Кокультура эпителиальных органоидов тонкой кишки мышей с врожденными лимфоидными клетками

Связь между кишечным эпителием и кишечно-резидентной иммунной системой занимает центральное место в поддержании кишечного гомеостаза¹. Нарушения этих взаимодействий связаны как с местными, так и с системными заболеваниями, включая воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) и рак желудочно-кишечного тракта². Примечательным примером одного недавно описанного критического регулятора гомеостаза является исследование врожденных лимфоидных клеток (ILC), которые стали ключевыми игроками в кишечном иммунном ландшафте³. ILC представляют собой группу гетерогенных врожденных иммунных клеток, которые регулируют гомеостаз кишечника и организуют воспаление в основном через цитокин-опосредованную сигнализацию⁴.

Мышиные ILC широко делятся на подтипы на основе транскрипционного фактора, рецептора и профилей экспрессии цитокинов⁵. ILC типа-1, которые включают цитотоксические естественные киллерные (NK) клетки и хелпероподобные ILC типа 1 (ILC1s), определяются экспрессией транскрипционного фактора (эомезодермина) Эомса и белка Т-бокса, экспрессируемого в Т-клетках (T-bet)⁶, соответственно, и секретируют цитокины, связанные с иммунитетом Т-хелпера типа 1 (T_H1): интерферон-γ (IFNγ) и фактор некроза опухоли (TNF), в ответ на интерлейкин (IL)-12, Ил-15 и Ил-18⁷. Во время гомеостаза тканевые резиденты ILC1 секретируют трансформирующий фактор роста β (TGF-β), чтобы стимулировать пролиферацию эпителия и ремоделирование^{матрицы 8}. ILC типа 2 (ILC2s) в первую очередь реагируют на гельминтную инфекцию через секрецию цитокинов, ассоциированных с T-хелпером типа 2 (T_H2): IL-4, IL-5 и IL-13, и характеризуются экспрессией ретиноевой кислоты, связанной с орфанным рецептором (ROR) α (ROR-α)⁹ и GATA-связывающим белком 3 (GATA-3)10,11,12 . У мышей кишечные «воспалительные» ILC2 дополнительно характеризуются экспрессией лектин-подобного рецептора клеток-киллеров (подсемейство G-член 1, KLRG)¹³, где они реагируют на эпителиальный пучко-клеточный IL-25^14,15. Наконец, ILC типа 3, которые включают клетки индуктора лимфоидной ткани и хелпероподобные ILC типа 3 (ILC3s), зависят от транскрипционного фактора ROR-γt¹⁶ и группируются в группы, которые секретируют либо гранулоцитарный макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), IL-17 или IL-22 в ответ на местные сигналы IL-1β и IL-23¹⁷. Клетки-индукторы лимфоидной ткани группируются в пятнах Пейера и имеют решающее значение для развития этих вторичных лимфоидных органов во время развития¹⁸, тогда как ILC3s являются наиболее распространенным подтипом ILC во взрослой мочевой тонкой кишке lamina propria. Одна из самых ранних мышиных кишечных органоидных кокультурных систем с ILC3s была использована для того, чтобы отделить влияние цитокина IL-22 на сигнальный преобразователь и активатор транскрипции 3 (STAT-3), опосредованный лейцин-богатым повторением, содержащим рецептор, связанный с G-белком, 5 (Lgr5) ⁺ пролиферацию кишечных стволовых клеток¹⁹, мощный пример регенеративного ILC-эпителиального взаимодействия. ILC проявляют импринт-гетерогенность между органами ^20,21 и проявляют пластичность между подмножествами в ответ на поляризующие цитокины²². То, что движет этими тканеспецифическими отпечатками и различиями в пластичности, и какую роль они играют в хронических заболеваниях, таких как ВЗК²³, остаются захватывающими темами, которые могут быть решены с использованием органоидных кокультур.

