Нейтронная спиновая эхо-спектроскопия как уникальный зонд для динамики липидных мембран и мембранно-белковых взаимодействий

Понимание клеточных мембран и их функций замечательно изменилось за последние несколько десятилетий. Прежний взгляд на клеточные мембраны как на пассивные липидные бислои, которые определяют границы клеток и белки домашней мембраны^1, постепенно трансформировался в динамическую модель, в которой липидные бислои играют важную роль в регулировании жизненно важных биологических процессов, включая клеточную сигнализацию, молекулярный обмен и функцию белка — и это^2,3,4,5,6. Это осознание того, что клеточные мембраны очень динамичны, постоянно подвергаются ремоделированию и молекулярному перераспределению, побудило к научным исследованиям за пределами равновесных структур мембран^7,8,9. Соответственно, было разработано несколько подходов к изучению различных динамических режимов в биологических и биоинспирируемых липидных мембранах. На сегодняшний день большинство этих исследований в основном сосредоточено на диффузных молекулярных движениях^10,11,12,13 и макроскопических флуктуациях формы^14,15,16,оставляя значительный пробел в понимании динамики промежуточных мембран, т. е. коллективных флуктуаций липидных сборок, состоящих из нескольких 10-100 молекул липидов. Эта динамика происходит на масштабах длины от нескольких десятков до нескольких 100 Å и во временных масштабах от суб-ns до нескольких сотен ns (см. Рисунок 1),называемых здесь мезоскопическими масштабами. Именно в этих масштабах происходит ключевая биологическая активность на мембранном уровне^17. Это включает вирусное почкование^18,канал¹⁹и мембранно-белковые взаимодействия^20. Важно также отметить, что энергетический ландшафт мембранных белков^{21, 22показывает,} что конформационные изменения в белках, необходимые для их регуляторной роли, происходят на временных масштабах^{ns 23} коллективных флуктуаций мембран, что дополнительно подчеркивает важность мезоскопической динамики в биологической функции клеточных мембран и их биоинспирируемых аналогов^20. В данной работе основное внимание уделяется двум основным мезоскопическим динамическим режимам в липидных мембранах, а именно флуктуациям изгиба и колебаниям толщины.

Основной проблемой при непосредственном провожде этих флуктуацийных режимов является сложность одновременного доступа к их пространственным и временным масштабам с использованием стандартных методов спектроскопии. Другая проблема заключается в том, что методы прямого контакта могут влиять на те же колебания, которые они предназначены для измерения^16. Это еще более усугубляется композиционной и структурной сложностью биологических мембран^24,25,что приводит к неоднородным особенностям мембраны, включая образование липидных доменов^{26,27, 28,29, 30}и асимметрию мембран^{31, 32, 33,}требуя селективных зондов для понимания динамики различных особенностей мембраны. К счастью, эти проблемы могут быть преодолены с помощью неинвазивных методов нейтронной спектроскопии, таких как нейтронное спиновое эхо (NSE), которые по своей сути получают доступ к требуемой длине и временным масштабам, а также позволяют дополнительно проводить исследования селективных особенностей мембран без изменения их физико-химической среды^34. Действительно, за последние несколько лет спектроскопия NSE превратилась в уникальный и мощный зонд коллективной мембранной динамики^35. Результаты исследований NSE на липидных мембранах дали новое представление о механических^{свойствах 36,37} и вязкоупругих^38,39 липидных мембран и пролили новый свет на их потенциальную роль в биологической функции^40,41.

Метод спектроскопии NSE основан на конструкции интерферометрического прибора, впервые предложенной Mezei^42,с использованием серии спин-ласт и магнитных катушек для управления прецессией спина нейтрона, когда нейтроны пересекают инструмент. Конструкция опирается на магнитное зеркальное отражение элементов магнитного поля относительно положения образца(рисунок 1А). Это означает, что при отсутствии обмена энергией между нейтроном и образцом нейтрон выполняет одинаковое количество спиновых прецессий в противоположных направлениях в первой и второй половине инструмента (обратите внимание на π-флиппер между двумя катушками прецессии). В результате конечное спиновое состояние нейтрона остается неизменным относительно начального состояния - явление, называемое спин-эхо (см. прозрачный нейтрон на рисунке 1А). Однако, когда нейтрон энергетически взаимодействует с образцом, энергообмен изменяет число спиновых прецессий во второй половине инструмента, что приводит к другому конечному спиновому состоянию (см. Рисунок 1А). Это экспериментально обнаруживается как потеря поляризации, как будет показано далее в этой статье. Для получения более подробной информации о технике NSE читатель обращается к специальным техническим документам^42,43,44,45.

