Методическая статья

Нейтронная спиновая эхо-спектроскопия как уникальный зонд для динамики липидных мембран и мембранно-белковых взаимодействий

DOI:

10.3791/62396

⸱

27 мая 2021 г.

 ,  , 
1Department of Physics, Virginia Tech, 2Center for Soft Matter and Biological Physics, Virginia Tech

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье описываются протоколы подготовки образцов, восстановления данных и анализа данных в исследованиях нейтронного спинового эха (NSE) липидных мембран. Разумное дейтериевое маркировка липидов обеспечивает доступ к различной динамике мембран на мезоскопических масштабах длины и времени, в которых происходят жизненно важные биологические процессы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Липидные бислои образуют основную матрицу клеточных мембран и являются основной платформой для обмена питательных веществ, белково-мембранных взаимодействий и вирусного бутонизации, среди других жизненно важных клеточных процессов. Для эффективной биологической активности клеточные мембраны должны быть достаточно жесткими, чтобы поддерживать целостность клетки и ее компартментов, но достаточно текучими, чтобы позволить мембранным компонентам, таким как белки и функциональные домены, диффундировать и взаимодействовать. Этот тонкий баланс свойств упругих и жидких мембран и их влияние на биологическую функцию требуют лучшего понимания динамики коллективной мембраны по мезоскопической длине и временным масштабам ключевых биологических процессов, например, деформаций мембраны и событий связывания белка. Среди методов, которые могут эффективно исследовать этот динамический диапазон, является спектроскопия нейтронного спинового эха (NSE). В сочетании с дейтериевой маркировкой NSE может использоваться для непосредственного доступа к колебаниям изгиба и толщины, а также к мезоскопической динамике отдельных особенностей мембраны. В данной статье приводится краткое описание методики NSE и описываются процедуры проведения экспериментов NSE на липосомальных мембранах, включая детали схем пробоподготовки и дейтерации, а также инструкции по сбору и сокращению данных. В статье также представлены методы анализа данных, используемые для извлечения ключевых параметров мембраны, таких как модуль жесткости изгиба, модуль сжимаемости площади и вязкость в плоскости. Чтобы проиллюстрировать биологическую значимость исследований NSE, обсуждаются отдельные примеры мембранных явлений, исследуемых NSE, а именно: влияние добавок на жесткость изгиба мембраны, влияние образования доменов на флуктуации мембраны и динамическую сигнатуру мембранно-белковых взаимодействий.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Понимание клеточных мембран и их функций замечательно изменилось за последние несколько десятилетий. Прежний взгляд на клеточные мембраны как на пассивные липидные бислои, которые определяют границы клеток и белки домашней мембраны1, постепенно трансформировался в динамическую модель, в которой липидные бислои играют важную роль в регулировании жизненно важных биологических процессов, включая клеточную сигнализацию, молекулярный обмен и функцию белка — и это2,3,4,5,6. Это ос....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Схема деитерации, необходимая для эксперимента

  1. Для измерения флуктуаций изгиба делают полностью протиатированные липосомы вD2O(D 99,9%) илиD2O-буфере (например, фосфатный буфер, приготовленный сD2O вместоH2O). Используйте полностью протиированный DMPC (C36H72NO8P) и DSPC (C44H88NO8P) с figure-protocol-1 133,4 мг, где XDMPC и XDSPC являются молярными фракциями DMPC и DSPC, здесь установлены на 0,7 и 0,3 соответственно, а Mw

