Поперечный перелом бедренной кости мыши стабилизирующим штифтом

Переломы, разрывы в непрерывности костной поверхности, происходят во всех слоях населения. Они становятся тяжелыми у людей с хрупкими костями из-за старения или болезней, а расходы на здравоохранение при переломах хрупкости, как ожидается, превысят 25 миллиардов долларов через 5 лет ^1,2,3,4,5. Понимание биологических механизмов, участвующих в восстановлении переломов, станет отправной точкой в разработке новых методов лечения, направленных на улучшение процесса заживления. Предыдущие исследования показали, что при переломе происходят четыре значительных шага, которые позволяют кости заживать: (1) образование гематомы; (2) образование фиброхрящевой мозоли; (3) минерализация мягкой мозоли с образованием кости; и 4) ремоделирование зажившей кости ^6,7. Многие биологические процессы активизируются для успешного заживления перелома. Во-первых, острая провоспалительная реакция инициируется сразу после перелома ^6,7. Затем надкостница активируется и расширяется, а периостальные клетки дифференцируются в хондроциты, образуя мозоль хряща, которая растет, чтобы заполнить пробел, оставленный нарушенными сегментами^кости 6,7,8,9. Нервные и сосудистые клетки вторгаются во вновь образованную мозоль, чтобы обеспечить дополнительные клетки и сигнальные молекулы, необходимые для облегчения восстановления ^6,7,8,9,10. В дополнение к содействию образованию мозоли, периостальные клетки также дифференцируются в остеобласты, которые откладывают тканую кость в мостовой мозоли. Наконец, остеокласты ремоделируют вновь образованную кость, чтобы вернуть свою первоначальную форму и пластинчатую структуру 7,8,9,10,11. Многие группы разработали мышиные модели восстановления переломов. Одной из более ранних и наиболее часто используемых моделей переломов у мышей является подход Эйнхорна, при котором вес падает на ногу с определенной высоты¹². Отсутствие контроля над углом и силой, приложенной для индуцирования перелома, создает большую изменчивость в расположении и размере разрыва кости. Впоследствии это приводит к изменениям в специфической реакции заживления переломов. Другими популярными подходами являются хирургическое вмешательство для получения монокортикального дефекта большеберцовой кости или стрессовых переломов, процедуры, которые вызывают сравнительно более мягкие реакции заживления^10,13. Изменчивость в этих моделях обусловлена в первую очередь человеком, проводящим процедуру¹⁴.

Здесь подробная модель травмы бедренной кости мыши позволяет контролировать разрыв, чтобы обеспечить воспроизводимую травму и позволить количественную и качественную оценку восстановления перелома бедренной кости. В частности, вводится полный прорыв в бедренных костях взрослых мышей и стабилизирует концы переломов, чтобы учесть роль физической нагрузки в заживлении костей. Также подробно представлены методы сбора тканей и визуализации различных этапов процесса заживления с использованием гистологии и микрокомпьютерной томографии (микроКТ).

Все описанные эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Гарвардской медицинской области. В этом протоколе использовались 12-недельные мыши C57BL/6J (самцы и самки). C57BL/6J самцы и самки мышей достигают пиковой костной массы в возрасте около 12 недель с бедренными костями, достаточно широкими, чтобы вместить стабилизирующий штифт, что делает их подходящим штаммом для использования в этом^{протоколе 15}.

