Культура и визуализация органоидов эпителия носа человека

Введение в технику
Анализы ex vivo на основе культуры являются все более используемым инструментом для точной медицины и изучения патофизиологии заболеваний. Первичная культура клеток эпителия носа человека (HNE) использовалась в многочисленных исследованиях муковисцидоза 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , аутосомно-рецессивное заболевание, которое влияет на функцию эпителиальных клеток в нескольких органах. Культура HNE обеспечивает возобновляемый источник эпителия дыхательных путей, который может быть получен перспективно и воспроизводит электрофизиологические и биохимические качества для проверки активности регулятора трансмембранной проводимости муковисцидоза (CFTR). Клетки HNE могут быть отобраны с минимальными побочными эффектами¹⁴, аналогичными обычным вирусным респираторным тампонам. Исследовательская работа, описывающая модель исследования муковисцидоза, полученная из биопсии щетки HNE, была недавно опубликована^11,13. Подобно другим моделям, использующим первичную HNE ^2,3 и кишечную ткань 15,16,17,18,19, подробная характеристика дифференцировки и визуализации этой модели описаны здесь для использования в исследованиях муковисцидоза и для оказания помощи в исследованиях других заболеваний дыхательных путей¹³ . Органоидная модель не является неограниченной, как увековеченные клеточные линии, но может быть расширена путем условного перепрограммирования (с использованием облученных и инактивированных фидерных фидерных фидеров и ингибиторов рокиназы) до более похожего на стволовые клетки состояния 20,21,22,23. Обработка биопсии щеток HNE с использованием этого метода дает большое количество эпителиальных клеток для использования в нескольких приложениях с более высокой пропускной способностью, сохраняя при этом способность к полной дифференцировке. Хотя этот протокол был разработан с использованием фидерных клеток, другие методологии могут быть использованы исследователями, желающими избежать технологии фидерных клеток^14,24.

Важность методики для биологии легких
Значительное исследование было посвящено пониманию того, как отсутствие регулярного, функционирующего CFTR в клеточной мембране эпителиальных клеток приводит к дисфункции в легких, поджелудочной железе, печени, кишечнике или других тканях. Дисфункциональный транспорт ионов эпителия, особенно хлорида и бикарбоната, приводит к уменьшению объема эпителиальных выстилающих жидкостей и изменениям в слизистых выделениях, что приводит к застою и обструкции слизистой оболочки. При других заболеваниях дыхательных путей, таких как первичная цилиарная дискинезия, измененное цилиарное движение ухудшает слизистый клиренс и приводит к застою слизистой и обструкции²⁵. Поэтому текущая органоидная модель HNE была разработана для различных применений, в зависимости от экспериментального дизайна и ресурсов исследователя. Это включает в себя визуализацию живых клеток с использованием пятен живых клеток; фиксация и сечение для характеристики морфологии; иммунофлуоресцентное окрашивание антителами и конфокальная визуализация цельного крепления во избежание нарушения внутрипросветных структур; и визуализация яркого поля и микрооптическая когерентная томография для количественных измерений частоты ресничного биения и мукоцилиарного транспорта¹³. Чтобы облегчить распространение на других исследователей, для культивирования использовались коммерчески доступные реагенты и расходные материалы. Был разработан функциональный анализ, в котором использовались общие методы микроскопа и более специализированное оборудование. В целом, хотя настоящая модель была разработана для оценки активности CFTR на исходном уровне или в ответ на терапию, методы, описанные в этом протоколе, могут быть применены к другим заболеваниям, связанным с функцией эпителиальных клеток, особенно к переносу эпителиальной клеточной жидкости.