Здесь представлено упрощенное описание, чтобы дать приблизительную оценку длины и временных масштабов, доступных с NSE. Масштабы длин определяются диапазоном достижимых волновекторных передач, Q = 4π sin θ/λ, где 2θ — угол рассеяния, а λ — длина волны нейтрона. Видно, что Q задается диапазоном длин волн и степенью вращения второго плеча спектрометра (см. рисунок 1А). Типичный Q-диапазонна спектрометрах NSE составляет ~0,02-2 Å^-146,47и до 0,01-4 Å^-1 с недавними обновлениями^48,49,что соответствует пространственным масштабам ~1-600 Å. С другой стороны, доступная шкала времени вычисляется из общего угла прецессии (или фазы), приобретенного нейтроном в магнитных катушках прецессии, и обнаруживается, что она составляет⁵⁰: . В этом выражении t — время Фурье, определяемое как , где — нейтронное гиромагнитное отношение, — длина катушки и — сила магнитного поля катушки. Стоит отметить, что время Фурье — это величина, которая строго зависит от геометрии прибора, силы магнитного поля и длины волны нейтрона. Например, используя нейтроны длины волны = 8 Å и настройки прибора   = 1,2 м и = 0,4 Тл, время Фурье вычисляется как t ~ 50 нс. Экспериментально время Фурье настраивается путем изменения тока в катушках прецессии (т. Е. Напряженность магнитного поля) или с использованием различных длин волн нейтронов, что приводит к типичным шкалам времени NSE от ~ 1 пс до 100 нс. Тем не менее, недавние обновления спектрометров NSE позволили получить доступ к более длинным временам Фурье, до ~ 400 нс на спектрометре J-NSE-Phoenix в Центре Хайнца Майера-Лейбница⁵¹ и спектрометре SNS-NSE в Национальной лаборатории Оук-Ридж⁴⁸и до ~ 1000 нс на спектрометре IN15 NSE в Институте Лауэ-Ланжевена (ILL)^49. 

Помимо прямого доступа к длине и временной шкале мембранной динамики, NSE обладает присущими 52 возможностями чувствительности к изотопам нейтронов^52. В частности, способность нейтронов по-разному взаимодействовать с изотопами водорода, наиболее распространенного элемента в биологических системах, приводит к различной плотности рассеяния нейтронов,³⁴ или NSLD (эквивалент оптического показателя преломления^50),когда протий замещается дейтерием. Это позволяет использовать подход, известный как вариация контраста, который обычно используется для выделения конкретных особенностей мембраны или сокрытия других — последний сценарий называется контрастным соответствием. Частым применением изменения/согласования контраста является замена воды (NSLD = -0,56 × 10^-6 Å^-2)тяжелой водой или D₂O (NSLD = 6,4 × 10^-6 Å^-2)для усиления нейтронного сигнала от протиированных липидных мембран (NSLD ~ 0 × 10^-6 Å^-2). Этот подход очень эффективен в исследованиях структуры мембраны, поскольку проникновение_D2O в область головной группы мембраны позволяет точно определить толщину мембраны (см. Рисунок 2A,левая панель) и расположение различных липидных подгрупп при применении более сложных моделей^53,54. В данной работе приводятся некоторые примеры использования вариации контраста для изучения коллективной динамики в биомиметических мембранах и отдельных особенностей мембран.

Здесь эффективность NSE в предоставлении уникального понимания динамических и функциональных свойств мембран иллюстрируется наглядными примерами исследований NSE на модельных и биологически значимых липидных мембранных системах с акцентом на мезомасштабную динамику в отдельно стоящих мембранах в виде липосомальных суспензий. Для NSE измерений динамики плоских мембран читатель обращается к специализированным публикациям по нейтронно-эхо-спектроскопии (GINSES)^{55, 56} и другим исследованиям выровненных многоламелярных мембранных стеков^57,58,59,60.

Для простоты в данной работе выделены три различные схемы мембранной дейтрации, проиллюстрированные на хорошо изученной доменно-формирующей, или фазоразделяющей, липидной бислойной системе из смесей 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DMPC) и 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC)^61,62. Эти два липида характеризуются несоответствием длины углеводородной цепи (14 атомов углерода на хвост в DMPC против 18 атомов углерода на хвост в DSPC) и температуры перехода гель-жидкость (T_{m, DMPC} = 23 °C против T_{m, DSPC} = 55 °C). Это приводит к боковому фазовой разделению в мембранах DMPC:DSPC при температурах между верхними и нижними температурами перехода смеси^63. Рассмотренные здесь схемы дейтерации выбраны для демонстрации различных динамических режимов, доступных в измерениях NSE на липосомальных мембранах, а именно флуктуаций изгиба, колебаний толщины и селективных флуктуаций изгиба/толщины боковых доменов. Все липидные композиции представлены для двухслоев DMPC:DSPC, приготовленных при моль фракции 70:30, с использованием коммерчески доступных протиированных и пердевтерированных вариантов DMPC и DSPC. Все этапы подготовки образца основаны на 4 мл липосомальной суспензии в_D2Oс концентрацией липидов 50 мг/мл для общей липидной массы M_tot = 200 мг на образец.