1. Подготовка к операции

1. Автоклав хирургического оборудования, включая хирургические ножницы, прямые щипцы, изогнутые щипцы, хирургические зажимы и алмазное режущее колесо (см. Таблицу материалов), чтобы свести к минимуму риск заражения.
2. Поместите чистую клетку мыши на грелку, чтобы облегчить послеоперационное восстановление. Установите грелку на температуру в пределах 37-45 °C.
3. Поместите мышь под наркоз с помощью изофлурановой камеры. Установите индукционный поток кислорода на уровне 2 л/мин, индукцию изофлурана на 2-4%, поддерживающий носовой конус кислорода на 2 л/мин, а поддерживающий изофлуран составляет 1,4%.
4. Убедитесь, что дыхание мыши стабильно и они не реагируют на защемление пальца ноги. Нанесите тонкий слой офтальмологической мази на каждый глаз, чтобы предотвратить расчесывание роговицы. Переведите мышь на стерильную прокладку и поддерживайте анестезию с помощью носового конуса для непрерывной доставки изофлунана с той же скоростью, что и на этапе 1.3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать 12-недельных мышей или старше, так как бедренные кости молодых мышей могут быть слишком тонкими, чтобы вместить стабилизирующий штифт.
5. Вводят мышам подкожно 0,05 мг/кг массы тела бупренорфина с медленным высвобождением (см. Таблицу материалов).
6. С помощью электрического триммера побрейте квадрат размером 2 х 2 см на обоих бедрах, соответствующий расположению бедренной кости.
7. Продезинфицируйте бритую область, используя стерильную марлю или тампоны, чтобы распределить слой йода с последующим ополаскиванием 70% этанола (рисунок 1A).

2. Хирургия

1. Используя стерильный скальпель, сделайте разрез 5 мм в бритой, продезинфицированной области и отшелушите кожу, чтобы обнажить подлежащую фасцию.
2. Используйте прямые щипцы и тонкие ножницы, чтобы деликатно захватить и разрезать фасцию, непосредственно покрывающую бедренную кость, чтобы обнажить мышцу. 5 мм разреза фасции достаточно для доступа к нижележащей мышце.
3. Используя одну пару прямых щипцов, аккуратно отделите мышцу от бедренной кости с минимальным повреждением тканей.
4. Как только бедренная кость будет видна, сдвиньте изогнутые щипцы под бедренную кость между отделенной мышцей и костью. Дайте щипцам медленно открыться, чтобы сохранить разделение мышц и закрепить бедренную кость, чтобы облегчить чистый разрез.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Бедренная кость должна оставаться открытой и отделенной от мышц и кожи, когда щипцы не удерживаются, как показано на рисунке 1B.
5. Сделайте поперечный разрез в середине вала бедренной кости с помощью ручной пилы на низком энергопотреблении (см. Таблицу материалов для используемого лезвия и комплект поворотных инструментов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как только бедренная кость полностью разрезана, создаются два конца перелома: проксимальный отдел (прикрепленный к бедренной кости) и дистальный отдел (прикрепленный к колену, также известный как удушающий сустав). Избегайте разрезания бедренной кости одним движением. Вместо этого сделайте 3-5 проходов, пока бедренная кость полностью не будет разрезана. Это имеет решающее значение, чтобы избежать перегрева окружающих тканей и образования значительных костных обломков, негативно влияющих на заживление.
6. Вставьте направляющую иглу (23 G x 1 TW IM, 0,6 мм x 25 мм) (см. Таблицу материалов) в полость костного мозга дистального отдела. Используйте пальцы, чтобы осторожно скрутить иглу, когда вы нажимаете на продевание через коленный сустав (рисунок 1C).
   1. Извлеките направляющую иглу с дистального конца и повторите на проксимальном конце, используя то же мягкое скручивающее движение, чтобы протолкнуть направляющую иглу через тазобедренный сустав. Оставьте направляющую иглу в проксимальном конце, кончиком которой вылез из кожи (рисунок 1D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для стабилизации концов перелома сначала использовали направляющую иглу для создания пути через концы перелома, а затем стабилизирующий штифт продевали через этот путь для закрепления концов перелома¹⁴.
7. Вставьте стабилизирующий штифт (иглу, 27 G x 1 1/4, 0,4 мм x 30 мм) (см. Таблицу материалов) в наконечник направляющей иглы (рисунок 1E). Осторожно надавите так, чтобы стабилизирующий штифт вошел, когда направляющая игла выходит из полости костного мозга проксимального конца.
   1. Отбросьте направляющую иглу. Используйте пинцет, чтобы удерживать и выравнивать дистальный конец с проксимальным концом и продолжать продевать стабилизирующий штифт через дистальную полость костного мозга, пока он не выйдет из коленного сустава, используя путь, выполненный в 2.6 (Рисунок 1F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стабилизирующий штифт теперь должен выступать из тазобедренного и коленного суставов.
8. Используя хирургический зажим, потяните кончик штифта, чтобы приблизить проксимальный и дистальный отделы друг к другу, чтобы они едва касались. При необходимости выровняйте концы перелома щипцами и сложите концы стабилизирующего штифта к месту перелома с помощью хирургического зажима (см. Таблицу материалов).
   1. Снимите пластик с основания иглы с помощью проволочных резаков. Используя зажим, поверните оба конца штифта до тех пор, пока они не станут тупыми, чтобы избежать повреждения внутренних тканей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концы переломов теперь зафиксированы на месте, чтобы мышь могла наложить вес на поврежденную ногу. Штифт закрепляется, если концы перелома не могут отделиться. Проволочный резак также может быть использован для затупления концов. Стабилизирующий штифт должен оставаться на месте в течение всего периода исследования, пока мышь не будет усыплена. Попытки смещения штифта могут дестабилизировать реакцию на перелом и нанести вред животному. Штифт может быть удален при рассечении.
9. Используйте прямые щипцы, чтобы переместить мышцу на бедренную кость. Используя изогнутые щипцы, сжимайте концы кожи вместе и закрывайте отверстие с помощью намотанных зажимов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не закрывайте кожу слишком плотно зажимами, иначе мышь не будет нагружать эту ногу. Ограничение физической нагрузки во время восстановления может задержать процесс заживления.
10. Повторите шаги 2.2-2.4 на другой ноге и закройте рану, не выполняя перелом бедренной кости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта фиктивная бедренная кость служит контралатеральным контролем.
11. Снимите экспозицию изофлурана, поместите мышь в нагретую клетку и убедитесь, что они приходят в сознание в течение 10-15 минут.
12. Контролируйте активность мыши и место разреза ежедневно в течение 5 дней после операции на наличие признаков дистресса или инфекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если животное демонстрирует признаки боли, не ест и / или не решается ходить по задним конечностям, проконсультируйтесь с ветеринарным персоналом и введите дополнительный анальгетик.
13. Удалите раневые клипсы через 10 дней после операции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если рана, по-видимому, не закрылась через 10 дней, проконсультируйтесь с ветеринарным врачом и IACUC перед удалением зажимов.