Сравнение с другими методологиями
Недавно была разработана полезность этой органоидной модели путем корреляции in vitro CFTR модуляторных реакций органоидов пациентов с их клиническим ответом¹¹. Примечательно, что также показано, что настоящая модель параллельна токам короткого замыкания, текущему золотому стандарту оценки функции CFTR, у тех же пациентов. Ток короткого замыкания отличается от анализа набухания, потому что первый измеряет функцию CFTR через транспорт ионов²⁶. В отличие от этого, этот анализ измеряет более нисходящий эффект с переносом жидкости, предоставляя дополнительную информацию об общей функции CFTR 27,28,29,30,31,32. Измерения тока короткого замыкания по-прежнему являются распространенным и надежным методом определения активности^канала хлорида CFTR ^1,33. Эти электрофизиологические анализы требуют специализированного, дорогостоящего оборудования, требуют во много раз больше клеток для каждой экспериментальной репликации, чем органоидный анализ, не могут быть легко автоматизированы и не поддаются масштабированию для приложений с более высокой пропускной способностью. Другая органоидная модель, полученная из кишечного эпителия, имеет дополнительные преимущества 15,16,17,18, такие как более отличная репликативная способность, но не получена из ткани дыхательных путей и не является универсально доступной. Щетки HNE получают недорогими цитологическими щетками без необходимости седации и с минимальным риском. Получение чистки зубов не требует клинициста и может быть выполнено обученными координаторами исследований и другим исследовательским персоналом¹⁴. Органоидная модель HNE может быть культивирована любой лабораторией с возможностями первичной клеточной культуры, и некоторые из применений могут быть выполнены стандартными методами микроскопии. В целом, эти преимущества обеспечивают дополнительный доступ к технологии оценки функции эпителия дыхательных путей, которая в противном случае могла бы быть недоступна для некоторых лабораторий. Кроме того, органоиды HNE могут быть использованы для изучения других болезненных состояний, которые влияют на дыхательные пути, таких как первичная цилиарная дискинезия²⁵ или вирусная инфекция, которую кишечные органоиды не могут.

Образцы HNE были собраны в детской больнице Алабамы. Все процедуры и методы, описанные здесь, были одобрены IRB Университетом Алабамы в Бирмингеме (UAB IRB #151030001). Для облегчения расширения и улучшения функции эпителиальных клеток носа человека (HNEs) настоящие методы культивирования адаптированы из хорошо известного метода культуры воздушно-жидкостного интерфейса (ALI) ^28,34. Первоначально ГНЭ были собраны с помощью биопсии щетки, как^{описано ранее 12,14}, с единственным отличием в использовании цитологической щетки. Все этапы обработки образцов и культивирования клеток выполнялись в шкафу биобезопасности.

1. Клеточная культура и расширение эпителиальных клеток носа

1. После чистки щеткой храните образец биопсии носа в 8 мл среды RPMI в конической пробирке объемом 15 мл на льду и переносите его в лабораторию в течение 4 ч (не более 24 ч).
2. Диссоциируйте биопсию носовой кисти на 8 мл среды RPMI в конической трубке объемом 15 мл, пропуская цитологическую щетку через кончик пипетки с большим отверстием 1 мл (отрезанный кончик) несколько раз, пока щетка не очистится от ткани.
3. Центрифугируют клетки при 500 х г в течение 5 мин при 4 °С, удаляют надосадочный материал, а затем повторно суспендируют клеточную гранулу в 3 мл раствора для отсоединения клеток (см. Таблицу материалов) и инкубируют при комнатной температуре в течение 16 мин для переваривания.
4. Используйте 5 мл расширительной среды (таблица 1) для промывки ячеек дважды. Затем добавляют клетки в колбу T75, предварительно засеянную облученными и инактивированными 3T3 фибробластами²² (50%-60% слияние), чтобы совместно культивировать клетки и расширяться в расширительной среде в течение 7-14 дней (см. Рисунок 1 для соответствующей колонии). Перед использованием протестируйте облученные фибробласты 3T3, чтобы убедиться, что они не могут размножаться, что негативно повлияет на расширение эпителиальных клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выбросьте клетки, если слияние эпителиальных клеток носа не достигает 70% в течение 14 дней.
5. Для клеток, полученных от пациентов с муковисцидозом, вводят четыре антибиотика (100 мкг/мл тобрамицина, 2,5 мкг/мл амфотерицина В, 100 мкг/мл цефтазидима, 100 мкг/мл ванкомицина, см. Таблицу материалов) в расширительную среду для дезинфекции клеток в течение первых 3 дней культивирования, а затем заменяют среду свободными от антибиотиков расширительными средами, изменяя среду каждые 2 дня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это ограниченное использование антибиотиков предназначено для уменьшения потери культуры из-за бактериальной колонизации, одновременно поощряя пролиферацию после удаления дополнительных антибиотиков. Эти антибиотики могут быть адаптированы к конкретным результатам микробиологии пациента, с чувствительностью, если это необходимо.
6. Собирают HNEs из совместной культуры с использованием метода двойной трипсинизации²² , как только клетки достигают приблизительно 80% слияния. Этот метод гарантирует, что облученные и инактивированные фибробласты 3T3 удаляются из колбы, и они не загрязняют последующее органоидное посев.
   1. Промыть клетки 1x DPBS, а затем добавить 1,5 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в колбу T75 в течение 4 мин при 37 °C для удаления облученного и инактивированного фибробласта 3T3 из культуры.
   2. Дважды промойте колбу T75 1x DPBS, чтобы тщательно смыть оставшиеся фибробласты 3T3; добавить 1,5 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в колбу T75 в течение 10 мин при 37 °C для отделения ГНЭ.
   3. Нейтрализуют трипсин ингибитором трипсина сои (см. Таблицу материалов) в соотношении 1:1. Центрифугируют клетки при 500 х г в течение 5 мин, а затем удаляют супернатант. После промывки клеток 5 мл расширительной среды один раз, клетки готовы к посеву для выращивания органоидов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ХНП с проходным номером три рекомендуется использовать для дальнейших экспериментов.

