Клетки CD34+ из лейкополетных фильтров как источник клеток для изучения дифференцировки мегакариоцитов и образования тромбоцитов

Тромбоциты крови происходят из специализированных крупных полиплоидных клеток, мегакариоцитов (МК), которые происходят из постоянного и тонко настроенного производственного процесса, известного как мегакариопоезис (MKP). На вершине этого процесса находятся гемопоэтические стволовые клетки, которые при контакте с средой костного мозга (цитокины, факторы транскрипции, кроветворная ниша) смогут размножаться и дифференцироваться в кроветворные прародители (НР), способные фиксироваться в направлении мегакариоцитного пути, давая начало незрелым МК^1. Под влиянием различных цитокинов, и в частности тромбопоэтина (ТПО), который является основным цитокином МКФ; Затем МК пройдет две основные стадии созревания: эндомитоз и развитие демаркационных мембран (ДМС). Этот полностью зрелый МК затем появляется близко к синусоидальному сосуду, в котором он может испускать цитоплазматические расширения, проplatelets, которые будут высвобождаться под кровотоком и впоследствии реконструироваться в функциональные тромбоциты^2. Клонирование ТПО в 1994^г.3 обеспечило импульс в изучении МКП за счет ускорения разработки методов культивирования in vitro, позволяющих дифференцировать НР и созревание МК.

Существует множество патологий, поражающих тромбоциты крови, как по количеству тромбоцитов (увеличение или уменьшение), так и по функции^4,5. Возможность рекапитулировать MKP in vitro от человеческой HP может улучшить понимание молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе этого процесса и, в конечном счете, терапевтического ведения пациентов.

Подойдут различные источники НР человека: пуповинная кровь, костный мозг, периферическая кровь^6,7,8. Сбор HP из периферической крови вызывает меньше логистических и этических проблем, чем их восстановление из пуповинной крови или костного мозга. ГП можно восстановить после лейкафереза или пышной шерсти, но эти источники дороги и не всегда доступны в центрах крови. Другие протоколы, менее дорогие и простые в выполнении, позволяют напрямую восстанавливать мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMCs) без необходимости предварительной изоляции CD34^4,8. Однако чистота мегакариоцитов не является удовлетворительной при этом методе, и для оптимальной дифференцировки в МК рекомендуется отбор клеток CD34+ из PBMC. Это привело нас к внедрению очистки HP от фильтров лейкоредукции (LRF), обычно используемых в банках крови для удаления белых кровяных клеток и, таким образом, предотвращения неблагоприятных иммунологических реакций^9. Действительно, с 1998 года концентраты тромбоцитов автоматически лейкодеплируются во Франции. В конце этого процесса LRF выбрасываются, и все клетки, оставшиеся в LRF, разрушаются. Таким образом, ячейки в LRF легко доступны без каких-либо дополнительных затрат. LRF имеют клеточное содержание, близкое к тому, которое получено путем лейкафереза или в пушистых слоях, особенно в их составе CD34 + HP, что делает их удивительно привлекательным источником^10. Уже было продемонстрировано, что LRF как человеческий источник HP обеспечивает клетки с неповрежденными функциональными способностями^11. Этот источник имеет то преимущество, что он обильен и доступен для лабораторных исследований. В этом контексте в данной статье последовательно описываются: i) извлечение и выбор CD34⁺ HP из LRF; ii) двухфазная оптимизированная культура, которая рекапитулирует приверженность HP в мегакариоцитарный путь и созревание MK, способного испускать проплацелеты; iii) способ эффективного высвобождения тромбоцитов из этих МК; и iv) процедура фенотипирования МК и культивированных тромбоцитов.

Контрольные образцы человека были получены от доноров крови, которые дали письменное информированное согласие, полученное центром переливания крови, где проводилось исследование (Etablissement Français du Sang-Grand Est). Все процедуры были зарегистрированы и одобрены Министерством высшего образования и исследований Франции и зарегистрированы под номером AC_2015_2371.Доноры дали свое одобрение в форме согласия CODHECO No AC- 2008 - 562, чтобы образцы использовались в исследовательских целях. Исследования на людях проводились в соответствии с Хельсинкской декларацией.