1. Схема деитерации, необходимая для эксперимента

1. Для измерения флуктуаций изгиба делают полностью протиатированные липосомы в_D2O(D 99,9%) или_D2O-буфере (например, фосфатный буфер, приготовленный с_D2O вместо_H2O). Используйте полностью протиированный DMPC (C₃₆H₇₂NO₈P) и DSPC (C₄₄H₈₈NO₈P) с 133,4 мг, где X_DMPC и X_DSPC являются молярными фракциями DMPC и DSPC, здесь установлены на 0,7 и 0,3 соответственно, а Mw_DMPC и Mw_DSPC - молярные веса, заданные 677,9 г / моль и 790,1 г / моль соответственно. Аналогично, m_DSPC = 66,6 мг. Эта схема дейтерации увеличивает контраст рассеяния между мембраной (NSLD ~ 0 × 10^-6 Å^-2)и дейтерированным буфером (NSLD ~ 6,4 × 10^-6 Å^-2)и усиливает сигнал от мембранных волн (см. Рисунок 2A левая панель).
2. Для измерения динамики изгиба отдельных боковых характеристик мембраны, например, динамики матрицы в фазоразделяющих мембранах DMPC:DSPC, используют протиатированный DMPC (C₃₆H₇₂NO₈P) и дейтерированный, DSPC-d83 (C₄₄H₅NO₈PD_83,Mw 873,7 г/моль), так что m_DMPC = 128,8 мг и m_DSPC-d83 = 71,2 мг. Эта схема дейтерации сводит к минимуму рассеяние от нежелательных доменов, богатых DSPC, что позволяет выборочно измерять флуктуации изгиба из матрицы, богатой DMPC (см. рисунок 2B в середине).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы найти оптимальную дейтрацию липидов, необходимую для конкретной схемы сопоставления контрастов, используйте доступные веб-калькуляторы плотности длины рассеяния (SLD), такие как тот, который разработан Центром нейтронных исследований NIST^64. Эти веб-интерфейсы оснащены удобными инструментами для легкого расчета SLD липидов с различной степенью дейтерации, а также липидных смесей.
3. Для NSE измерений средней толщины мембраны (без бокового контраста) используют хвосто-дейтерированные варианты составляющих липидов, т.е. DMPC-d54 (C₃₆H₁₈NO₈PD_54,732,3 г/моль) и DSPC-d70 (C₄₄H₁₈NO₈PD_70,860,1 г/моль)^35,38,такие, что m_DMPC-d54 = 133,0 мг и м_DSPC-d70 = 67,0 мг. Эта контрастная схема(рисунок 2A,правая панель) усиливает сигнал рассеяния от липидных головных групп (NSLD ~ 4,5 ×^{10 -6} Å^-2)путем контрастного сопоставления хвостовой группы (NSLD ~ 6,4 × 10^-6 Å^-2)к дейтерированному буферу, позволяя обнаруживать колебания толщины мембраны.
4. Для исследования флуктуаций толщины отдельных мембранных компартментов, например, матрицы, богатой DMPC, используйте ту же стратегию, описанную на этапе 1.2, путем замены протиированных липидов DMPC их хвостовыми дейтерированными аналогами, т.е. DMPC-d54, таким образом, что домены, богатые DSPC, контрастно соответствуют дейтерированному буферу, а первичный сигнал рассеяния происходит из области головной группы матрицы, богатой DMPC хвоста.

2. Подготовка липидной суспензии для экструзии

1. Рассчитайте массу каждого компонента в образце в зависимости от состава образца. Как правило, для образцов с несколькими молекулярными компонентами масса компонента задается его молярной массой Mw_i,взвешенной по его молярной фракции X_i,и нормируется по всем компонентам таким образом, что: где M_tot - общая масса, установленная здесь на 200 мг. См. пример выше для липидных бислоев DMPC-DSPC с различными схемами дейтерации.
2. Используя цифровой полумикровес, взвесьте рассчитанные массы липидов (и других компонентов образца, например, белков, наночастиц и т. Д.) И добавьте их во флакон или колбу с круглым дном - не забудьте предварительно взвесить флакон или колбу. Добавьте 1 мл растворителя для растворения взвешенных компонентов, вручную перемешав внутри вытяжки. Для чистых липидных образцов используйте хлороформ или этанол. Для образцов с дополнительными, нелипидными компонентами (например, наночастицами) выбирайте общий растворитель, который диспергирует все компоненты.
   1. Для небольших количеств липидов (<10 мг) приготовьте бульон и пипетку необходимого объема в смесь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте чрезмерное количество растворителя, так как это значительно замедлит этап сушки растворителя, описанный ниже.
3. Высушите раствор липидов внутри капюшона, осторожно вливая в флакон инертный газ (например, азот, аргон), медленно вращая флакон под углом. Держите флаконы в наклонном положении, чтобы создать тонкую пленку высушенного липида на стенках флакона, которая позволит равномерно высохнуть. Периодически помещайте флакон на водяную баню при 35 °C, чтобы обойти охлаждение, опосредованное испарением, которое замедлит испарение растворителя.
4. Поместите флаконы на ночь в вакуумную печь при температуре ~35 °C, чтобы полностью удалить остаточный растворитель. Для ненасыщенных липидов продувки вакуума инертным газом, чтобы свести к минимуму окисление.
5. Чтобы обеспечить полное удаление растворителя, взвесьте флакон после высыхания липидов и убедитесь, что нет избыточной массы сверх измеренного количества материалов. Делают это путем вычитания массы флакона из измеренной массы после высыхания. При наличии избыточной массы высушите образец под вакуумом еще 6 ч. При необходимости повторите этот процесс.
6. Увлажняют липидную пленку 4 мл_D2O или_D2O-буфера для получения концентрации липидов 50 мг/мл. Для липидов с высокими температурами перехода, таких как смеси DMPC-DSPC, нагревайте буфер до температуры выше температуры перехода (60 °C), чтобы обеспечить равномерное перемешивание.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку эксперименты NSE требуют относительно больших объемов образцов (~4 мл), рассмотрите возможность гидратации образца с использованием половины требуемого буфера, т.е. 2 мл, чтобы свести к минимуму количество экструзий на образец (см. раздел 3). В этом случае добавьте оставшуюся половину буфера после экструзии. Обратите внимание, что емкость шприцев, используемых при экструзии, ограничена 1 мл. Таким образом, гидратация 4 мл буфера потребует четырех наборов экструзии.
7. Вихрево смешайте гидратированный липидный раствор до тех пор, пока липидная пленка полностью не растворится и больше не будет видна на стенках флакона. На этом этапе гидратированные липиды образуют многоламелярные везикулы и многоцветные стеки микрон, а суспензия выглядит молочно-белой.
8. Чтобы облегчить разрушение липидных стеков и уменьшить мультиламеллартность, выполните пять циклов замораживания/оттаивания, поместив флакон с гидратированным липидным раствором в морозильную камеру лабораторного класса (предпочтительно морозильную камеру с -80 °C) до полного замораживания, а затем переместив флакон на водяную баню с 35 °C до полного размораживания липидного раствора. Вихрь размороженный раствор до однородной однородной жижи. Повторите еще четыре раза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, ванну с сухим льдом можно подготовить для быстрого замораживания, сочетая ацетон и сухой лед.

