Создание и обслуживание живого биобанка - Как мы это делаем

В последние годы накопленные знания о морфологических, клинических и генетических свойствах рака привели к зачатию рака как неоднородного, индивидуального заболевания. Следовательно, мутационная характеристика неоплазм, помимо клинических и патологических особенностей, приобрела важное значение для принятия клинических решений, и многие целевые методы лечения были разработаны для различных молекулярных изменений. Например, эффективность cetuximab в лечении колоректального рака можно предсказать путем анализа KRAS и PIK3CA мутационного статуса¹. Точность медицины направлена на индивидуальный подход, чтобы обеспечить самый высокий ответ лечения в каждом пациенте и избежать токсичности неэффективной терапии². Биобанки содержат ткани, кровь и другие биологические материалы онкологических больных, которые связаны с клиническими данными, и, таким образом, являются отличным инструментом для трансляционных исследований рака. Из-за большого количества клинических образцов, биобанки позволяют обнаруживать редкие, но потенциально наркотические мутации, что предоставляет новые возможности лечения для отдельного пациента³.

Чтобы охватить как можно более широкий спектр онкологических исследований, мы не сдерживали нашу активность только по сбору образцов, а сосредоточились на создании линий раковых клеток, полученных пациентом, и ксенотрансплантатов (PDX). Традиционные 2D клеточные линии остаются угловым камнем исследований in vitro и являются главным выбором для крупномасштабных^{скринингов наркотиков 4,5.} Кроме того, анализ клеточной линии часто проще, дешевле и доступнее. Дополнительно, в виду того что пациент-производные периферические лимфоциты крови (PBL) имеющиеся, также иммунология тумора можно изучить in vitro^6. Тем не менее, большинство недавно разработанных препаратов с перспективными доклинической эффективностью в клеточной основе in vitro или in vivo эксперименты, показали неутешительные результаты в клинических^{испытаниях 7}. В отличие от этого, доклинические исследования, основанные на PDX in vivo исследования отражают клиническую активность антинеопластических агентов гораздо более точно⁸. Поскольку ткань PDX тесно отражает гистологические и молекулярные свойства донорской опухоли, модели PDX являются хорошим способом распространения часто очень ограниченного количества жизнеспособных опухолевых тканей для поддержания целостности биобанка и обеспечения обмена образцами между исследовательскими группами и учреждениями. Кроме того, линии раковых клеток, полученные из ткани PDX могут быть установлены значительно проще, чем первичные линии раковых^{клеток 9.} В последние годы наша рабочая группа создала всеобъемлющий комплексный биобанк колоректального и поджелудочного рака путем пошаговой стандартизации и оптимизации рабочего потока для всех биологических образцов, о которомидет речь (рисунок 1).

Рисунок 1: Рабочий процесс и организация биобанка Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Следующее исследование было одобрено институциональным советом по обзору Университетского медицинского центра Росток (II HV 43/2004, A 45/2007, A 2018-0054, A 2019-0187 и A 2019-0222). Кроме того, все ветеринарные соответствующие процедуры были утверждены Landesamt f'р Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern под регистрационными номерами LALLF M-V/TSD/ 7221.3-2-020/17 и 7221.3-1-007/19.

1. Экспериментальные предпосылки

1. Выполнить несколько важных рамочных условий для создания и поддержания биобанка.
   1. Используйте клинику с хирургическим отделением и достаточным количеством онкологических ресекций вместе с хорошо оборудованной лабораторией и достаточным академическим персоналом. Хорошей инфраструктурой и твердой связью с сотрудничающим патологическим отделением являются дополнительные предпосылки.
   2. Для исследований in vivo используйте животное учреждение с жилищными условиями, подходящими для иммунодефицитных мышей.
   3. Получить разрешение на любое исследование материалов, полученных от пациентов, в комитете по этике здравоохранения. Получить одобрение на любые исследования in vivo от компетентного органа в соответствии с местными нормативными актами.