1. Извлечение и отбор клеток CD34+ (HP) из LRF

1. Препарат реагента (для одного LRF)
   1. Приготовьте 25 мл фильтрованного буфера элюации: 21,25 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), 2,5 мл кислотно-цитрат-декстрозы (ACD) и 1,25 мл декомплементированной фетальной бытовой сыворотки (FBS). Фильтровать на 0,22 мкм и размещать при 37 °C.
   2. Приготовьте 500 мл PBS с 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).
   3. Утилизируйте 25 мл среды градиента плотности (DGM) (1,077 г/мл) в двух пробирках по 50 мл.
2. Методы обратной промывки LRF (Рисунок 1)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого этапа требуется стерильный аппарат для сварки труб, позволяющий стерильное соединение термопластичных трубок.
   1. Во-первых, подключите LRF к пустому мешку для переноса 600 мл, а LRF к комплекту труб(рисунок 1A). Под шкаф биобезопасности вводят в пустой мешок общий объем отфильтрованного и подготовленного элюирующего буфера, соответствующего количеству обрабатываемых LRF (xLRF x 25 мл). Затем, используя шприц объемом 30 мл, мягко аспирировать все содержимое мешочка через LRF, продуть обратно и перенести клетки в новую трубку объемом 50 мл(рисунок 1B).
   2. Для осаждения эритроцитов разбавьте клеточную суспензию пополам декстраном на 2% и хорошо перемешайте для агрегирования эритроцитов. Подождите 30 мин при комнатной температуре (RT).

Рисунок 1:Условия обратной промывки LRF. (A)Репрезентативная схема(i)стерильного соединения передаточного мешка с LRF и(ii)трубки, установленной на LRF. (B) Репрезентативная схема подключения шприцев для клеточного сбора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Коллекция PBMC
   1. После осаждения эритроцитов удалите и перенесите супернатант в пробирку 50 мл и заполните ее PBS-EDTA 2 мМ. Аккуратно наложим супернатант на вышеприготовленный ДГМ. Пусть супернатант течет мягко, не нарушая поверхностную плоскость градиента плотности. Центрифуга при 400 х г при RT в течение 30 мин в режиме выключения тормоза.
   2. Соберите слой PBMC с помощью одноразовой трансферной пипетки. Перенесите клетки из каждой трубки DGM в новую стерильную трубку 50 мл. Заполните каждую трубку PBS-EDTA 2 мМ и дважды промыть в 50 мл PBS-EDTA 2 мМ при 200 х г в течение 10 мин при RT в режиме торможения.
   3. Пипетка отключите и объедините гранулу ячейки с 50 мл PBS-EDTA 2 мМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существует возможность остановить процедуру, поддерживая собранные клетки при перемешивании при 4 °C в течение ночи. Затем отфильтруйте суспензию с помощью клеточного ситечкового фильтра 40 мкм, чтобы удалить образовавшемся заполнитель.
4. Выбор ячеек CD34+
   1. Определяют номер ячейки и центрифугу при 400 х г при комнатной температуре в течение 10 мин с включенной паузой.
   2. Аспирировать супернатант полностью и повторно суспендировать в соответствующем объеме PBS-EDTA 2 мМ, подробно описанном производителем селекционного комплекта CD34 (300 мкл PBS-EDTA на 10⁸ ячеек). Добавьте блокирующий FcR реагент и микрограницы CD34 в соответствующей концентрации (50 мкл на 10⁸ клеток).
   3. Через 30 мин при 4 °C промыть клеточную суспензию и повторно суспендировали в соответствующем объеме PBS-EDTA 2 мМ, подробно описанном производителем селекционного комплекта CD34 (500 мкл на 10⁸ ячеек).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор производится на сортировке столбцов для прохождения максимум 2 x 10⁹ ячеек на столбец.
   4. Пропустите образец над мокрым столбом магнита. Дважды промыть 3 мл PBS-EDTA 2 мМ и элюлируем клетки 5 мл PBS-EDTA 2 мМ. Второй прогона на новой колонке после той же процедуры необходим для повышения чистоты образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемое число 6,1 х 10⁵ ячеек/LRF(рисунок 2A). Для более высоких чисел LRF масштабируйте реагенты и методы соответственно.
5. Оценка чистоты клеток CD34+
   1. Добавьте к аликвоте 100 мкл суспензии, полученной после^cd34+ селекции, 2 мкл человеческого CD34-PE антитела или 2 мкл IgG-PE (контроль). Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 мин при 4 °C.
   2. Промывайте ячейки, добавляя 2 мл PBS и центрифугу при 400 х г в течение 5 мин. Аспират супернатант полностью и повторно суспендируется в 200 мкл PBS.
   3. Проанализируйте чистоту с помощью проточной цитометрии, как показано на рисунке 2А и в обсуждении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается чистота клеток CD34+ выше 90%(рисунок 2Bii).
   4. Используйте клетки CD34+ напрямую или заморозьте для дальнейшего использования.
6. Замораживание клеток CD34+
   ПРИМЕЧАНИЕ: Замораживание клеток CD34+ производится при плотности 10⁶ клеток в мл.
   1. После определения количества клеток CD34+ подготовьте следующие криоконсервационные среды: (1) 60% Stemspan + 40% FBS, (2) 40% Stemspan + 40% FBS + 20% Dimethyl Sulfoxide (DMSO) и позвольте охладить при 4 °C.
   2. Центрифугируют ячейки CD34+ при 400 х г при комнатной температуре в течение 5 мин и повторно суспендируют гранулу в холодном растворе 1, а затем сразу добавляют в холодный раствор 2 (v/v).
   3. Поместите криотрубки непосредственно в морозильную камеру при -80 °C в течение 24 ч, а затем переложите криотрубки в резервуар для жидкого азота.