Кишечные органоиды стали успешной и надежной моделью для изучения кишечного эпителия^24,25. Они генерируются культивированием эпителиальных стволовых клеток Lgr5⁺ или целых изолированных крипт, которые включают клетки Paneth в качестве эндогенного источника члена семейства Wnt 3A (Wnt3a). Эти 3D-структуры поддерживаются либо в синтетических гидрогелях²⁶, либо в биоматериалах, которые имитируют базальную lamina propria, например, термосшивающий базальный внеклеточный матрикс (TBEM), и дополнительно дополняются факторами роста, которые имитируют окружающую нишу, в первую очередь эпителиальным фактором роста (EGF), ингибитором костного морфогенетического белка (BMP) Ноггином и Lgr5-лигандом и Wnt-агонистом R-Spondin1^27. . В этих условиях органоиды сохраняют эпителиальную апико-базальную полярность и рекапитулируют крипто-ворсинчатую структуру кишечного эпителия с почковыми криптами стволовых клеток, которые терминально дифференцируются в абсорбирующие и секреторные клетки в центре органоида, которые затем сбрасываются во внутренний псевдолюмен^{аноикисом 28}. Хотя одни только кишечные органоиды были чрезвычайно выгодны в качестве редукционистских моделей развития и динамики эпителия в изоляции^29,30, они обладают огромным будущим потенциалом для понимания того, как это поведение регулируется, влияет или даже нарушается иммунным компартментом.

В следующем протоколе описан метод кокультурирования между мышиными тонкокишечными органоидами и ILC1, полученными из lamina propria, который недавно был использован для определения того, как эта популяция неожиданно уменьшает кишечные сигнатуры воспаления и вместо этого способствует увеличению эпителиальной пролиферации через TGF-β в этой системе⁸.

Все эксперименты должны быть завершены в соответствии и с соблюдением всех соответствующих нормативных и институциональных руководящих принципов для использования животных. Этическое одобрение для исследования, описанного в следующей статье и видео, было получено в соответствии и соответствии со всеми соответствующими нормативными и институциональными руководящими принципами для использования животных.

Все мыши были выбракованы путем вывиха шейки матки в соответствии со стандартной этической процедурой, проведенной обученными особями. Перед извлечением органов и тканей в качестве подтверждающих оценок смерти проводилось перерезание бедренной артерии или обезглавливание (в соответствии с имеющимся протоколом). Животные содержались в определенных условиях, свободных от патогенов (если не указано иное) в аккредитованном коммерческом подразделении и подразделении животных Королевского колледжа Лондона в соответствии с Законом Великобритании о животных (научные процедуры) 1986 года (лицензия на проект Министерства внутренних дел Великобритании (PPL: 70/7869 до сентября 2018 года; P9720273E от сентября 2018 года).

1. Создание органоидов тонкого кишечника у мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе протокола описывается генерация кишечных органоидов из тонкой кишки мышей. Крипты сначала выделяют из ткани, повторно суспендируют в TBEM, а затем инкубируют со средами, содержащими EGF, Noggin и R-Spondin (ENR). Установление органоидов тонкого кишечника мышей также было хорошо описано в других местах 24,25,27.