2. Сбор образцов

1. За день до операции
   1. Оцените всех пациентов с ресектаблным колоректальным или поджелудочной раком и/или соответствующими метастазами для биобанкинга. Избегайте включения случаев с неоадъювантной предварительной обработки, очень маленькие опухоли, опухоли неопределенного достоинства или поражения, которые были частично resected эндоскопически раньше.
   2. Получить письменное одобрение участия пациента во время информированного обсуждения согласия о хирургической процедуре. Своевременно информируют всех задействованных хирургов, лабораторную команду, а также патологоанатома.
2. Приобретение образцов
   1. Сообщите всем обслуживающему персоналу в отделении (OR) о сборе тканей для биобанка непосредственно перед началом хирургической процедуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы ткань не должна быть зафиксирована в формалине. Если ткань погружена в формалин, она становится непригодной для комплексного биобанкинга.
   2. Нарисуйте 40 мл гепаринизированной крови (2 х 20 мл шприца), а также стандартную трубку сыворотки 7,5 мл сразу после анестезии индукции и быстро перенесите в лабораторию для изоляции PBL и обработки сыворотки (см. шаг 3-4).
   3. Получить ресектированную образец непосредственно с операционного стола, поместить его в соответствующий контейнер и отвезти в патологическое отделение. Запишите временную точку отрыва от кровообращения, ресекции и прибытия при патологии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пригодность образца для био-банкинга должна быть оценена сотрудничающий патологоанатом, который вскрывает кусок опухоли и не злокачественных тканей. Не акцизных каких-либо частей образца самостоятельно, которые могут поставить под угрозу последующего патологического доклада.
   4. Поместите обе части ткани в отдельную полипропилевую трубку объемом от 15 до 50 мл с раствором для хранения тканей 10-30 мл (или DPBS) на льду. Запишите время получения и немедленно перенесите образцы в лабораторию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие этапы протокола 3-6 должны проводиться в шкафу ламинарного потока в строгих стерильных условиях. Используйте все жидкости при комнатной температуре.

3. Обработка сыворотки

1. Центрифуга 7,5 мл сывороточной трубки при 1128 х г и 4 градусов по Цельсию в течение 15 мин в предварительно охлажденой центрифуге.
2. Aliquot 1 мл сыворотки на трубку в предварительно помеченных криотрубок и заморозить в жидком азоте.

4. Изоляция PBL по плотности градиентной центрифугации

ПРИМЕЧАНИЕ: Работа параллельно с каждым из двух шприцев 20 мл.

1. Заполните 20 мл гепаринизированной крови в полипропиленую трубку 50 мл и добавьте 15 мл DPBS.
2. Возьмите 15 мл Pancoll с серологическим пипеткой, вставьте пипетку тщательно всю дорогу до нижней части полипропилена трубки и отпустите Pancoll очень медленно, чтобы сформировать слой под кровью / DBPS колонке.
3. Центрифуга при 375 x g в течение 15 мин без тормоза.
4. Аспирировать и передавать непрозрачный межфазный слой между средней и верхней колонкой обоих образцов в свежую 50 мл полипропиленовой трубки и заполнить DPBS до 50 мл.
5. Центрифуга при 270 x g в течение 15 мин с тормозом.
6. Аспират и отбросить супернатант, повторно поместью клеточной гранулы в 4,5 мл морозильной камеры среды.
7. Aliquot 1,5 мл подвески на криотруб, плотно закрыть трубки и поместить их в замораживающий контейнер подходит для медленного замораживания и хранить при -80 градусов по Цельсию.

5. Обработка тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Начните с генерации оснастки замороженных образцов опухоли и здоровой ткани для поддержания целостности нуклеиновых кислот.