3. Сбор ткани

1. Усыплите мышей с помощью вдыхания_CO2 с последующим вывихом шейки матки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура согласуется с Работой Группы по эвтаназии Американской ветеринарной медицинской ассоциации.
2. Используя ножницы и щипцы, удалите кожу с обеих ног мыши, вывихните головку бедренной кости и отрежьте соседнюю мышцу, чтобы освободить ногу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте удаления слишком большого количества мышц вокруг бедренной кости, так как мозоль может быть смещена или повреждена.
3. Избегая стабилизирующего штифта, прорежьте коленный сустав, чтобы отделить бедренную кость от большеберцовой кости.
4. Рассекните вокруг дистальной и проксимальной частей бедренной кости, чтобы обнажить концы стабилизирующего штифта.
5. С помощью жесткого проволочного резака отрежьте сложенные тупые концы штифта, чтобы осталась только прямая часть штифта. Используйте щипцы, чтобы медленно и осторожно вытащить стабилизирующий штифт из бедренной кости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если штырь не легко выскальзывает, не прикладывайте усилие, так как это может выбить мозоль и повредить образец. Вместо этого попробуйте повернуть штифт и аккуратно удалить его. Снятие штифта также может быть проще после фиксации.

4. Гистология - Окрашивание альциановым синим / эозиным / оранжевым G

ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание Alcian Blue/Orange G/Eosin обычно используется для визуализации хряща (синий) и кости (розовый). Площадь хряща может быть количественно определена как доля от общей площади мозоли (рисунок 2A,B).

