейронные культуры, которые могут поддерживаться, по крайней мере 15 дней. Цилиаровые ганглия нейронов, полученных с помощью этого протокола также подходят для совместного культуры с мышечными клетками.

Цилиаровые ганглии на различных стадиях развития эмбрионального развития цыпленка могут быть использованы в качестве клеточной модели, в зависимости от цели исследования. Тем не менее, для культур CG нейронов предлагается, чтобы они были изолированы от эмбриона цыпленка между эмбриональными днями 7 и 8¹⁸. На эмбриональной стадии E8, CG нейроны еще не претерпели процессов нейронной смерти и количество негенных клеток уменьшается сравнительно с нейронными клетками¹⁸. Это, в сочетании с строгой процедурой вскрытия и очень хорошо очищенные ганглии, будет способствовать очень чистой культуры цилиарных нейронов ганглия, с небольшим загрязнением неневральных клеток, таких как фибробласты или глиальные клетки.

Во время изоляции нейронов CG, одним из важнейших точек является идентификация и очистка CG. Вскрытие такой небольшой структуры, как цилиарный ганглия, может быть затруднено, учитывая локализацию, возможность идентифицировать ганглий, а также размер самого ганглия. Это нормально, что ганглии могут прикрепляться к щипцам во время вскрытия. Высококачественные инструменты вскрытия очень важны для успешного вскрытия и сводят к минимуму привязанность ганглиев к щипцам. Очистка GC имеет важное значение для предотвращения загрязнения негеннаальными клетками. Необходимо изолировать около 70 ганглиев, чтобы получить клеточную плотность 1×10⁶ клеток/мЛ, в отличие от других нейрональных тканей периферической нервной системы, которые имеют 5-15x большее количество ганглиев^3.

В культуре добавление 5′-FDU к полной среде уменьшает загрязнение культуры GC нене нейрональными клетками. 5′-FDU является антимитическим соединением, которое подавляет пролиферацию клеток, а именно пролиферацию глиальных клеток и фибробластов. Концентрация 5′-FDU добавил к среде достаточно, чтобы остановить клеточный цикл в фазе S, но не наносит ущерба для нормального развития CG нейронов^3,19,20. Время лечения с 5′-FDU может быть скорректировано. Однако, так как CG нейроны установить плотную аксональную сеть в течение короткого времени, 5′-FDU должны быть добавлены к культуре уже во время покрытия.

Одним из основных ограничений данной модели является то, что она не является репрезентативной для нормального развития CG нейронов в физиологических условиях. В ово, около половины нейронов CG умирают между^8-м и 14-м днем развития эмбриона цыпленка. В культуре, нет снижения числа нейронов CG, когда среда дополняется нейротрофических факторов, которые позволяют его выживания^1,6,14.

Нейронная популяция, полученная в результате вскрытия птеняйного цилиарного ганглия, представляет собой однородную популяцию холинергических нейронов, принадлежащих к вегетативной нервной системе. Следует отметить, что выражение нейротрансмиттеров в популяции сосудистой системы CG является целевым, что может быть затруднено в зависимости от типа мышц, используемых в ко-культуры²⁴. Если цель исследования связана с генетической идентичности или подтипа самого моторного нейрона, то CG нейроны не могут быть наиболее подходящей нейронной модели. Кроме того, специфика моторных нейронов в иннервации мышечных волокон не может быть достигнуто при использовании CG нейронов совместно культур, поскольку, в этом случае, мышечные волокна могут быть умножены innervated²⁵. Тем не менее, эта нейронная культура имеет ряд преимуществ, она требует только базового оборудования для поддержания и инкубации яиц, это достаточно недорогая процедура и, что более важно, обеспечивает отличную модель для изучения нервно-мышечных синапсов¹, так как CG нейронов нейротрансмиссии механизмов очень похожи на те, которые происходят в спинномозговых нейронов двигателя. Модели клеток, ранее использовавшиеся для этих типов исследований, были сенсорными нейронами из спинного мозга^{12,,21,,22,,23}. Тем не менее, эти со-культуры состояли из неоднородной популяции нейронов, не все холинергические и, таким образом, только небольшая часть нейронов смогли установить функциональные контакты с мышечными клетками¹. Помимо анализа развития (иммуноцитохимия), продемонстрированной в этой работе, другие анализы могут быть выполнены в культурах CG, таких как электрофизиология и выживание нейронов.

На основе этого протокола могут быть решены дополнительные научные вопросы, например, как субклеточная локализация конкретных мРНК и белков регулирует образование и функцию синапса. Кроме того, нервно-мышечные со-культуры могут быть легко установлены и в дальнейшем использоваться для изучения нервно-мышечных заболеваний, когда место травмы является нервно-мышечного соединения. Нервно-мышечные заболевания являются неоднородными в природе в том смысле, что дисфункция может быть связана с самой мышцей, периферических нервов или нервно-мышечных соединений²⁶. Таким образом, с помощью этих со-культур можно было бы изучить нервно-мышечные изменения соединения, которые в конечном итоге лежат в основе развития и прогрессирования нервно-мышечных заболеваний. Еще одна интересная возможность состоит в том, чтобы адаптировать этот протокол к системе тройниной мыши. Эти нейроны легко доступны, и их модель развития хорошо известна²⁷. Потому что мыши поддаются генетическим манипуляциям и тройная система хорошо характеризуется с точки зрения топографического формирования карты новые возможности возникают с помощью протокола на основе тройниминальной для изучения развития нейронов.

Materials

5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU)	Merck (Sigma Aldrich)	F0503
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody	Thermo Fisher Scientific	A11041
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody	Thermo Fisher Scientific	A11031
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody	Thermo Fisher Scientific	A21235
B27 supplement (50x), serum free	Invitrogen (Gibco)	17504-044
Chicken monoclonal neurofilament M	Merck (Sigma Aldrich)	AB5735
D-(+)-Glucose monohydrate	VWR	24371.297
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil	Invitrogen (Gibco)	10270-106
HEPES, fine white crystals, for molecular biology	Fisher Scientific	10397023
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin	Invitrogen (Gibco)	26050-070
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen (Gibco)	25030-081
Mouse laminin I	Cultrex (R&D systems)	3400-010-02
Mouse monoclonal b-III tubulin	Merck (Sigma Aldrich)	T8578
Mouse monoclonal SV2	DSHB	AB2315387
Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x)	Thermo Fisher Scientific	11874235
Neurobasal medium without glutamine	Invitrogen (Gibco)	21103-049
Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL)	Invitrogen (Gibco)	15070-063
Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture	Merck (Sigma Aldrich)	P3532
Poly-D-Lysine	Merck (Sigma Aldrich)	P7886
Potassium chloride	Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals)	31248-1KG
Potassium di-hydrogen phosphate (KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>) for analysis, ACS	Panreac Applichem	131509-1000
Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI	Invitrogen (Gibco)	P36935
Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2&micro;m, sterile 50/pk	Fisher Scientific	10462200
Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Peprotech	450-13
Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)	Peprotech	450-10
Sodium chloride for analysis, ACS, ISO	Panreac Applichem	131659-1000
Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>&middot;2H<sub>2</sub>O), pure, pharma grade	Panreac Applichem	141677-1000
Sodium Pyruvate 100 mM (100x)	Thermo Fisher	11360039
Syringe without needle, 10 mL	Thermo Fisher	11587292
Trypsin 1:250 powder	Invitrogen (Gibco)	27250-018