2. Культивация и дифференцировка клеток CD34+ для получения зрелых проплателет-несущих мегакариоцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол клеточной культуры(рисунок 3A),репрезентативная схема процедуры клеточной культуры подробно описаны в этом разделе.

1. Оттаивание клеток CD34+ (при необходимости)
   1. Готовят раствор для размораживания: 13 мл PBS-20% FBS и помещают при 37 °C в течение 15 мин. Быстро перенесите криотрубы на водяную баню с 37 °C до одного маленького кристалла льда. Под биологический культурологический шкаф пипетку выкладываем все содержимое и медленно перекладываем в 13 мл предварительно выморохивающего оттаивающего раствора.
   2. Определите количество клеток и жизнеспособность клеток.
2. Протокол культивной культуры, шаг 1: с 0-го дня по 7-й день
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно культуры изготавливают в 24-скважинных пластинах с 1 мл среды на скважину при плотности 40 000 жизнеспособных клеток/мл, что соответствует 20 000 жизнеспособных^{клеток/см2.} Крайне важно соблюдать эту плотность, если планируется какое-либо расширение.
   1. Препарат питательной среды: В свободные от сыворотки среды расширения гемопоэтических клеток (предварительно нагретые до 37 °C) добавляют пенициллин-стрептомицин-глутамин (PSG) 1x, липопротеин низкой плотности человека (hLDL) при 20 мкг/мл, цитокиновый коктейль расширения мегакариоцитов 1x и stemregenin 1 (SR1) при 1 мкм.
   2. Посев клеток: Центрифугирование размороженных клеток CD34+ при 400 х г при комнатной температуре в течение 5 мин. Тщательно удаляют супернатант и повторно суспендируют клеточную гранулу в 1 мл культурального носителя и выполняют нумерацию и жизнеспособность клеток для определения соответствующего объема для засева клеток.
   3. Центрифугируют ячейки 400 х г при комнатной температуре в течение 5 мин и повторно суспендируют гранулу в соответствующем объеме теплой питательной среды. Инкубируют клетки при 37 °C с 5% CO₂ в течение 7 дней.
3. Протокол культивной культуры, шаг 2: с 7-го по 13-й день(рисунок 3В,репрезентативные изображения на 13-й день)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно культуры изготавливают в 24-скважинных пластинах с 1 мл среды на скважину при плотности 50 000 жизнеспособных клеток/мл, что соответствует 25 000 жизнеспособных клеток/см². Крайне важно соблюдать эту плотность, если планируется какое-либо расширение.
   1. Приготовление среды созревания: В свободной от сыворотки среде расширения гемопоэтических клеток (предварительно нагретой до 37 °C) добавляют PSG 1x, hLDL при 20 мкг/мл, TPO при 50 нг/мл и SR1 при 1 мкМ.
   2. Исследуйте клетки под микроскопом. На 7-й день клетки демонстрируют круглый и однородный вид, заполняя колодцы или колбы, не будучи слишком слишком слизыми.
   3. Под шкафом биобезопасности аккуратно перенесите клетки в пробирку 15 мл. Промывайте колодцы с PBS. Затем определите количество клеток и их жизнеспособность, чтобы рассчитать соответствующий объем для посева клеток.
   4. Центрифугировать ячейки при 400 х г при комнатной температуре в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторно суспендируете ячейки в соответствующем объеме теплой среды, рассчитанном на предыдущем этапе. Инкубируют клетки при 37 °C, 5% CO₂ в течение 6 дней.
4. Высвобождение культивированных тромбоцитов на 13-й день
   1. Добавьте к культуре 0,5 мкМ простагландина I₂ (PGI₂₎ и 0,02 Ед/мл апиразы и выполните последовательную пипетку пять раз пипеткой 1 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тромбоциты теперь высвобождаются в среду.