2. Рост и дифференциация органоидов в слайдах и культуральных вставках

1. Разморозить органоидную культуру внеклеточного матрикса (ECM) в течение ночи при 4 °C. Прохладные наконечники пипетки до 4 °C и 15-луночные слайды ангиогенеза (см. Таблицу материалов) в течение ночи при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ECM должен быть поставлен при 4 °C в ночь перед тем, как необходимо провести сбор клеток.
2. Покройте слайды 5 мкл холодного 100% ECM на льду (пипетка 5 мкл холодного 100% ECM с холодным наконечником пипетки в каждую лунку 15-луночного слайда), а затем поместите их в инкубатор клеточной культуры при 37 °C на срок не менее 30 мин для консолидации.
3. Подсчитайте ГНП, собранные из кокультуры, с помощью гемоцитометра и разбавьте клетки до 500 клеток/мкл в общем количестве с 20% ECM, разбавленным дифференцировочными средами (таблица 2) на льду. Затем посыпайте 5 мкл смеси холодной клетки/ECM в каждую лунку слайдов, покрытых ECM.
4. Немедленно переложите слайды в инкубатор культуры при 37 °C в течение 1 ч для консолидации смеси клетка/ECM.
5. Подкармливайте клетки в каждой лунке 15-луночного ангиогенеза с 50 мкл дифференцировочной среды. Меняйте среду через день, пока органоиды не будут готовы к дальнейшим экспериментам.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды обычно можно визуализировать через 1-2 дня. В каждом колодце горок обычно образуется 20-90 органоидов. Органоиды обычно могут выживать в течение 40-60 дней в ECM с кормлением через день при хранении в увлажненном инкубаторе при 37 ° C.
6. Культивируйте органоиды в культуральных вставках (см. Таблицу материалов) для большего количества для конкретных применений (таких как секционирование для гистологии или иммунофлуоресценции) в соответствии с этапами, упомянутыми ниже.
   1. Чтобы вырастить органоиды в культуральных вставках, подготовьте органоидную культуру ECM, наконечники пипеток и вкладыши, как указано в шагах 2.1-2.2. Покройте вкладыши 100 мкл холодного 100% ECM.
   2. Посейте 60 мкл смеси cell/ECM (500 клеток/мкл с 20% ECM в дифференцировочной среде) поверх покрытия ECM во вставке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все остальные этапы изготовления органоидов во вставках такие же, как и на слайдах, этапы 2.4-2.5.
   3. Добавить 600 мкл дифференциаторной среды в нижнюю часть вкладыша. Меняйте среду каждый альтернативный день, пока органоиды не будут использоваться для экспериментов, обычно 2-3 недели.