1. Образец опухолевой ткани
   1. Перенесите образец опухоли с помощью нескольких мл раствора хранения тканей из полипропилевой трубки в чашку Петри. При необходимости промыть DPBS. Избегайте прикосновения к образцу и используйте два стерильных скальпеля для обработки ткани. Избегайте высыхания в любое время.
   2. Взвесьте образец опухоли в удобном масштабе в отдельной тарелке и обратите внимание на вес ткани.
   3. Оцените размер, форму и качество тканей опухолевой ткани перед резки. Цель получить по крайней мере один кусок размером с булавочную головку для замораживания оснастки и четыре куба приблизительно 30 мм³ (длина края 3 х 3x 3 мм) каждый для жизненно важного криоконсервации. Создать как можно больше 30 мм^3-кубов в четыре раза, как это возможно, и генерировать один кусок для оснастки замораживания на 5 четверных. Также примите во внимание, что некротические части должны быть отрезаны так, чтобы кубики состояли только из жизненно важных тканей.
   4. Создать ломтики толщиной 3 мм. Отрежьте некротические части, различимые как гелеобразная или жидкая масса, и нарежьте ломтики кубиками двух желаемых размеров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не отбрасывайте ткани на данный момент.
   5. Snap замораживания
      1. Этикетка криотрубов соответственно (см. шаг 7.7).
      2. Поместите один маленький кусок ткани на предварительно помеченную криотрубу. Погрузив образцы сразу в жидкий азот в течение нескольких минут и хранить при -80 градусов по Цельсию впоследствии.
   6. Криоконсервация жизненно важных тканей
      1. Этикетка криотрубы соответственно (см. шаг 7.7) и заполнить каждый с 1,5 мл морозильной камеры среды. Поместите замораживающий контейнер рядом со скамейкой.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте следующим шагам как можно быстрее. Поскольку DMSO в морозильной камере имеет цитотоксические свойства, время погружения ткани в морозильную камеру среды без надлежащего охлаждения не должно превышать 2 минут.
      2. Упорядочить 30 мм^{3 куба} в четыре раза. Бросьте некротические ткани и другие остатки к краю блюда, но не отбрасывайте их.
      3. Scoop кубов с лезвием скальпеля и передачи 4 кубиков на криотрубь. Убедитесь, что опухолевые части полностью погружены в морозильную камеру среды. Закройте трубки плотно и поместите их в морозильную камеру, подходящую для медленного замораживания, и храните в морозильной камере .80 градусов по Цельсию.
      4. Передача криотрубов в подходящую систему хранения для длительного хранения при -140 градусов по Цельсию или ниже. Документация в системе управления лабораторными запасами является обязательной.
2. Здоровый образец ткани: Повторите шаги 5.1.1. до 5.1.6.4 для образца здоровых тканей.

6. Культура первичных клеток

1. Распад остатков опухолевой ткани, в том числе некротического лома, в чашке Петри скальпелями на куски как можно меньше.
2. Поместите стерильный клеточный ситечко (размер 100 мкм поры) поверх полипропиленной трубки 50 мл.
3. Используйте серологическую пипету, чтобы добавить 5-10 мл DPBS в чашку Петри, плавать остатки ткани и пипетки вверх и вниз, чтобы генерировать подвеску.
4. Перенесите подвеску с пипеткой на клеточный ситечко.
5. Повторите шаги 6.3-6.4 до тех пор, пока все остатки ткани не будут решены из чашки Петри.
6. Используйте поршень из 20 мл в одну сторону шприц, чтобы сжать клетки и ткани подвески через клетки ситечко.
7. Промыть 5-10 мл свежего DPBS, отбросить клеточный ситечко и закрыть трубку должным образом.
8. Центрифуга подвески на 180 х г в течение 5-10 минут.
9. Подготовка коллагена-I precoated 6 хорошо пластины с 1,5 мл среднего на колодец.
10. Аспирировать и отказаться от супернатанта. Переусердуйте гранулы в 3 мл DPBS или среднего и добавьте 500 мл подвески к каждой хорошо. Поместите пластину в инкубатор (100% влажность, 5% CO₂, 37 градусов по Цельсию)
11. Мониторинг пластины ежедневно для роста клеток и загрязнения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дальнейшее культивирование клеток до момента создания постоянной клеточной линии здесь не описано.