3. Экструзия гидратированного липидного раствора

1. Соберите установку экструдера, используя поликарбонатную мембрану между двумя мембранными опорами и добавив два бумажных фильтра с каждой стороны для обеспечения дополнительной поддержки. Используйте поликарбонатную мембрану с размером пор, который соответствует целевому размеру липосомы (общие размеры пор для экспериментов NSE составляют 50 нм и 100 нм - как правило, липосомы диаметром 100 нм допускают менее ограниченные флуктуации мембраны, но меньшие 50 нм липосомы могут быть использованы для исследований кривизны). Убедитесь, что поликарбонатная мембрана полностью растянута перед завершением сборки и затягивания внешнего корпуса экструдера.
2. Гидратировать поликарбонатную мембрану, пропуская ~0,3 мл D₂O или D₂O-буфера несколько раз через мембранный узел с помощью герметичных стеклянных шприцев. Используйте тот же буфер, который используется при подготовке образцов. Оставьте его не менее чем на 10 минут, затем полностью высохите буфер перед введением образца.
3. Залить подготовленным липидным раствором газонепроницаемый шприц 1 мл и вставить в один конец экструдера. Затем вставьте пустой шприц в противоположный конец. Как только шприцы будут подключены к экструдеру в сборе, поместите его в блок экструдера.
4. Если для экструзии необходимы повышенные температуры, как в случае насыщенных липидов с высокими температурами перехода (например, DSPC, T_m = 55 °C), предварительно нагрейте нагревательный блок экструдера выше температуры липидного перехода (например, 60 °C), поместив нагревательный блок на конфорку или используя циркуляционную ванну, как показано на рисунке 3A.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап имеет решающее значение для обеспечения однородного смешивания липидов и предотвращения экстремального давления во время экструзии, которое может разорвать поликарбонатную мембрану. Для липидных образцов с низкими температурами перехода (<25 °C) выполняют экструзию при комнатной температуре.
5. Чтобы экструзить липидный раствор, прикрепите экструдер к программируемой шприцевой помпе с алюминиевой/стальной рамой, как показано на рисунке 3А. Для экструзий с контролируемой температурой добавьте специально изготовленное основание экструдера с жидкостным каналом и прикрепите к циркуляции водяной бани.
6. Запрограммировать шприцевой насос на выполнение 15-20 циклов экструзии в соответствии с инструкцией производителя. При экструдировании цвет раствора липидов изменяется от молочно-белого до прозрачного опалового синего(рисунок 3B,C),что указывает на конечный размер липосомы, который меньше длины волны видимого света, как и ожидалось. Для типа шприцевого насоса, показанного на рисунке 3A,выполните следующие действия.
   1. Начните с настройки насоса. Удерживая нажатой кнопку Rate, введите скорость экструзии (50,99 мл/ч), затем нажмите кнопку Diameter (Diameter) и введите диаметр шприца (4,606 мм). Используйте стрелки вверх под каждой цифрой на экране, чтобы изменить значение этой цифры.
   2. Поместите комплект экструдера с образцом шприца справа (см. рисунок 3A). Нажимайте кнопку «Снять», пока не загорится индикатор вывода. Нажмите кнопку Пуск и подождите, пока образец попадет в левый (пустой) шприц.
   3. Нажмите кнопку Стоп непосредственно перед тем, как образец (справа) шприц полностью пуст. Запишите дозированный объем и используйте его для программирования цикла экструзии. Удерживайте кнопку «Скорость», пока на экране не появится фаза 1 (PH:01). Нажмите кнопку громкости, чтобы ввести дозированный объем, записанный ранее. На этом этапе убедитесь, что индикатор Withdraw выключен — это распределяет образец в правильном направлении.
   4. Нажмите кнопку Rate еще раз и используйте правую стрелку вверх для доступа к фазе 2 (PH:02). Нажмите Volume ( Громкость), чтобы ввести то же значение дозированного объема, которое было записано ранее. На этом этапе нажимайте кнопку «Вывести», пока не загорится индикатор «Вывести» — это выведет образец влево.
   5. Чтобы повторить этот цикл, снова нажмите кнопку Rate и используйте стрелку вверх вправо для доступа к фазе 3 (PH: 03). Нажимайте кнопку громкости, пока на экране не появится LP:SE, и установите для нее значение 20. Это количество циклов или повторов, которые будет выполнять насос. Наконец, нажмите кнопку Rate, перейдите к фазе 4 (PH: 04) и нажмите кнопку громкости, чтобы нажать функцию Stop. Насос теперь настроен на автоматическую экструзию.
   6. Нажмите кнопку Пуск, чтобы начать цикл экструзии.
7. Опорожнить шприц, содержащий экструдированную липидную суспензию, в чистом флаконе и подготовить к хранению или измерениям. Для липидных образцов с высокой температурой плавления храните образец выше фазового перехода жидкости до тех пор, пока не будет измерено. В противном случае храните образцы при комнатной температуре.
8. Не замораживайте экструдированные образцы, так как замораживание приведет к разрыву везикул (суспензия снова станет молочно-белой).