1. Поместите TBEM на лед для оттаивания (40 мкл/ лунка) и поместите стандартную тканевую культуру, обработанную (имеется в виду пластины с гидрофильной и отрицательно заряженной поверхностью) 24-луночную пластину в инкубатор с температурой 37 °C для предварительного нагрева.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 500 мкл TBEM оттаивают примерно через 2-4 ч; не оставляйте его при комнатной температуре.
2. Приготовьте ~4 мл или 550 мл на лунку среды ENR, добавив eGF, Noggin и R-спондин в базальную среду (таблица 1) и поместите в инкубатор при температуре 37 °C.
3. Выбраковьте 6-12-недельное животное и рассекните тонкую кишку с помощью щипцов и микродиссекционных ножниц. Поместите его в 15 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) на льду.
4. Используя желудок и белую кишку в качестве точек ориентации, выделяют нужную область тонкой кишки (двенадцатиперстную кишку, тощую кишку или подвздошную кишку). В этом протоколе подвздошная кишка изолирована.
5. Погрузите кишечник в PBS на чашку Петри^{размером 10 см2} на льду. Используя щипцы, удалите жир осторожно, но полностью, из кишечника.
6. Разрезайте ткань продольно с помощью микродиссекционных ножниц (желательно с закругленными кончиками, чтобы избежать перфорации). Удерживая кишечник погруженным в PBS, встряхните, чтобы удалить фекалии, и поддерживайте слизистую сторону вверх, чтобы отслеживать ориентацию тканей.
7. Перенесите ткань в сухую крышку чашки Петри на льду, поместив слизистую/ворсинки кишечника стороной вверх. Удерживая один конец кишечника щипцами, аккуратно соскоблите слизь с помощью углового края чистого стеклянного предметного стекла.
8. Наполните тарелку ледяным PBS и промойте ткань.
9. Предварительно покройте трубку объемом 50 мл PBS2 (PBS + 2% FCS; см. Таблицу 1) для предотвращения адгезии ткани к пластику и добавьте в эту трубку 10 мл ледяного PBS. Разрежьте кишечник на мелкие (~2 мм) сегменты и переложите их в пробирку объемом 50 мл, предварительно покрытую PBS2.
10. Используя пипетку объемом 25 мл, предварительно покрытую PBS2, пипетку сегментов вверх и вниз 5-10 раз для очистки фрагментов ткани.
11. Дайте сегментам освоиться в течение 15-30 с, удалите и выбросьте супернатант PBS и повторяйте шаги 1.10 и 1.11 до тех пор, пока раствор не станет прозрачным (примерно 3-4 раза).
12. Позвольте сегментам оседать и отбрасывать супернатант PBS. Добавить 30 мл буфера изоляции ледяного крипта (таблица 1).
13. Поместите трубки на горизонтальный ролик или коромысло при 30-60 об/мин (или мягко) в течение 30 мин при 4 °C. Не инкубируйте на более высоких скоростях, более высоких температурах или большей продолжительности, так как крипты преждевременно вытеснятся и станут одиночными клетками с более низкой жизнеспособностью и выходом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, все процедуры должны проводиться в асептической среде с использованием стерильных материалов и реагентов.
14. Дайте сегментам кишечника осесть у основания трубки объемом 50 мл. Снимите буфер изоляции крипты, не нарушая осевшие сегменты, и перенесите его в 50-литровую трубку на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если процесс изоляции крипты был слишком строгим, крипты могут быть замечены в этой фракции. Поэтому он может быть сохранен в качестве резерва, но оптимально будет выброшен в конце протокола.
15. Добавьте 20 мл ледяного PBS в сегменты кишечника. Используя пипетку объемом 25 мл, предварительно покрытую PBS2, кишечные сегменты пипетки поднимаются и опускаются в 5-8 раз.
16. Пусть сегменты осядут в течение 30 с. Предварительно покройте трубку объемом 50 мл и пипетку 25 мл PBS2. Используя эту пипетку, соберите супернатант (фракция 1) в предварительно покрытую трубку объемом 50 мл и поместите трубку на лед.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта фракция служит для смывания оставшегося буфера изоляции крипты. Однако он также служит дополнительным этапом контроля качества; если пипетка была слишком энергичной, склепы будут в изобилии в этой фракции промывки, а если она была слишком мягкой, в этой фракции будет очень мало мусора. Оптимально, фракция 1 отбрасывается в конце протокола, но она может быть использована для изготовления органоидов, если возникают проблемы с фракциями 2-4, полученными ниже.