3. Подготовка и выделение органоидов для цельной иммунофлуоресценции

1. Выделение и фиксация органоидов
   1. Предварительно обработайте 8-луночные слайды камеры со стеклянным дном клеточным клеем (см. Таблицу материалов) в течение 30 мин после ссылки³⁵. После выбрасывания раствора высушите лунки на воздухе в течение 30 мин.
   2. Чтобы извлечь органоиды, удалите среду из верхней части ECM, а затем добавьте 50 мкл холодного 1x PBS в каждую лунку 15-луночных слайдов на льду (1: 1 с объемом ECM).
   3. Пипетка вверх и вниз 3-5 раз, используя 200 мкл наконечника пипетки с большим отверстием, а затем дозируйте раствор на центр колодца 8-луночной камеры слайдов.
   4. Немедленно удалите лишнюю жидкость из скважин с помощью тонкоконечной пипетки. Затем поместите затвор камеры в инкубатор при температуре 37 °C в течение 40 минут, чтобы усилить органоид, прилипший к стеклянному дну.
   5. После осторожной промывки 1x PBS дважды зафиксируйте органоиды с 300 мкл 4% параформальдегида в каждой лунке в течение 30 мин при комнатной температуре (RT).
   6. Дважды промыть 1x PBS и хранить органоиды в 1x PBS при 4 °C для иммуноокрашения в течение 2 недель.
2. Иммунофлуоресцентное окрашивание
   1. Чтобы уменьшить автофлуоресценцию, добавьте 250 мкл 50 мМ NH₄Cl в 1x PBS в каждую лунку слайдов на RT в течение 30 минут, осторожно встряхивая шейкер на 20 оборотах.
   2. После промывки 1x PBS дважды проницайте клетки 0,1% Triton X-100 в течение 30 мин при RT, осторожно встряхивая при этом 20 об/мин.
   3. После промывки 1x PBS дважды добавляют 300 мкл блокирующего раствора, включая 5% BSA и 0,1% Triton X-100 в 1x PBS, в каждую лунку в течение 1 ч при RT.
   4. После промывки добавляют первичные антитела в соответствующие лунки, а затем вторичные антитела (см. Таблицу материалов). Готовят растворы первичных и вторичных антител в 2% BSA и 0,3% Triton X-100 в 1x PBS. Инкубировать все первичные антитела при 4 °C в течение 2 дней и все вторичные антитела при 4 °C в течение 1 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечные концентрации зависят от белка, желаемого для эксперимента. Пожалуйста, проверьте концентрацию запасов в техническом описании производителя. Затем рассчитайте конечные концентрации на основе разбавлений, используемых в Таблице материалов.
   5. После инкубации тщательно промыть скважины 1x PBS и добавить DAPI в 2% BSA и 0,3% Triton X-100 в каждую скважину для ядерного окрашивания.
   6. Изобразите органоиды с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа с 20-60-кратным масляным погружением (см. Таблицу материалов). Используйте режим Z-стека для установки верхней и нижней границ изображения и используйте рекомендуемый оптимальный размер Z-шага, определенный конфокальным программным обеспечением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Были использованы следующие четыре длины волн конфокального лазерного возбуждения: 408,7 нм, 489,1 нм, 561,7 нм и 637,9 нм.

4. Подготовка и выделение органоидов для гистологического сечения

1. Чтобы извлечь органоиды для гистологических исследований, удалите среду из культуры и добавьте 50 мкл холодного 1x PBS в каждую лунку горок на льду.
2. Пипетка вверх и вниз три-пять раз, используя наконечник пипетки с большим отверстием объемом 200 мкл, объедините все растворы из 15-луночных слайдов или культуральных вставок в коническую трубку объемом 15 мл на льду. Отрегулируйте общий объем раствора в пробирке до 10 мл, добавив дополнительный холодный 1x PBS.
3. Центрифугировать трубку при 4 °C, 300 х г в течение 5 мин; аспирировать супернатант и добавить 60 мкл теплого гистогеля (см. Таблицу материалов) для смешивания с органоидной гранулой, используя 200 мкл кончика пипетки с большим отверстием.
4. Немедленно переведите суспензию в гистологическую форму. После консолидации гистогеля при комнатной температуре поместите блок формы в 4% параформальдегид для фиксации на ночь при 4 °C.
5. После встраивания в парафин разрежьте блок гистогена на 5 мкм поперечных сечений (например, с помощью микротома), зафиксируйте участки на стеклянных слайдах и окрашивайте с помощью гематоксилина и эозина (H & E) или иммунофлуоресцентных антител. Делайте снимки с помощью ярко-полевого микроскопа или инвертированного эпифлуоресцентного микроскопа (см. Таблицу материалов).