4. Измерения NSE для образца (образцов) и сокращение собранных данных

1. Перед экспериментом NSE охарактеризуйте экструдированный липосомальный образец с этапа 3.7, используя доступные методы для обеспечения адекватного качества образца. Список потенциальных методов харкатеризации, которые могут быть использованы для оценки качества липосомальных суспензий для экспериментов NSE, например, распределение по размерам, многоламелларность, структура боковой мембраны, включен в дискуссионный раздел.
2. Определите Q-диапазон и соответствующие настройки прибора, необходимые для эксперимента. Для измерения жесткости изгиба липидных бислоев используйте Q-диапазон ~(0,04 - 0,2) Å^-1. Для исследования колебаний толщины мембраны используют Q-диапазон ~(0,04 - 0,2) Å^-1, соответствующий толщине мембраны^35,66,67.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обсудите экспериментальную установку с ученым-прибористом до начала эксперимента. Как упоминалось ранее, характеристика образца SANS необходима, особенно если предварительная информация о сигнале рассеяния недоступна, как в селективно дейтерированных мембранах. В качестве альтернативы можно провести статические (также известные как дифракционные) измерения в ограниченном Q-диапазоне на приборе NSE с оговоркой, что такие измерения занимают гораздо больше времени по сравнению с SANS.
3. Используя шприц или передаточную пипетку, загрузите экструдированную липосомальную суспензию (суспензии) в назначенные ячейки образца, доступные на линиях пучка NSE. Обратите внимание, что стандартные образцы NSE бывают толщиной 1, 2, 3 и 4 мм. Выберите толщину ячейки таким образом, чтобы оптимизировать сигнал рассеяния, сохраняя при этом некогерентный фоновый сигнал с разумной интенсивностью.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, используйте образцы клеток с протяженностью 1 или 2 мм для протиированных липосом в дейтерированном буфере - более толстые клетки могут привести к множественным эффектам рассеяния, которые трудно исправить. Для липосом с более высоким уровнем дейтрации (например, липосомы, соответствующие контрасту хвоста или асимметричные липосомы с одиночными протитированными листочками) рассмотрите возможность использования более толстой клетки образца (например, 3 или 4 мм), чтобы улучшить статистику подсчета, если образец доступен в больших количествах - иногда это может быть непомерно дорого.
4. Подготовьте идентичную ячейку образца для буфера. Используйте тот же буфер, что и в липосомальной суспензии. Измерения на буфере необходимы для нормализации интенсивности и коррекции фона (BKG).
5. Поместите ячейку (ячейки) образца в держатель образца спектрометра NSE, запрограммируем измерительные прогоны и соберите эхо-данные. Проконсультируйтесь с ученым-приборостроителем о программировании измерений, если вы впервые пользователь NSE.
6. Выполните два дополнительных набора измерений, необходимых для уменьшения данных: измерения разрешения(R)и передачи(T).
   1. Выполнить измерение разрешения(R)на упругом эталоне рассеяния (например, углероде) — для запуска в тех же настройках; т.е. тот же волновой вектор и раз Фурье, что и измерения образца и буфера.
   2. Выполните измерения пропускания(T)на образце и буфере для расчета интенсивности передаваемого нейтронного пучка (см. шаг 4.9 ниже). Передача рассчитывается как отношение количества нейтронов от образца или буфера, деленное на количество нейтронов для открытого пучка (т.е. с пустым положением образца).
7. Используйте специальное программное обеспечение для уменьшения данных для спектрометра NSE, на котором выполняются измерения, чтобы уменьшить собранные данные.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Различные спектрометры могут использовать различное программное обеспечение или пользовательские интерфейсы. Ниже приведен пример сокращения данных NSE с помощью среды анализа и визуализации данных (DAVE)⁶⁸ программное обеспечение, специально написанное для спектрометра NSE в Центре нейтронных исследований NIST.
   1. Откройте программное обеспечение DAVE и выберите «Уменьшить данные NSE» в меню сокращения данных. Появится несколько всплывающих окон.
   2. Загрузите файлы данных с различными значениями Q с помощью команды Открыть ECHO-файлы в меню файл. Эти файлы соответствуют файлам необработанных данных с сигналами спин-эха и имеют расширение .echo в имени файла. После завершения загрузки файла файлы будут отображаться под доступными наборами данных.
   3. Щелкните правой кнопкой мыши на выбранном файле и пометьте его в соответствии с измерением, которое он соответствует; т.е. Образец, Ячейка (для пустой ячейки или буфера) или Разрешение.
   4. Сгруппируйте пиксели детектора в 2 x 2, чтобы улучшить отношение сигнал/шум с помощью вкладки Набор данных. Применение одного и того же биннинга ко всем файлам; т.е. Разрешение, Ячейка и Образец.
   5. Проверьте данные по всем группам пикселей и замаскируйте данные с плохими сигналами (см. рисунок 4B),нажав клавишу m на клавиатуре. Нажмите клавишу ВВОД, чтобы открыть всплывающее окно, чтобы применить одну и ту же маску ко всем разам Фурье или последующим разам Фурье. Это также может быть применено к отдельным пикселям в любой момент во время сокращения данных. Замаскированные пиксели станут зелеными.
   6. Убедитесь, что собранные данные в виде эхо-сигнала, т.е. косинусной функции с точки зрения фазового тока, над каждым пикселем детектора (см. Рисунок 4А).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фазовый ток пропорционален углу прецессии спина нейтрона; следовательно, обычно представляется фазовый ток в виде фазового угла, как показано на рисунке 4A. Для измерений на импульсных источниках к данным применяются дополнительные расчеты времени полета для получения эхо-сигналов в зависимости от длины волны падающего нейтрона в нейтронном импульсе.
   7. Начните с установки файла разрешения. Выберите файл разрешения из списка загруженных файлов и щелкните его правой кнопкой мыши. Выберите «Операции подгонки: эхо-отсыпать (разрешение)» во всплывающем меню.
   8. Убедитесь, что припадки эхо-сигналов дают ряд параметров подгонки, включая параметр A,требуемый на шаге 4.8. Подгомка выполняется автоматически с помощью следующего выражения.
      