7. Поколение PDX

1. Проводитьэксперименты i n vivo только соответствующими квалифицированными лицами, соответствующими требованиям компетентного органа вашей юрисдикции.
2. Дом иммунодефицитных мышей в условиях, свободных от специфических патогенов (SPF), удовлетворяющих требованиям используемого штамма мыши. Гигиенические меры включают индивидуально проветриваемые клетки, автоклавную пищу, воду и вложенный материал, а также замок безопасности воздуха и ношение личного защитного оборудования.
3. Автоклав все инструменты заранее и использовать только один набор инструментов для каждого случая опухоли, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Обработать опухолевые ткани как можно более асептические. Все пластиковые предметы, названные ниже, должны быть стерильными, одноразовыми и отбрасываются после каждой операции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Определяется методом замораживания четырех частей опухолевых тканей на криотрубку, поколение PDX требует всегда двух мышей на образец, в идеале в результате чего четыре опухоли PDX.
4. Выбрать желаемую первичную опухоль для присытения через лабораторную систему управления запасами и перенести образец (жизненно сохранившуюся опухолевую ткань) из основного резервуара для хранения в переносной контейнер с жидким азотом (также удобно хранение при -80 градусов по Цельсию на сухом льду).
5. Натейте средства индивидуальной защиты перед входом в SPF-секцию (скрабы, засорения, фартук, крышка для волос, хирургическая маска и оковы), дезинфицировать руки и все оборудование.
6. Матригель замачивания
   1. Удалите криотрубки из контейнера с жидким азотом и ожидая оттаивания образца.
   2. Этикетка 50 мл полипропиленовой трубки и заполнить 35 мл DPBS.
   3. Наклоните криотруб вверх и вниз и немедленно перенесите содержимое в полипропиленовую трубку, как только ткань-средняя слякоть может быть сдвинута. Аккуратно промойте кусочки опухолевой ткани, выбросьте основной объем из трубки в отдельный сосуд, закройте крышку и положите трубку вверх-вниз, чтобы четыре части ткани собрались в крышке.
   4. Положите чашку Петри на охлаждающий аккумулятор и поместите 100 МКЛ Matrigel в качестве одной капли в середину. Используйте анатомические типсы для переноса опухолевых частей в Matrigel. Убедитесь, что каждая часть полностью покрыта Matrigel. Инкубировать в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия.
7. Мышь анестезии (2 мышей на образец, работа параллельно)
   1. Приготовьте 3:1- запас кетамина (100 мг/мл) и ксилазина (20 мг/мл) обезболивающего раствора. Рекомендуемая доза составляет 90/6 мг/кг массы тела.
   2. Взвесить мышь и составить необходимый анестетический раствор в одноразовый инсулиновый шприц.
   3. Поместите мышь на сетку клетки, потяните хвост осторожно одной рукой, чтобы вызвать движение вперед и одновременно краба шею с щепоткой сцепление другой стороны. Поднимите мышь сетки и поверните держась за руку, так что спина животного лежит на ладони. Обездвижить одну из задних ног с мизинец и вводить наркотики intraperitoneally. Положите мышь обратно в клетку и ждать наркотической индукции.
   4. Поместите анестезированую мышь на нагревательной пластине и накройте глаза мази, чтобы избежать вреда роговицы. Оценивает глубину анестезии, аккуратно прищипая заднюю ногу мыши хирургическими щипсями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отсутствие движения указывает на глубокий наркоз. Любое движение либо требует больше времени для достижения желаемой наркотической глубины или дополнительной дозы анестезии.
8. Хирургическая процедура
   1. Сформив складку кожи, ущипнув шею мыши и впрысните микрочип подкожно с аппликатором (см. шаг 9 для деталей программирования)
   2. При необходимости бритье флангов мыши (мышей NMRI^nu/nu не требуют бритья), нанесите пувидоне-йод ватным тампоном и используйте хирургическую драпировку для создания стерильного поля.
   3. Поднимите кожу фланга хирургическими типсами, сделайте небольшой разрез около 4 мм и сформив небольшой подкожный карман тупым препаратом ножницами.
   4. Положите один кусок опухоли в каждый карман и поместите его на задней части.
   5. Затмите конец наконечника пипетки на 100 йл и аспирировать оставшийся Матригель из чашки Петри и нанесите его поровну в каждый карман кожи.
   6. Закройте раны простыми прерванными швами и нанесите спрей-повязку.
9. Сканирование микрочипа и проверка достоверности мыши и опухоли-ID.
10. Приготовьте новую клетку со свежими постельными принадлежностями и вложенным материалом, а также грызут палку. Сложите «подушку» из бумажных полотенец и положите мышь с поднятой головой под инфракрасную тепловую лампу.
11. Смешайте 0,25 мл триметоприма/сульфаметоксазола (400 мг/80 мг) со 100 мл питьевой воды и ввилите через питьевую бутылку. Учти, что одна мышь потребляет около 150 мл на кг массы тела в день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку подкожная PDX-модель не связана с послеоперационной болью, ни во время процесса заживления ран, ни во время роста опухоли послеоперационная анальгезия не требуется. Пожалуйста, обратите внимание, что руководящие принципы защиты животных вашего учреждения / органа могут отличаться.
12. Мониторинг экспериментальных животных
    1. Мониторинг мышей ежедневно для признаков бедствия. Это может быть делегировано квалифицированным смотрителям животных.
    2. Следите за послеоперационным лечением антибиотиками с вышеупомянутой дозировкой в течение 4 недель. Замените смесь антибиотиков два раза в неделю.
    3. Измерьте размер опухоли по крайней мере один раз в неделю, в идеале ежедневно, с помощью калипера (объем опухоли 0,52 х длина х ширина^{х высота 3}мм) и запись в базе данных.