5. Визуализация живых органоидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие этапы выполняются с использованием автоматизированной системы визуализации (см. Таблицу материалов). Различные системы визуализации должны адаптировать эти шаги в соответствии с инструкциями конкретного производителя. Независимо от используемого оборудования, для визуализации живых органоидов требуется камера окружающей среды с контролируемой температурой и увлажненная камера с сопровождаемым газовым контроллером CO₂ .

1. Чтобы контролировать дифференциацию органоидов перед выполнением функционального анализа набухания³⁶, захватите все слайдовые изображения вручную с помощью любого микроскопа яркого поля или с помощью автоматизированной системы визуализации, как подробно описано ниже.
   1. Включите питание автоматизированной системы визуализации и газового контроллера CO₂/O₂ и позвольте системе завершить автоматическую калибровку (~30 мин).
   2. После завершения установите температуру системы визуализации на уровне 37 °C; добавьте 15 мл стерильной воды в резервуар для увлажнения, откройте клапаны CO₂ , закройте крышки и дайте системе визуализации предварительно инкубироваться в течение как минимум 30 минут перед визуализацией.
   3. Откройте автоматизированное программное обеспечение для создания изображений, чтобы настроить протокол для визуализации и выбрать место для сохранения необработанных экспериментальных данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пример файла протокола (Дополнительный файл 1), специфичный для системы визуализации, был предоставлен в качестве шаблона для автоматизированной визуализации органоидов для мониторинга дифференцировки органоидов.
   4. После того, как условия окружающей среды будут выполнены, немедленно перенесите до двух 15-луночных слайдов с крышками в экологическую камеру во вставке держателя слайдов автоматизированной системы изображения (см. Таблицу материалов).
   5. Выберите скважины для получения изображения и начните визуализацию для полной визуализации желаемых скважин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Основные рекомендуемые настройки: 4x и 10x воздушный объектив, ярко-полевой канал, 2 x 2 монтажа для 4x объектива для покрытия всей площади скважины, 4 x 4 монтажа для 10x объектива. Настройки Z-стека: от трех до шести фрагментов Z-стека, размер Z-шага = 50-100 мкм, от одного до двух срезов ниже точки автофокусировки и от трех до пяти фрагментов выше.
2. Чтобы получить изображение живых органоидов для использования в анализе набухания, вызванного форсколином (FIS), используйте микроскоп с автоматизированной ступенью, оснащенной камерой визуализации с экологически контролируемым контролем, которая позволяет контролировать температуру и CO₂ .
   1. Начните с шагов 5.1.1-5.1.4, замените файл протокола на шаге 5.1.3 файлом, приведенным в примере файла протокола (Дополнительный файл 2), содержащим настройки, специфичные для выполнения анализа FIS.
   2. Перед каждым экспериментом настраивайте параметры экспозиции, оценивая по крайней мере три скважины для каждого слайда (крайний левый, средний и крайний правый). Примените смещения координат X и Y, чтобы гарантировать, что цель будет находиться в центре скважины для всех скважин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Основные рекомендуемые настройки: 4x воздушный объектив, канал 1 = яркое поле, канал 2 = DAPI, монтаж 2 x 2 (четыре плитки изображения). Настройки Z-стека: три-четыре Среза Z-стека, размер Z-шага = 50-100 мкм, один срез ниже точки автофокусировки и два-три среза выше. Время получения изображения: 8 ч с интервалами 20 мин (Всего считывает = 25; Чтение 1 равно T = 0).
   3. После того, как все настройки выбраны соответствующим образом, выберите скважины для изображения для обоих слайдов или выберите все и начните запуск в соответствии с инструкциями оборудования.
   4. После запуска сохраните эксперимент, закройте программное обеспечение для обработки изображений и завершите работу системы обработки изображений³⁷.