17. Повторите шаги 1,15 и 1,16, но добавьте 10 мл ледяного PBS, а не 20 мл, и поместите супернатант в свежую трубку объемом 50 мл, предварительно покрытую PBS2 (фракция 2).
18. Повторите шаг 1.17 еще дважды, но объедините полученный супернатант с фракцией 2 (в ту же пробирку объемом 50 мл из шага 1.17) для получения фракций 2-4. Эта единственная трубка объемом 50 мл должна содержать смещенные крипты в 30 мл ледяного PBS.
19. Извлеките аликвоту объемом 50 мкл из объединенных 2-4 фракций и поместите ее на крышку. Оцените наличие эпителиальных крипт с помощью инвертированного светового микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если крипты отсутствуют, повторите шаги 1.17 и 1.18, используя больше силы во время пипетки, пока крипты не будут освобождены. Убедитесь, что крипты не были преждевременно перемещены в буфер изоляции крипты с шага 1.14 или во фракции 1 из шага 1.16.
20. Предварительно покройте сетчатый фильтр 100 мкм и трубку объемом 50 мл PBS2. Пропустите объединенные фракции крипты через это ситечко и в предварительно покрытую 50 мл трубку.
21. Открутите растянутые фракции крипты при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C.
22. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте крипты в 10 мл ледяного Advanced DMEM/F12. Переместите крипты в трубку объемом 15 мл.
23. Откручивайте крипты при 210 х г в течение 5 мин при 4 °C для удаления одиночных клеток и лимфоцитов.
24. Повторное суспендирование крипт в 1 мл ледяного Advanced DMEM/F12.
25. Извлеките аликвоту объемом 10 мкл и поместите ее на крышку. Используя инвертированный световой микроскоп, подсчитайте количество крипт, чтобы определить концентрацию крипты.
26. Рассчитайте объем, необходимый для ~400 и ~1 500 крипт. Предварительно покройте наконечник p1000 PBS2 и используйте этот наконечник для пипсирования необходимых объемов (содержащих ~ 400 и ~ 1 500 крипт) в отдельные трубки объемом 1,5 мл.
27. Раскрутите склепы при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C.
28. Удалите как можно больше супернатанта, а затем повторно суспендируйте крипты в 80 мкл TBEM, помещенного на лед (предварительно охлаждайте кончики пипеток при 4 °C, чтобы предотвратить гелеобразование матрицы, которое происходит при 12 °C).
29. Извлеките из инкубатора 24-луночную пластину, помещенную на этапе 1.1. Аккуратно пипетки 40 мкл крипт в центр колодца медленным круговым движением, чтобы сформировать плоскую, но 3D-структуру купола, или в три отдельных небольших купола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность органоидов является самой низкой в центре купола, где питательные вещества и газы проникают менее эффективно³¹; таким образом, максимизация площади поверхности, подвергаемой воздействию среды, при сохранении четких 3D-структур имеет решающее значение.
30. Повторите шаг 1.29, чтобы создать в общей сложности две скважины с плотностью ~200 крипт на скважину и еще две скважины с плотностью ~750 крипт на скважину. Непосредственно поместите пластину в инкубатор (37 °C и 5% CO₂) на 15-20 минут, заботясь о том, чтобы не нарушить вязкие, но все еще жидкие матричные купола.
31. Добавьте 550 мкл предварительно нагретой среды ENR на лунку (начиная со стадии 1.2) и инкубируйте в течение 24 ч при 37 °C и 5% CO_2. На этом этапе предлагается дополнить среду ENR 5 мкМ агониста Wnt (CHIR 99021) и ингибитором Rho киназы 5 мкМ (Y-27632) в течение первых 24 ч культуры после изоляции для повышения выхода и эффективности органоидной генерации только что выделенных из ткани крипт.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крипты должны закрываться к образованию округлых структур в течение 24 ч, а крипты должны появиться в течение 2-4 дней (рисунок 1А).
32. Замените свежей средой ENR в конце инкубации на этапе 1.31, а затем каждые ~2 дня или когда показатель рН фенола в культуральной среде становится бледно-оранжевым, но до того, как он станет желтым.