8. Сбор и переработка PDX

1. Урожай и процесс опухоли PDX, когда:
   Размер опухоли достигает целевого объема 1,500 мм^3.
   Опухоль подшипник животных показывает признаки бедствия и / или болезни и лечение бесполезно.
   Опухоль становится язвенной или проникает в кожу мыши.
2. Прочитайте микрочип, чтобы определить правильный PDX.
3. Усыпляйте мышь законным методом (в зависимости от национальных руководящих принципов), как, например, CO_{2 -астиксация}или инъекция кетамина/ксилазина с последующим вывихом шейки матки.
4. Поднимите кожу хирургическими типсами на флангах и наклоняй ножницами Метценбаума в нескольких миллиметрах от опухоли.
5. Отсоедините кожу над опухолью тупым препаратом, затем аккуратно схватите опухоль анатомическими типсами и отсоедините опухоль от поверхностной фасции тела.
6. Промыть опухоль DPBS, положить его в чашку Петри и удалить соседние соединительной ткани.
7. На этом этапе выполните одно из следующих:
   1. Вырезать 30 мм³ кубов и создать новый PDX (Продолжить с протоколом в точке 7.7.4).
   2. Разрежьте опухоль на кусочки, которые затем передаются в гистологические кассеты и сохраняются в 4% формальдегиде для более поздней встраивания парафина.
   3. Сохранить опухоль в трубке с раствором хранения тканей, чтобы добавить его в биобанк (Продолжить с протоколом на этапе 3.) и / или создать PDX-производных клеточных линий (Продолжить с протоколом на этапе 4.)

9. Биобанк и управление данными

1. Назначить внутренний идентификатор для каждого случая опухоли в соответствии с таблицей 1.

Таблица 1: Определение идентификатора образца.

2. Храните согласие пациента в электронной и бумажной форме вместе с опухолевым идентификатором.
3. Соберите как можно больше клинических данных и храните их анонимно и отдельно.
4. Используйте программное обеспечение для управления данными (например, Freezerworks) или другое и создайте интерфейс с программным обеспечением для печати этикеток для создания устойчивых к температуре, самоклеящихся меток штрих-кода.
5. Добавьте новый образец, открыв программное обеспечение для управления данными, определите тип образца и заведите следующую информацию: идентификатор опухоли, тип ткани, метод замораживания, дата, ответственный сотрудник, номер прохода, идентификатор мыши и штамм мыши.
6. Присвоить образцы определенным позициям в резервуаре для хранения.
7. Отслеживание и мониторинг PDX (применяется к шагу 7-8)
   1. Используйте базу данных MS Access (или аналогичную систему) на портативном устройстве с поддержкой Bluetooth (ноутбук или планшет) для записи идентификатора опухоли, даты имплантации, даты эвтаназии, возраста мыши и деформации, а также роста опухоли с течением времени.
   2. Подключите считыватель микрочипов к устройству и зачитайте микрочип перед имплантацией.
   3. Назначьте определенный идентификатор каждой мыши; мы используем следующую схему: (см. таблицу 2 ниже)
   4. После имплантации замистив идентификатор вместе с характеристиками мыши в базе данных.
   5. Перечитайте микрочип и проверьте, соответствуют ли спецификации микрочипа, базы данных и этикетки криотруба.
   6. Создайте метку для каждой клетки мыши соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы создать физическое резервное время, придерживаться криотруб этикетки с соответствующими этикетками микрочипа в буклет и отметить дату и мыши деформации.
   7. Чтобы контролировать рост опухоли отдельных PDX, сканировать микрочип мыши с считывателем подключен к устройству базы данных для идентификации и записи размера опухоли измеряется калипером каждую неделю.
   8. Запланируйте идеальную точку времени сбора PDX, проанализировав кривую роста опухоли.