6. Измерение базового светового потока

ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается с помощью программного обеспечения для ручного анализа изображений (см. Таблицу материалов). Аналогичная методология может быть использована с использованием программного обеспечения³⁸ с открытым исходным кодом или любого программного обеспечения, которое может измерять площадь области на изображении.

1. В программном обеспечении откройте Панель автоматических измерений , щелкнув правой кнопкой мыши нижнюю часть экрана, выберите Измерение, а затем Автоматизированные результаты измерений. Там появится область измерения каждого интересующего региона (ROI).
2. Откройте органоидное изображение в программном обеспечении и выберите 5-10 органоидов с видимыми просветами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Люмены будут представлять собой круглую область в середине органоида, которая заметно отличается по цвету от остальной части органоида (рисунок 2A).
3. Используя функцию измерения ROI полигона, щелкните правой кнопкой мыши на изображении, чтобы открыть меню, и выберите Polygonal ROI , чтобы очертить весь органоид для получения общей площади поверхности органоида (TSA). Затем, используя тот же признак, наметьте область просвета (LA) (рисунок 2B).
4. Повторите для оставшихся органоидов в лунке и всех лунок в анализе.
5. Экспортируйте данные в Excel. Разделите LA на TSA и усредните все органоиды из образца, чтобы получить базовый коэффициент просвета (BLR)^11,13.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, ~ 87% органоидов без МУКОВисцидоза будут иметь BLR более 0,6, а 97% будут более 0,5, в то время как только 14% органоидов CF будут иметь BLR более 0,6, а 31% будет более 0,5.

7. Предварительная обработка и автоматизированная визуализация органоидов HNE

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы предварительной обработки проводятся в чистом кабинете биобезопасности. Предварительно настройте автоматизированную систему визуализации и программное обеспечение для записи анализа перед шагом 7.1. Инкубация с DAPI является необязательной, но рекомендуется как отказоустойчивая, если качество ярких полевых изображений нарушено. В этом случае можно проанализировать канал DAPI (377 нм).

1. Предварительно инкубируют органоиды в лунке из 15-луночных слайдов с 50 мкл дифференцировочных сред, содержащих DAPI со 100 мкМ CFTRinh-172 или без них (см. Таблицу материалов) в инкубаторе с температурой 37 °C в течение 1 ч. Пока органоиды инкубируются, выполните шаг 5.2.1, используя пользовательский протокол анализа набухания после дополнительного файла 2.
2. Удалите прединкубационную среду с помощью стеклянной пипетки Пастера с аспирацией. Добавьте 10 мкМ форсколина и 100 мкМ IBMX (стимулирующие коктейли) (см. Таблицу материалов) для общего объема дифференцирующих сред 50 мкл в каждую лунку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в скважины не вводятся пузырьки. Пузырьки на изображениях повлияют на автоматизированный анализ.
3. Безотлагательно запустите протокол визуализации FIS после шагов 5.2.2-5.2.4. Получайте изображения каждые 20 минут в каждой скважине, с общим временем работы 8 часов.

8. Автоматизированный анализ форсколин-индуцированного анализа набухания на органоидах HNE

1. Откройте программное обеспечение для автоматизированного анализа изображений, найдите эксперимент, ранее сохраненный из шага 7.3, и отобразите изображения эксперимента.
2. Выберите окно сосуда для оценки и выберите параметр, содержащий обработанные изображения, которые были сшиты и z-проецированы. Этот шаг должен обеспечить картину всей скважины со всеми органоидами в рамках визуализации для маскировки оценки и измерений.
3. Выберите изображение скважины для оценки. Выберите Анализ. Повторите этот процесс для других изображений, чтобы обеспечить соответствующую маскировку для всех изображений, включенных в автоматизированные измерения. Сохраните параметры настройки.
4. После завершения анализа настроек примените изменения. Программное обеспечение будет изменять измерения на основе настроек.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения первоначальной предварительной обработки изображения должны быть выполнены меры контроля качества (QC) для обеспечения последовательной маскировки. К ним относятся ручной обзор всех скважин, чтобы убедиться, что органоиды находятся в рамках визуализации, пузырьки или мусор не маскируются ненадлежащим образом, и проверка маскировки в ярком поле и каналах DAPI.
5. Экспортируйте данные для суммарного анализа (включая график и статистический анализ).