      Здесь ζ — период эхо-сигнала (т. е. косинусная функция на рисунке 4A),σ — ширина гауссовской оболочки, определяемая средней длиной волны и разбросом длин волны падающего пучка нейтронов, Φ_c — фазовый ток, а Φ₀ — точка эха, которая зависит от траектории поля, испытываемой нейтронами^50. Физическая информация о образце кодируется в амплитуде, А,косинусной функции в уравнении (1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ширина гауссовской оболочки основана на значениях, заранее заданных ученым-приборостроителем, и не должна изменяться. Другие параметры представляют собой переменные, которые подогнаны к конкретному эхо-сигналу над каждым пикселем.
   9. Проверьте результаты подгонки, щелкнув по каждому пикселю, чтобы показать результирующие параметры подгонки, качество посадки и среднее квадратное отклонение подгонки. Чтобы проверить ошибку, связанную с каждым параметром подгонки, по всему детектору, выберите Параметры изображения, а затем выберите интересующую параметр подгонки. Это сгенерирует карту со значением подходящего параметра над каждым пикселем. Щелкните правой кнопкой мыши на изображении детектора. Появится всплывающее окно с картой строки ошибок выбранного параметра подгонки.
   10. Если подгонка над определенным пикселем неудовлетворительна (например, подгонка паравечеров с большими полосами ошибок), перенастраить сигнал над этим конкретным пикселем. Выделите этот пиксель,перейдите на вкладку Подгонка, а затем нажмите кнопку По пикселю по выбору. Введите новые начальные параметры для фазы(Φ₀₎и периода (ζ) на вкладке Fitting для получения более удовлетворительного соответствия.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно построить установленную фазу как функцию времени Фурье. Для этого перейдите в главное окно сюжета и выберите Fit Phase v. Fourier Time. Этот сюжет должен быть плавным и непрерывным. Проверьте разрывы на этом графике и переоборудуйте пиксели, которым они соответствуют.
8. Уменьшите размер файла образца или ячейки, выбрав соответствующий файл из списка загруженных и помеченных файлов.
   1. Проверьте все пиксели и замаскируйте те, которые с плохой статистикой, как описано в шаге 4.7.5.
   2. Щелкните правой кнопкой мыши файл и выберите Операции подгонки: этапы импорта (образец, ячейка). При этом фазы и примененная маска импортируются из файла Resolution.
   3. Подгонка эхо-сигналов с помощью той же процедуры, описанной ранее для файла Resolution (шаги 4.7.8-4.7.10). При установке файлов Sample и Cell не изменяйте значения точки и фазы эха, импортированных из resolution fits. Эти параметры зависят от инструментальных настроек и не должны изменяться в зависимости от сэмплов.
   4. Прежде чем приступить к уменьшению данных, введите центр луча для всех файлов данных. Выберите файл данных, перейдите на вкладку Общие и введите центральные значения луча X и Y. Эти значения записываются во время эксперимента.
   5. После завершения подгонки файлов Sample, Cell и Resolution рассчитайте нормализованную промежуточную функцию рассеяния, которая будет использоваться позже при анализе и интерпретации данных. Для этого щелкните правой кнопкой мыши файл Sample, который нужно уменьшить из списка подходящих файлов, и выберите Calculate I(Q) во всплывающем меню. Появится окно с вариантами ввода для файлов Resolution и Cell (т.е. буфера), а также количеством Q-дуг (см. шаг 4.9). После ввода всей необходимой информации нажмите кнопку OK. Результаты появятся в новом окне.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Редукция данных выполняется по следующему уравнению для получения нормализованной промежуточной функции рассеяния^69.
      
      где t — время Фурье, N_вверх и N_вниз — количество нейтронов в конфигурациях без спин-флипа и спин-флипа (измеренное с выключенными π/2-ластами и π-флиппером, соответственно), а надстрочные индексы, BKG и R,соответствуют измерениям фона и разрешения, соответственно, как определено в шагах 4.4 и 4.6. Отметим, что поляризация пучка, при этом изменение спинового состояния из-за обмена энергией между нейтроном и образцом обнаруживается как падение поляризации (от единицы).
9. Наконец, сгруппируйте пиксели детектора в Q-дуги,как показано на рисунке 4B, чтобы получить Q-зависимостьнормализованной промежуточной функции рассеяния, S(Q,t) / S(Q, 0 ). Технически это называется биннингом данных и должно быть сделано разумно, т.е. с учетом статистики подсчета из выборки и ожидаемого стандартного отклонения данных над сгруппированными пикселями.
10. Для образцов с сильным рассеянием разделите детектор на большее количество Q-дуг, сохраняя при этом разумные полосы ошибок на результиимной промежуточной функции рассеяния, S(Q,t) / S(Q, 0 ). Это дает больше точек данных Q и важно для процедуры анализа данных, описанной ниже. Имейте в виду, что для слабо рассеянных образцов чрезмерное бинирование приводит к плохим сигналам распада, то есть большим полосам ошибок на S(Q,t) / S(Q, 0), что может привести к большим неопределенностям.