3. Анализ проточной цитометрии (фенотипирование МК и количество культивированных тромбоцитов)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол может быть применен к фенотипированием клеток в выбранные дни культивирования. Он также позволяет определить количество культивированного высвобождения тромбоцитов(рисунок 4A,B).

1. Подготовка к анализу МК
   1. Обозначьте четыре набора микроцентрифужных трубок следующим образом: Немаркированные клетки в качестве контрольных, клетки + 5 мкл CD41 - Alexa Fluor 488, Клетки + 5 мкл CD34 - PECy7, Клетки + 5 мкл CD41 - Alexa Fluor 488 + 5 мкл CD34 - PECy7. Используйте минимум 1,10⁵ клеток на трубку, не превышайте 1,10⁶ клеток на трубку. Добавьте к 100 мкл клеточной суспензии на цитометрическую трубку и различные антитела. Инкубировать в темноте в течение 30 мин при 4 °C.
   2. Затем добавляют 2 мл PBS-EDTA 2 мМ на пробирку и центрифугу при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Во время центрифугирования готовят раствор PBS-EDTA 2 мМ + 7-Аминоактиномицин-D (7AAD) (1/100), дают по 300 мкл раствора на пробирку.
   3. Удалите супернатант и возьмите гранулу в 300 мкл PBS-EDTA 2 мМ с 7AAD. Прогоняйте образцы через проточный цитометр в течение 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стратегия анализа для проточной цитометрии показана на рисунке 3C и в обсуждении.
2. Подготовка пробирки для анализа тромбоцитов
   1. Обозначьте четыре набора микроцентрифужных трубок следующим образом: Немаркированные клетки в качестве контрольных, Клетки + 5 мкл CD41 - Alexa Fluor 488, Клетки + 20 мкл CD42a - ПЭ, Клетки + 5 мкл CD41 - Alexa Fluor 488 + 20 мкл CD42a - ПЭ. После пяти последовательных пипеток в культуре скважины переложите 300 мкл суспензии в трубку для цитометрии, содержащую калиброванное количество флуоресцентных шариков.
   2. Добавьте антитела и инкубируют в темноте при RT в течение 30 мин.
   3. Прогоняйте образцы через проточный цитометр в течение 30 минут и установите комплектование на прохождение 5000 бусин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стратегия анализа для проточной цитометрии показана на рисунке 4B и в обсуждении.