1. Зафиксируйте бедренные кости в 10% нейтральном буферизованном формалине на ночь при 4 °C.
2. Промывайте неподвижные образцы фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS).
3. Поместите образцы в 0,5M EDTA, pH 8,0 на медленно вращающийся шейкер в течение 2 недель. Меняйте решение EDTA через день, чтобы обеспечить эффективную декальцинацию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для шейкера не требуется никаких специальных оборотов; убедитесь, что жидкость течет в контейнере, чтобы покрыть все образцы. Полная декальцинация может быть проверена рентгеновским снимком бедренных костей.
4. Для обработки образцов для встраивания парафина инкубируют их в следующие растворы (по 1 ч каждый): 70% EtOH, 95% EtOH, 100% EtOH, 100% EtOH, ксилол, ксилол, парафин, парафин.
5. Вставьте образцы в парафин для секционирования.
6. Вырежьте продольные участки сломанных бедренных костей толщиной 5-7 мкм с помощью микротома.
7. Депарафинизируйте секции, инкубируя их в 2 ваннах с ксилолом (по 5 мин каждая).
8. Регидратируйте срезы путем инкубации в следующем градиенте этанола (по 2 мин каждый): 100% EtOH, 100% EtOH, 80% EtOH, 70% EtOH.
9. Поместите горки в водопроводную воду на 1 мин.
10. Внесите растворы алцианового синего, кислотного спирта, аммониевой воды и эозина/апельсинового G для гистологии, как указано в дополнительном файле 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагаемые объемы каждого раствора должны быть достаточными для полного погружения слайдов для окрашивания.
11. Поместите слайды в кислотный спирт на 30 с и инкубируйте в альциановом синем в течение 40 мин.
12. Аккуратно вымойте под проточной кран до тех пор, пока вода не станет прозрачной в течение примерно 2 минут.
13. Быстро окуните горки в кислотный спирт на 1 с.
14. Смойте, как описано в шаге 4.9.
15. Инкубировать в аммониевой воде в течение 15 с.
16. Смойте, как описано в шаге 4.9.
17. Поместите в 95% EtOH в течение 1 мин и инкубируйте в Eosin/Orange G в течение 90 с.
18. Быстро обезвоживайте слайды с помощью одного погружения в 70% EtOH, 80% EtOH и 100% EtOH.
19. Поместите слайды в ксилол на 1 мин, чтобы очистить слайды.
20. Примените монтажный носитель и крышку для создания изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для молекулярного анализа РНК и белок могут быть выделены из мозоли. Тщательно рассекните мышцу под рассекающим прицелом и отделите мозоль от подлежащей кости с помощью скальпеля.

5. МикроКТ

ПРИМЕЧАНИЕ: На более поздних стадиях заживления микроКТ может быть выполнен для изображения и количественной оценки минерализации в твердой мозоли и разрыве перелома. У мышей C57BL/6J мозоль обычно минерализуется и обнаруживается микроКТ через 10 дней после перелома (dpf) (рисунок 2C).

1. Зафиксируйте бедренные кости в 10% нейтральном буферизованном формалине на ночь при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: МикроКТ может быть выполнен на тех же бедренных костях, которые используются для гистологии, если это сделано до декальцификации ЭДТА (шаг 4.3). При использовании одних и тех же бедренных костей для обоих методов выполните микроКТ, извлеките образцы и перейдите к шагу 4.3.
2. Промыть неподвижные образцы в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) и хранить в 70% EtOH.
3. Выполняют микроКТ с изотропным размером вокселя 7 мкм при энергетическом уровне 55 кВП и интенсивности 145 мкА (см. Таблицу материалов).
4. Контурные срезы микроКТ, чтобы включить мозоль и исключить кортикальную кость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку мозоль со временем становится более минерализованной, порог может быть скорректирован для визуализации и измерения объема мозоли на разных этапах.
5. Получить объем кости, содержащийся в контурах мозоли, как измерение объема мозоли.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разрыв разрушения может быть измерен непосредственно на срезах микроКТ как расстояние, занимаемое разрывом.