5. Анализ и интерпретация данных

1. Подойдут нормализованные промежуточные функции рассеяния S(Q,t) / S(Q,0), полученные из приведенного выше сведения данных до растянутой экспоненциальной функции с растягивающей экспонентой 2/3⁷⁰.
   
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пример этих подходов приведен на рисунке 5B. Припадки S(Q,t) / S(Q,0) к уравнению (3) дают Q-зависимые скорости релаксации Γ (Q).
2. График Γ(Q)как функция Q и подходит к подходящей модели для извлечения соответствующих параметров мембраны.

Исследования NSE, обращающиеся к флуктуациям изгиба, обычно выполняются в Q-диапазоне ~ (0,04 - 0,2) Å-1. Этот Q-диапазон соответствует шкалам промежуточной длины между толщиной мембраны и липосомальным радиусом, где доминирует динамика изгиба. Измерение в расширенном Q-диапазоне может дать доступ к дополнительным динамическим режимам, включая липосомальную диффузию и внутримембранную динамику. Для получения более подробной информации о кроссовере в мембранной динамике, доступ к NSE, ознакомьтесь с этими соответствующими публикациями25,71. Важно подчеркнуть, что сигналы NSE пропорциональны: , где Icoh и Iinc — это, соответственно, когерентная и некогерентная интенсивность рассеяния от образца. Поэтому целесообразно готовить липосомальные образцы NSE в дейтерированных буферах (т.е. буферах, приготовленных сD2O вместоH2O), чтобы свести к минимуму некогерентный сигнал рассеяния, в основном за счет содержания водорода в образце. Однако в некоторых случаях для получения оптимальных контрастныхусловий могут потребоваться промежуточные схемы дейтерации (т.е. использование смесей D2 O иH2O). Как правило, NSE-измерения флуктуаций изгиба мембран выполняются на полностью протиированных липосомах в дейтерированном буфере, называемых полностью контрастными липосомами на рисунке 5. Эта схема дейтерации приводит к большой разнице NSLD между ядром мембраны (~0 ×10 -6 Å-2)и его дейтерированной жидкой средой (~6,4 ×10 -6 Å-2),что значительно усиливает сигнал рассеяния от липосомальных мембран и улучшает статистику измерения динамики изгиба. Эта контрастная схема(рисунок 2А, левая панель) часто используется в исследованиях жесткости изгиба липидных мембран с одиночными38,72 инесколькими 39,66 липидными компонентами, а также в исследованиях размягчения/жесткости мембран биологическими включениями (например, холестерином, молекулами лекарственных средств, пептидами/белками)36,37,73, 74,75и синтетическими добавками (например,наночастицами)76,77.

Измерения флуктуаций изгиба приводят к скорости релаксации, которые следуют зависимости Q3, как предсказывали Зильман и Гранек для термически волнообразных упругих тонких листов70. Уточненная форма этой Q-зависимости получена из теоретических поправок Уотсона и Брауна78,которые учитывают эффекты трения интермонолайера, предложенные Зайфертом и Лангером79. Дополнительно определяя нейтральную плоскость, находившуюся на границе раздела между гидрофильными головными группами и гидрофобными хвостами мембраны, скорости релаксации изгиба могут быть затем установлены к следующему выражению38.

где ηбафф — буферная вязкость, kBT — тепловая энергия, κ — жесткость изгиба измеряемой мембраны (или контрастной части мембраны в селективно дейтерированных системах). Этот тип измерения позволяет напрямую рассчитать упругие свойства мембраны в виде модуля жесткости изгиба. Обратите внимание, что κ извлекается из наклона линейного соответствия Γ против Q3,как показано на рисунке 5C.

С другой стороны, измерения NSE флуктуаций толщины мембраны показывают отклонения от Q3-зависимости в Γ(Q)вокруг значений Q, которые соответствуют толщине мембраны (см. Рисунок 2 в ref.66). Чтобы изолировать сигнал флуктуации толщины, можно разделить Γ(Q)на Q3,как показано на рисунке 5D. Полученные данные показывают, что избыточная динамика из-за флуктуаций толщины следует функции Лоренца в Q,что недавно подтверждено в моделировании крупнозернистой молекулярной динамики (MD)67. Чтобы соответствовать наблюдаемой избыточной динамике, Nagao et al.38 разработали экспрессию, основанную на теоретической структуре флуктуаций мембран Bingham et al.80 следующим образом.

В этом выражении Q0 - пиковое значение Q,соответствующее толщине мембраны (которое может быть независимо получено из измерений SANS), μ - вязкость плоской мембраны, AL - площадь на липид (измеренная с помощью SANS/SAXS), а KA - модуль сжимаемости области. Предполагая, что KA может быть рассчитан из κ с использованием модели полимерной щетки, это выражение сводится к одному параметру соответствия, а именно к вязкости мембраны μ,представляя новый подход к измерению вязкости мембраны без необходимости флуоресцентной маркировки или привязки/отслеживания частиц13. Предпосылка состоит в том, что согласно деформационные модели упругих тонких листов81, κ и KA взаимозависимы так, что: , где tm — механическая (или деформируемая) толщина мембраны, а β — константа, описывающая межлистную связь. Предполагается, что   β = 12 для полностью связанных листовок, β = 48 для полностью несвязанных листовок и β = 24 для листовок с промежуточным сцеплённым. Последняя называется полимерной щеткой модели81 и, как было показано, применяется в однокомпонентных и бинарных жидких липидных мембранах39. Однако к этому нужно подходить с осторожностью. Например, недавние симуляции Докторовой идр. На 82 показано, что для того, чтобы модель полимерной щетки держалась в ненасыщенных липидных мембранах, содержащих холестерин, необходимо использовать модифицированную экспрессию механической толщины мембраны. В идеале, если возможно независимое измерение KA, например, с использованием аспирации микропипетки83,то объединение результатов KA с измерениями жесткости изгиба NSE предоставит уникальную возможность исследовать межлистную связь в модели и биологических мембранах - давний вопрос в биофизике мембран и структурной биологии. Как только значения KA подтверждены, они могут быть использованы в уравнении 5 для получения вязкости мезоскопической мембраны.