Таблица 2: Определение идентификатора PDX.

В наших руках, создание ставка первичных клеточных культур(рисунок 2A и B) составил 12,9% в большойсерии 9. Большинство попыток изолировать расширяемые опухолевые клетки от свежих хирургических ресектируемых образцов потерпели неудачу из-за отсутствия нарой или раннего загрязнения. Установка линии клетки была рассмотрена успешно после 3 проходов с устоичивым ростом под стандартными условиями культуры (DMEM, 10% FCS, стандартное сосуд культуры) и проверка эпителиальной дифференциации через FACS-анализ10. Клеточные линии, полученные из опухолей PDX (Рисунок 2C и D) показали более высокий уровень создания 23,6%, что также связано с возможностью повторяющихся попыток в отличие от первичных ресектных опухолей9. Тем не менее, некоторые смешанныекультуры (рисунок 2E) не могут быть освобождены от фибробластического роста или даже теряются из-за фибробластического разрастание (Рисунок 2F).

Рисунок 2: Культура клеток. Первичные линии раковых клеток, полученные из метастазов рака толстой кишки случае HROC313, проход 21 (A) и рак поджелудочной железы случае HROP88, проход 5 (B). PDX полученных раковых клеток линий толстой кишки PDX HROC285 T0 M2 (D) и поджелудочной железы PDX HROP10 T5 M2, проход 4 (E). Смешанная культура фибробластов и раковых клеток от рака поджелудочной железы HROP75, прохождение 8 (C) и фибробластический разрастание (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Учитывая изменения в протоколе генерации PDX, используемые штаммы мыши, а также экспериментаторы в течение нескольких лет, а также большие различия в количестве опухолевых тканей, доступных для присвещания, это не тривиально, чтобы дать общий показатель успеха pdX поколения. В недавней серии экспериментов поколения PDX, выполненных двумя исследователями (S.M. и F.B.), наблюдались первичные показатели роста 63% для колоректального PDX (образцовая гистология может быть изображена на рисунке 3A)и 48% для поджелудочной железы PDX (рисунок 3B). Нароение мурина или человеческих лимфом в месте имплантации является относительно редким, но может имитировать успешный результат PDX(рисунок 3C). Помимо гистопатологического обследования, согласие между моделями PDX и их пациентами-донорами регулярно подтверждалась коротким тандемным повторным (STR) анализом(рисунок 3D). По сей день биобанк включает в себя >50 первичных и >50 вторичных колоректальных, 3 первичных и 6 вторичных линий раковых клеток поджелудочной железы, а также >150 колоректальных и 19 моделей поджелудочной железы PDX.

Рисунок 3: Представитель гистологического сравнения колоректального (А) и поджелудочной железы PDX (B). Лимфома человека в месте имплантации имитирует нароение PDX (C). Генетическое тестирование личности модели PDX (HROC430 T1 M2) на исходную опухолевую ткань пациента (HROC430Tu) путем короткого тандемного повторного (STR) анализа. Сравнение девяти STR локусов, vWA, THO1, TPOX, CSF1 PO (краситель FAM) и D5S818, D13S317, D7S820, D16S539 (HEX краситель) с использованием мультиплекса PCR с флуоресцентными маркировкой грунтовки после капиллярного электрофореза подтвердил генетическое согласие PDX и донора (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

никакой.