У мышей C57BL/6J успешная операция завершает этапы заживления, упомянутые ранее, практически без местной воспалительной реакции или периостального поражения в фиктивной контралатеральной бедренной кости. Гематома образуется через несколько часов после операции, а надкостница активируется для набора скелетных предшественников для хондрогенеза. Различные клеточные популяции, такие как мезенхимальные предшественники Prx1+ , могут быть прослежены в процессе восстановления с использованием коммерчески доступных моделей флуоресцентных репортерных мышей (рисунок 3). Через 5 дней после перелома (dpf) окрашивание Alcian Blue может быть использовано для визуализации мягкой мозоли и последующей количественной оценки области хряща (рисунок 2A, B). Минерализация обнаруживается с помощью микроКТ при 28 dpf (рисунок 2C). Объем минерализованной мозоли, расстояние разрыва перелома и прочность кости, измеренные механическим тестированием, обычно используются в качестве количественных результатов восстановления перелома. Генетическая модификация или медикаментозное вмешательство могут изменить ход восстановления, поэтому рекомендуется проводить исследование с временным курсом для характеристики переломов на разных стадиях восстановления. Вся мозоль может быть рассечена для молекулярного анализа, а контралатеральный костный стержень может быть использован в качестве контроля.  Если концы перелома не выровнены или не закреплены надлежащим образом штифтом, полученные изображения покажут отсутствие образования мозоли на всей или одной стороне места перелома (рисунок 4).

Рисунок 1: Перелом и вставка стабилизирующего штифта. (A) Квадрат выбрит на правой ножке мыши C57BL/6J. (B) После того, как разрез сделан в коже и фасции, изогнутые щипцы закрепляются под бедренной костью, чтобы отделить мышцу, кожу и кость. (C) После того, как разрез сделан, создаются два конца перелома: проксимальный отдел бедренной кости, прикрепленный к бедренной кости, и дистальный отдел, прикрепленный к колену. Направляющая игла (зеленая) вводится в дистальный отдел и проталкивается через коленный сустав. (D) Направляющая игла удаляется из дистального отдела, вводится в проксимальный отдел и проталкивается через тазобедренный сустав. (E) Стабилизирующий штифт (серая игла) вводится в направляющую иглу, выступающую из тазобедренного сустава. (F) Стабилизирующий штифт проталкивается через проксимальный отдел, в дистальный отдел и через коленный сустав с помощью пути, сделанного направляющей иглой в C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Гистология и микроКТ перелома бедренной кости. (A) Формалин-фиксированные парафиновые срезы переломов бедренной кости были собраны на 5, 10 и 28 dpf и окрашены альциановым синим / эозиновым / оранжевым G. Шкала bar = 500 мкм. (B) Площадь хряща была количественно определена с использованием программного обеспечения ImageJ в 5, 10 и 28 dpf. (C) При 28 dpf наблюдалась минерализация, а объем мозоли и разрыв разрушения могли быть измерены с помощью микроКТ. Шкала = 1 000 мкм. Данные показаны как среднее ± SEM. Минерализованный объем мозоли измеряли контуром вокруг кортикальной кости в месте перелома. Темно-серая область очерчивает минерализованную мозоль на изображении, в то время как кортикальная кость (светло-серая) не включена в измерение. Данные показаны как Средние ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Флуоресцентная репортерная модель, используемая для визуализации расширения периостальных клеток Prx1+ после перелома. Prx1CreER; Мышам Rosa26tdTomato вводили ежедневно в течение пяти дней 80 мг/кг массы тела тамоксифена, чтобы индуцировать экспрессию tdTomato. Через три дня после последней инъекции был начат перелом бедренной кости, и мышей приносили в жертву при 7 или 14 dpf, чтобы отслеживать, где Prx1-экспрессирующие клетки и их потомство (Prx1+) расположены в мозоли перелома и расширенной надкостнице. Шкала бара = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Пример нерегулярного заживления из-за хирургических проблем. Концы переломов не были выровнены должным образом, и стабилизирующий штифт проткнули проксимальный отдел бедренной кости в этом примере. Эти ошибки привели к образованию мозоли там, где бедренная кость была проколота (желтый ящик), а не в месте разреза. Шкала бара = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Состав растворов, необходимых для гистологии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Авторы не имеют каких-либо конфликтов интересов для раскрытия.