Извлечение и отбор клеток CD34+ из LRF
Здесь способ, полученный из Peytour et al.9,описывает экстракцию и отбор CD34+ клеток из выброшенных LRF, доступных в банках крови после удаления лейкоцитов. После процедуры обратной проливки обычно восстанавливается 1,03x 10 9 ± 2,45 x10 8 клеток/LRF (Mean±SEM; n = 155) с жизнеспособностью 94,88 ± 0,10%(рисунок 2A i). После положительного отбора CD34 получается в среднем 615,54 х 103 ± 12,28 клеток/LRF (n = 155)(рисунок 2A ii). Если количество клеток меньше 300 000, необходимо сделать вывод, что процедура была проведена неправильно и должна быть остановлена. Чтобы оценить успех селекции CD34, чистоту клеток CD34+ оценивают с помощью проточной цитометрии(рисунок 2B). Обычно ожидается чистота выше 90% (91,88 ± 0,79%)(рисунок 2B). Чистота ниже 75% может означать, что возникла проблема в проведении протокола и, в частности, в элюированием колонок. Ниже чистоты 75% клетки не сохраняются для культурных экспериментов.

Рисунок 2:Анализ чистоты CD34+ cell number/LRF и CD34. (A)(i)Проводится анализ по счетчику клеток количества клеток и их жизнеспособности, полученных в результате процедуры, включая как сбор PBMC, так и отбор CD34 ((1.03.109 ± 2.45.108 клеток/LRF (Средняя ± SEM; n=155) с жизнеспособностью 94,88 ± 0,10% (n = 155)). ii)Анализ по счетчику клеток также проводится после отбора CD34 (615,54 x 103 ± 12,28 клеток/LRF (n = 155)). (B) Чистота CD34 анализируется с помощью проточной цитометрии. (i)Клетки окрашивали антителом CD34-PE и идентифицировали по их параметрам FSC/SSC. (ii)На основе анализа рассеянного сигнала и экспрессии CD34 определяется чистота. Был использован предварительный затвор позитивности CD34 на основе отрицательного контроля для маркера CD34. iii)Как видно на гистограмме, ожидается чистота клеток CD34+ выше 90% (91,88 ± 0,79% (n = 17)). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дифференциация и созревание МК-подшипниковых пластин
Описанная процедура культивирует клетки делится на два этапа. Первый, от дня (D) 0 до D7, посвящен пролиферации HP и вовсению в мегакариоцитарный путь в ответ на комбинацию цитокинов и добавление химического соединения SR1. Второй, от D7 до D13, ориентирован на созревание MK и расширение проплатлетов после добавления TPO и SR1(рисунок 3A). В качестве контроля качества культуры подсчет клеток, определение жизнеспособности клеток и фенотипирование клеток выполняются при D7 и D10. Эти этапы были выбраны потому, что они имеют решающее значение для обязательств HP, созревания D7 и MK, D10 соответственно (персональные данные). При D7 и 10 пролиферация обычно составляет x4,16 ± 0,25 (n = 34) и x2,30 ± 0,16 (n = 5), соответственно, при этом жизнеспособность клеток составляет от 86,38 ± 0,73% (n = 34); и 84,80 ± 2,67% (n = 5)(рисунок 3B). Что касается фенотипирования клеток, как показано на рисунке 3C,при D0 более 90% клеток являются положительными для CD34. Затем клетки CD34+ становятся приверженными мегакариоцитарной линии, о чем свидетельствует явление CD41, специфического и раннего маркера MKP. Действительно, при D7 50,20 ± 2,90% клеток положительны как для CD34, так и для CD41(рисунок 3Bii). Затем МК улучшает их созревание. При D10 большинство МК являются зрелыми, причем менее 15,60 ± 4,70% клеток отрицательны для CD41, 47,90 ± 8,90% - CD34+CD41+ и 36,40 ± 12,40% - CD34-CD41+ (рисунок 3Biii).