Расширение HNEs имеет важное значение для процветающей органоидной культуры. ГНП от успешного отбора проб должны расширяться до более чем 70% слияния примерно через 10 дней. Пример успешных и неудачных выборок показан на рисунке 1A и рисунке 1B соответственно. Клетки должны быть выброшены, если они не могут достичь 70% слияния через 14 дней после совместной культивирования с облученными клетками 3T3. Любые загрязненные клетки должны быть немедленно выброшены, если они не могут быстро спастись с помощью дополнительных противомикробных агентов.

Рост органоидов сравнивали в 15-луночных слайдах и культуральных вставках. Вставки культуры толще и дальше от цели, чем оптически оптимизированные слайды, что влияет на изображение и разрешение. Несмотря на это, в этих двух методах культивирования не наблюдалось существенных различий в морфологии, как показано на рисунке 2. Морфологические различия можно увидеть между органоидами без МВ и МВ, как показано на рисунке 3А. Органоиды, не относящиеся к CF, как правило, имеют больший просвет, содержащий больше жидкости внутри него. Напротив, органоиды муковисцидоза обычно имеют меньший просвет с меньшим количеством жидкости и иногда заполнены слизью и мусором. Размер светового потока измеряли вручную (рисунок 3B), а базовый коэффициент светового потока рассчитывали и показывали на рисунке 3C. Поперечные органоиды были охарактеризованы с использованием H&E и иммунофлуоресцентного окрашивания. Репрезентативные изображения показаны на рисунке 4A,B. Эпителиальные маркеры дыхательных путей, такие как реснички, слизь и плотное соединение, демонстрируются в органоидах путем иммунофлуоресцентного окрашивания цельного крепления, показанного на рисунке 5A-D. В зависимости от применения может использоваться секционная или цельномонтная иммунофлуоресценция. Метод цельного крепления поддерживает трехмерную природу органоида, сохраняя внутреннюю часть органоида нетронутой, как показано в ранее опубликованной работе13.

Функция CFTR оценивалась с помощью анализа форсколин-индуцированного набухания (FIS) с использованием автоматизированной системы визуализации. Для функциональных анализов используются только 15-луночные слайды из-за лучшего разрешения изображения. Репрезентативный эксперимент с дозой и ответом форсколина добровольцев без муковисцидоза (n = 5 субъектов) показан на рисунке 6А, чтобы проиллюстрировать обоснование оптимизированного времени визуализации и анализа. Данные, сравнивающие органоидные ответы без муковисцидоза и МВ, подробно описаны в предыдущих публикациях11,13. Доза-реакция показывает постепенное изменение активности CFTR для демонстрации наилучшего подхода к измерениям. Была оценена продолжительность анализа 1 ч и 8 ч (рисунок 6B,C), а также анализ с использованием среднего дробного изменения (AFC) по сравнению с площадью под кривой (AUC) показан на рисунках 6C,D. Основываясь на нашем предыдущем опыте, отек для большинства субъектов и состояний стабилизируется через 8 ч, а в некоторых случаях приводит к разрыву органоидов за это время. Поэтому анализы были ограничены только 8 часами. При этой увеличенной длине анализа набухание становится нелинейным. Использование AUC также учитывает как изменения в размере, так и скорость изменения. Поэтому AUC более 8 ч использовался для всех анализов FIS в окончательной методологии.