Рисунок 1:Конструкция прибора NSE и синергетическое перекрытие со шкалами длины/времени мезоскопической мембранной динамики. (A) Схема различных магнитных элементов прибора NSE, используемых для манипулирования спином нейтронов, проходящих через прибор слева направо. Выделенный нейтрон указывает на изменение ориентации спина (или потерю поляризации) из-за обмена энергией между нейтроном и образцом, тогда как прозрачный нейтрон представляет собой спин-эхо, то есть отсутствие изменения спина нейтрона из-за нулевого обмена энергией. Серая стрелка указывает на возможность вращения второго рычага спектрометра для доступа к большим углам рассеяния. (B)Изобразительное представление иерархической динамики в липидных мембранах, показывающее различные динамические моды, которые охватывают несколько длин и временных масштабов. Затененная область представляет собой длину и временные шкалы, доступные NSE, которые перекрываются с мезомасштабами коллективных флуктуаций мембраны, а именно флуктуациями изгиба и толщины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2:Примеры возможных схем дейтерации в экспериментах NSE на липидных мембранах. (A) Слева: Полностью контрастные мембраны, например, протитированные мембраны в дейтерированном буфере, показывающие профиль NSLD вдоль нормали до поверхности мембраны. Разница в NSLD между хвостовой областью (~0 × 10-2 Å-2)и областью головной группы (~4,5 × 10-6 Å-2)мембраны обусловлена гидратацией головной группы дейтерированным буфером. Справа: хвостоконтрастные мембраны, такие, что углеводородная хвостовая область мембраны имеет тот же NSLD, что и буфер, как показано в соответствующем профиле NSLD вдоль мембранного нормального. (B) Доменообразующие мембраны с двумя схемами нейтронного контраста, где домены (в центре) или матрица (слева) контрастно согласованы с буфером, что позволяет проводить селективные исследования динамики матрицы или домена соответственно. Этот показатель был изменен из Nickels et al., JACS 201541. (C)Асимметричные мембраны, полученные циклодекстрином, обмениваются между протиированными и дейтерированными липидными везикулами, что приводит к дейтерации одного мембранного листочка при сохранении другого листочка протиированным. Это позволяет иследовать динамику изгиба протиированного листка и дает представление о механической связи между противоположными листочками в асимметричных мембранах. Эта цифра была изменена из Rickeard et al., Nanoscale 202040. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3:Иллюстрация установки для автоматической экструзии липосом. (A) Изготовленный на заказ автоматизированный экструдер с использованием шприцевого насоса, мини-экструдера и алюминиевой / стальной рамы для обеспечения циклической экструзии. (B)и(C)показывают разницу в внешнем виде липидных суспензий до (молочно-белой) и после (прозрачной опаловой синей) экструзии. Это связано с начальным образованием липидных стеков микрон или гигантских везикул, которые находятся на порядке или больше длины волны видимого света. После экструзии суспензия будет содержать наноскопические везикулы (~100 нм), которые меньше длины волны видимого света, давая прозрачную суспензию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4:Репрезентативные данные из экспериментов NSE на липосомальных суспензиях. (A) Пример эхо-сигнала над одним пикселем детектора (отмеченный пиксель на панели B), показывающий припадки эхо-сигнала с помощью уравнения (1), с иллюстрацией различных параметров, необходимых для эхо-подгонки. Обратите внимание, что эхо-сигнал строится как функция фазового угла, а не фазового тока, как описано на этапе 4.7 протокола. (B) Изображение детектора NSE, показывающее изменение количества нейтронов на пиксель. На изображении также показаны устраненные пиксели детектора (зеленый) из-за плохих эхо-сигналов. Биннинг пикселей детектора в Q-дугах (также известных как кольца Дебая-Шеррера) дает Q-зависимость промежуточной функции рассеяния, необходимую для анализа и интерпретации данных NSE. Эта цифра была изменена с Ashkar, J. Appl. Phys. 202050. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5:Репрезентативные результаты экспериментов NSE на липосомальных суспензиях с различными схемами дейтерации. (A) Геометрия рассеяния нейтрона, взаимодействующего с липосомой, показывающая угол рассеяния,2 θ, и перенос волнового вектора, . (B) Промежуточные функции рассеяния, S(Q,t) / S(Q,0), проявляют распады как функцию времени Фурье. Соответствие измеренных распадов растянутой экспоненциальной функции, заданной уравнением 3, дает скорость релаксации, Γ(Q). (C)Для полностью протиированных липосом в дейтерированном буфере Γ(Q)следует зависимости Q3, типичной для динамики изгиба. Линейное соответствие полученных данных модели Зильмана-Гранека дает модуль жесткости изгиба мембраны. (D)Для хвостовых дейтерированных липосом избыточная динамика наблюдается в дополнение к флуктуациям изгиба и наиболее выражена при значениях Q, соответствующих толщине мембраны. Приведение избыточной динамики к функции Лоренца (уравнение 5) позволяет извлекать вязкость мембраны. Наборы данных были собраны на спектрометре NSE в NIST. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов и нечего раскрывать.