Рисунок 3:Дифференциация и созревание МК-подшипниковых пластин. (A) Репрезентативная схема процедуры культивирования клеток. Используется двухэтапный метод: этап пролиферации от D0 до D7 (SR1 и коктейль цитокинов) и этап созревания от D7 до D13 (SR1 и TPO). При D13 культивирование тромбоцитов может высвобождаться после пяти последовательных пипеток. (B)(i)Скорость пролиферации при D7 (x4,16 ± 0,25 (n = 34)) и жизнеспособность клеток (86,38 ± 0,73% (n = 34)). ii)скорость пролиферации при D10 (x2,30 ± 0,16 (n = 5)) и жизнеспособность клеток (84,80 ± 2,67% (n = 5)). (C) Анализ состояния анализа проточной цитометрии фенотипической эволюции МК в культуре. При D0 95,80 ± 0,80% клеток являются CD34 положительными (n = 3). При D7 50,20 ± 2,90% клеток положительны на CD34 и CD41. При D10 менее 15,60 ± 4,70% клеток отрицательны для CD41. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Высвобождение культивированных тромбоцитов, день 13
Обследование скважин на Д13 показывает круглый МК и проплатоносный МК(рисунок 4А). В среднем 35% культивированных МК распространяют проплателеты12. Следует отметить, что D13 представляет собой оптимальный день для расширения проплатлетов и высвобождения тромбоцитов. Если требуемый уровень МК, способный излучать проплацеты, не достигнут, то, должно быть, что-то пошло не так в процессе культивирования и результаты не должны учитываться.

Хотя точные механизмы, способствующие высвобождению тромбоцитов из зрелого МК, все еще плохо изучены, хорошо известно, что гемодинамические силы незаменимы. Чтобы имитировать эти силы in vitro,суспензию, содержащую прослекольсодержащую МК, аспирируют и отталкивают пять раз конусом P1000, а затем анализируют с помощью проточной цитометрии. Для этого используются трубки, содержащие калиброванное количество флуоресцентных шариков. Во-первых, шарики, присутствующие в трубке, закрыты на окне CD41-Alexa-fluor 488/PErcP-Cy5(рисунок 4Bi,красным цветом). Затем культивируемые тромбоциты визуализируются в предвратнике (тромбоцитоподобные элементы), определяемые по параметрам прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) нативных тромбоцитов(рисунок 4Bii). Затем количество тромбоцитов определяется по их положительности CD41/CD42a(рисунок 4Biii). Подсчет клеток останавливается в этом протоколе на 5000 бусин, но в зависимости от рекомендации поставщика может использоваться другое фиксированное число. Из полученных данных количество тромбоцитов, подсчитанных на 5000 бусин, обычно составляет в среднем 24,01 ± 92 (n = 15)(рисунок 4C). Зная объем аспирируемого проточным цитометром на счет 5000 шариков (рассчитывается для каждого цитометра) и общий объем культуры, можно получить приближение к общему количеству выделяемых культивируемых тромбоцитов.

Рисунок 4:Высвобождение культивированных тромбоцитов на 13 день. (А) Репрезентативная световая микроскопия изображения МК, излучающих проplatelets на D13. (B)Стратегия количественной оценки высвобождения культивируемых тромбоцитов. (i)Бусины закрыты на окне CD41-Alexa-fluor 488/PErcP-Cy5 (красным цветом). (ii)Тромбоцитоподобные элементы визуализируются в затворе, определяемом по параметрам FSC/SSC нативных тромбоцитов (серые точки). (iii)Культивируются тромбоциты по их положительной CD41/CD42 (фиолетовой). (C)Количество тромбоцитов, подсчитанных на 5000 бусин, может быть получено, обычно в среднем 24 011 ± 919 (n = 15). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Краткий обзор процедуры
Чтобы лучше обобщить метод и понять каждый шаг, плакат, обобщающий протокол шаг за шагом, представлен на рисунке 5. Этот сводный лист может отображаться в культурной комнате и служить памяткой. Следует отметить, что успех экспериментов гарантируется только ссылками на продукты, указанными в предоставленной таблице.

Рисунок 5:Изоляция CD34+. Плакат, обобщающий протокол шаг за шагом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторам нечего раскрывать.