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования NSE, обращающиеся к флуктуациям изгиба, обычно выполняются в Q-диапазоне ~ (0,04 - 0,2) Å-1. Этот Q-диапазон соответствует шкалам промежуточной длины между толщиной мембраны и липосомальным радиусом, где доминирует динамика изгиба. Измерение в расширенном Q-диапазоне может дать доступ к дополнительным динамическим режимам, включая липосомальную диффузию и внутримембранную динамику. Для получения более подробной информации о кроссовере в мембранной динамике, доступ к NSE, ознакомьтесь с этими соотв.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NSE является мощным и уникальным методом измерения мезоскопической динамики липидных мембран в различных условиях. Эффективное использование NSE зависит от качества образца, контраста нейтронов и диапазона доступной динамики, которая может быть исследована для данного образца. Таким образом, для проведения успешных экспериментов NSE и сбора высококачественных данных требуется несколько критических шагов. Ключевым шагом в обеспечении эффективного использования времени нейтронного пучка во время эксперимента NSE является х.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов и нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Р. Ашкар благодарит М. Нагао, Л.-Р. Стингачу и. Золнерчук за многие полезные дискуссии и за их частую помощь в экспериментах NSE на их соответствующих линиях луча. Авторы признают использование нейтронных спиновых эхо-спектрометров в NIST и ORNL. Спектрометр NSE в NIST поддерживается Центром рассеяния нейтронов высокого разрешения, партнерством между Национальным институтом стандартов и технологий и Национальным научным фондом по соглашению No. ДМР-1508249. Спектрометр NSE в источнике нейтронов ORNL поддерживается Отделом научных пользовательских установок Управления фундаментальных энергетических наук Министерства энергетики США. Национальная лаборатория Оук-Ридж упр....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Хлороформ (биотехнологический сорт)Sigma Aldrich496189биотехнологический сорт, ≥ 99,8%, содержит 0,5-1,0% этанола в качестве стабилизатора
Циркуляционная водяная баняJulaboSE-12Нагревательный термостат с интеллектуальным насосом, программируемыми настройками температуры и подключением внешнего датчика для измерения и контроля
Оксид дейтерияКембриджские изотопы ЛабораторииDLM-4Дейтерированная вода; Тяжелая вода (D2O) (D, 99,9%)
Цифровые полумикровесыMettler ToledoMS105Полумикровесы емкостью 120 г, дискретностью 0,01 мг, весовой ячейкой с высоким разрешением, эргономичными дверцами и пипеткой для проверки
Этанол (класс молекулярной биологии)Sigma AldrichE7023200-градусный этанол для молекулярной биологии
Стеклянные пипеткиVWR36360-536Сода одноразовая Известковое стекло Пипетки Пастера
Стеклянные флаконыThermo ScientificB7990-1Боросиликатные стеклянные флаконы с крышками из ПТФЭ/Силиона
Морозильная камера лабораторного классаFisher ScientificIU2886DМорозильная камера со сверхнизкой температурой (от -86 до -50 С) для длительного хранения липидов и белков
Липиды (простатические или пердейтерированные)Avanti Полярные липидыразличаются в зависимости от липидаЛипиды можно приобрести у Avanti в виде порошка или в растворе хлороформа с необходимыми количествами и схемами дейтерации.
Очиститель водыMillipore SigmaZRQSVP3USDirect-Q®   3 УФ-система очистки воды, которая подает как чистую, так и сверхчистую воду со встроенной УФ-лампой для снижения уровня органики для биологических... Применение
Набор мини-экструдеровAvanti Polar Lipids610020Набор мини-экструдеров включает в себя мини-экструдер, нагревательный блок, 2 газоплотных шприца и 2 уплотнительных кольца, поликарбонатные мембраны и опоры
фильтра Быстроразъемные фитингиGrainger2YDA1 и 2YDA7Кнопочные трубчатые фитинги для циркуляции воды QuickConnect, например, высокотемпературная экструзия везикул
Шприцевой насосSyringePump.comNew Era-1000Полностью программируемый шприцевой насос для инфузии и вывода; программы до 41 фазы откачки с регулируемой скоростью откачки, дозируемыми объемами и циклами экструзии
Ультразвуковая ваннаFisher ScientificCPX2800Ультразвуковая ванна с регулируемой температурой и программируемой функциональностью для дегазации и ультразвуковых применений
Вакуумная печьThermo Scientific3608Вакуумная печь объемом 0,7 куб. фута со встроенным термостатом с высоким пределом защиты от перегрева
Вихревой смесительFisher Scientific02-215-414Регулируемая скорость, аналоговое управление, позволяющее запускать низкие обороты для мягкого встряхивания или высокоскоростное перемешивание для энергичного вихревого перемешивания образцов

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175 (4023), 720-731 (1972).
  2. Andersen, O. S., Koeppe, R. E. Bilayer thickness and membrane protein function: an energetic perspective. Annual ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Исправление

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions
Posted by JoVE Editors on 8/06/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions. The Introduction, Protocol, and Representative Results sections have been updated.

In the Introduction, the fith pargraph was updated from:

Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.

to:

Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.

In the Protocol, step 1.1 was updated from:

For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with Static equilibrium equation, formula involving mass calculation, relevant to educational research. 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).

to:

For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with Static equilibrium equation, formula involving mass calculation, relevant to educational research. 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).

In the Representative Results, the fist pagargaph was updted from:

NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: Coherent scattering equation I_coh(Q,t) - 1/3 I_inc(Q,t) for neutron scattering analysis., where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~2 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.

to:

NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: Coherent scattering equation I_coh(Q,t) - 1/3 I_inc(Q,t) for neutron scattering analysis., where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~0 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.

In the Representative Reults, Figure 2 was updated from:

Lipid bilayer structures; neutron scattering analysis; molecular arrangement diagram; lipid vesicles.
Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the headgroup (~2 × 10-2 Å-2) and tail region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Lipid bilayer diagrams with charts, nanostructure spheres, and membrane model in research context.
Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the tail region (~0 × 10-2 Å-2) and headgroup region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. Please click here to view a larger version of this figure.

Теги

Похожие статьи