Рисунок 1: Изображения яркого поля ГНП в совместной культуре. ГНЭ расширяются в расширительных средах с облученными и инактивированными фибробластами 3T3 в течение 10 дней. Для визуализации клеток используется инвертированный микроскоп яркого поля. (A) ХНП хорошо растут в большом скоплении (черная стрелка). Напротив, в (B) ГНЭ плохо растут в двух небольших кластерах (черные стрелки), окружающих облученные клетки 3T3. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Образование органоидов HNE в 15-луночном слайде и культуральной вставке. Изображения органоидов с ярким полем были получены с помощью перевернутого ярко-полевого микроскопа в течение 21 дня. Органоиды в 15-луночном слайде (A) имеют более точные и четкие изображения, чем в культуральной вставке (B). Морфологической разницы между органоидами, культивируемыми в слайде и вставке, не наблюдалось. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Размер просвета органоида (панель A) и измерения светового просвета (панели B и C). (A) Органоиды без CF обычно имеют больший просвет и больше жидкости, чем органоиды CF (F508del / F508del). (B) Метод ручного измерения общей площади поверхности (TSA), обозначенной красным контуром и площадью просвета (LA), обозначенной зеленым контуром в одном органоиде. (C) Пример использования общей площади поверхности и площади светового просвета для расчета исходного коэффициента светового потока (LA: TSA) в органоидах субъекта, не страдающего CF, по сравнению с субъектом CF. Полосы погрешностей представляют стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Поперечное сечение органоидов, встроенных в парафин. (A) Пример окрашивания H&E в органоидах у субъекта, не содержащего CF и CF (F508del/F508del). (B) Иммунофлуоресцентное окрашивание ресничек в органоиде. Зеленый - это реснички (белая стрелка), окрашенные ацетилированным тубулином и меткими FITC вторичными антителами, а синим - ядра, помеченные DAPI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Конфокальные изображения иммунофлуоресценции цельного крепления в органоидах. (А,С) Максимальные проекционные изображения двух представительных органоидов. (Б,Г) Трехмерные реконструкционные изображения (А) и (С) соответственно. На платформе конфокального микроскопа был установлен 8-луночный слайд со стеклянным дном, а для создания микрофотографий использовался 40-кратный объектив. Программное обеспечение для анализа изображений было применено для визуализации и реконструкции изображений. Белые стрелки указывают на слизь (в В) и реснички (в С) в просвете органоидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Обоснование длины анализа набухания и методов анализа. Анализ форсколина (FSK), индуцированного отеком (FIS), для проверки функции CFTR на первичных эпителиальных клетках носа. Различные дозы форсколина, указанные на рисунках, вводили в 21-дневные органоиды в дифференцировочных средах; органоидное набухание сразу же регистрировалось с помощью автоматического тепловизора в течение 8 ч. Через 8 ч отек показан в (A) (n = 5, без CF субъектов) с использованием среднего дробного изменения (AFC). Доза-реакция FSK сравнивается с AFC через 1 ч (B) против 8 ч (C), что говорит о том, что анализ за 8 ч может привести к более значительной разнице в отеках между различными дозами FSK, чем через 1 ч. AFC (C) по сравнению с областью под кривой, AUC (D) через 8 ч сравниваются, что указывает на то, что AUC может отражать незначительную разницу в отеке, чем AFC. Ось X в панелях (B-D) представляет различные условия обработки, соответствующие символам в легенде рисунка. Все полосы ошибок на рисунках указывают на стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Все компоненты для изготовления расширительного носителя. Описана подробная информация о концентрации запаса реагентов, хранении запасов, количестве запасов для получения среды объемом 500 мл и конечной концентрации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Все компоненты для изготовления дифференцирующих сред. Описана подробная информация о концентрации запаса реагентов, хранении запасов, количестве запасов для получения среды объемом 500 мл и конечной концентрации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительный файл 1: Пример файла протокола, специфичного для системы визуализации, предоставляется в качестве шаблона для автоматизированной визуализации органоидов для мониторинга дифференцировки органоидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Пример файла протокола, содержащий параметры, специфичные для выполнения анализа FIS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

JSG указан как изобретатель в патентной заявке 20170242033 из Университета Северной Каролины, которая описывает аналогичную модель. Когда лицензированная технология от UNC приносит роялти, изобретатели получают долю выручки. В противном случае авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, в сборе, анализе или интерпретации данных, в написании рукописи или в принятии решения о публикации результатов.