2. Поддержание органоидов тонкого кишечника мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел протокола описывает поддержание и прохождение органоидов тонкого кишечника мышей. Органоиды сначала извлекают, а затем механически разрушают с помощью изогнутого наконечника p1000. Этот процесс разрушает крупные органоиды, состоящие из многочисленных крипт, на несколько более мелких фрагментов для расширения и высвобождает мертвые клетки, которые накопились в псевдолюмене. Поддержание органоидов в тонком кишечнике мышей также было хорошо описано в других местах 24,25,27. Все процедуры должны проводиться в асептической среде с использованием стерильных материалов и реагентов. Прохождение или расширение органоидов один раз в 4-5 дней, прежде чем происходит разрыв органоидов от существенного скопления мусора в просвете органоида. Органоиды могут проходить в соотношении 1:2-1:3 в зависимости от плотности органоидов, которая оптимально составит от 100 до 200 органоидов на лунку.

1. Как и на этапах 1.1 и 1.2, разморозьте TBEM на льду (40 мкл/лунку) и получите среду ENR (550 мкл на скважину). Поместите среду и стандартную культуру тканей, обработанную 24-луночной пластиной, в инкубатор с температурой 37 °C.
2. Извлеките пластинку, содержащую органоиды, из инкубатора. Выбросьте носитель из колодца, который нужно пройти.
3. Добавьте в скважину 500 мкл ледяного Advanced DMEM/F12. Используя наконечник p1000 (предварительно покрытый средой, чтобы избежать прилипания органоида к внутренней части кончика), извлеките органоиды в трубку объемом 15 мл.
4. Промыть дно скважины 250-300 мкл ледяного Advanced DMEM/F12, гарантируя, что в скважине не останется органоидов, и поместить в трубку объемом 15 мл, содержащую извлеченные органоиды из шага 2.3. Повторите шаги 2.3 и 2.4 при прохождении нескольких скважин и объединении органоидов из нескольких скважин в одну и ту же трубу объемом 15 мл.
5. Отращивание органоидов при 300 х г в течение 3 мин при 4 °C.
6. При центрифугировании убедитесь, что есть четыре видимые фракции: базовая фракция со здоровыми органоидами, центральная и прозрачная матричная фракция, матричная фракция, содержащая одиночные и мертвые клетки, и верхний надводный слой, содержащий одиночные и мертвые клетки. Удалите супернатант, фракцию мусора и как можно больше прозрачного фрагмента матрицы, не нарушая гранулы органоидов.
7. Аккуратно согните наконечник наконечника пипетки p1000 (примерно 2-5 мм). Предварительно покройте этот наконечник в PBS2 или Advanced DMEM/F12. Используя этот наконечник, пипетка органоидов вверх и вниз 10-20 раз, чтобы механически нарушить органоиды и оставшийся матрикс.
8. Открутите при 210 х г в течение 3 мин при 4 °C.
9. Как и на этапе 2.6, удалите супернатант, фракцию мусора и как можно больше прозрачного фрагмента матрицы, не нарушая гранулы диссоциированных крипт. Если здоровые крипты или мелкие органоиды не образовали прозрачную гранулу, центрифугируют снова при 300 х г в течение 3 мин при 4 °C.
10. Рассчитайте необходимый объем TBEM (80-120 мкл на лунку извлеченных органоидов в зависимости от того, используется ли соотношение прохождения 1:2 или 1:3).
11. Повторно суспендировать гранулу в расчетном объеме TBEM и приложить 40 мкл на скважину к предварительно нагретой 24-луночной плите для формирования купола. Непосредственно поместите пластину в инкубатор (37 °C; 5% CO₂) на 15-20 мин.
12. Добавьте 550 мкл среды ENR на лунку и инкубируйте при 37 °C и 5% CO₂. Проверьте культуры на органоидное образование через 24 ч_. Заменяйте на свежий носитель ENR каждые 2-3 дня после прохождения.

3. Выделение тонкокишечных lamina propria врожденных лимфоидных клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе протокола описывается выделение ILC1 из мышиной тонкой кишки lamina propria мышей-репортеров RORγt^GFP. Это включает в себя удаление эпителиальных клеток, переваривание тканей, разделение лимфоцитов с градиентом плотности и выделение ILC1 с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS). Изоляция FACS в соответствии со стратегией гастинга , показанной на рисунке 2 , требует установки внеклеточного окрашивания (Таблица 4) с дополнительными элементами управления окрашиванием, описанными в Таблице 2 и Таблице 3 для машины (Таблица 2) и затвора (Таблица 3). Репортерные мыши RORγt^GFP используются для изоляции живого, чистого ILC1 и выхода RORγt^GFP+ ILC3. Обработка тканей для выделения лимфоцитов lamina propria также была хорошо описана в другом месте³².

1. Обработка тканей
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань из отдельных биологических реплик животных хранится отдельно в этом протоколе. Эти образцы должны быть надлежащим образом маркированы и храниться на льду, когда это возможно. Всем реагентам, кроме ферментов пищеварения, следует дать достичь комнатной температуры, чтобы обеспечить быстрое переваривание тканей.
   1. Поместите TBEM на лед для оттаивания (40 мкл/лунка). Держите стандартную тканевую культуру, обработанную 24-луночной пластиной, в инкубаторе с температурой 37 °C до предварительного нагрева.
   2. Готовят свежий буфер удаления эпителия и буфер пищеварения (см. табл. 1). Готовят изотонную среду градиента низкой вязкости плотности (LVDGM) (90% LVDGM и 10% 10x PBS), 40% изотоническую LVDGM и 80% изотоническую LVDGM в нейтрализующем буфере (таблица 1).
   3. Выбраковьте 6-12-недельное животное, рассекните тонкую кишку с помощью щипцов и микродиссекционных ножниц и поместите кишечник в 15 мл PBS на льду.
   4. Погрузите кишечник в PBS на чашку Петри размером 10^см2 на льду и используйте щипцы, чтобы мягко, но полностью удалить жир из кишечника.
   5. Удалите пластыри Пейера (~5-10; проходят по линии, противоположной линии жировой ткани) с помощью микродиссекционных ножниц для истощения индукторных клеток лимфоидной ткани и В-клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пятна Пейера отсутствуют у Rag^-/- и других животных, истощенных линией. В отличие от пузырьков воздуха, пятна Пейера останутся на месте, если их подтолкнуть.
   6. Разрезайте ткань продольно с помощью микродиссекционных ножниц (желательно с закругленными кончиками, чтобы избежать перфорации). Удерживая кишечник погруженным в PBS, встряхните, чтобы удалить фекалии.
   7. Разрежьте ткань на кусочки длиной 2-4 см и переложите их в тюбик объемом 50 мл.
   8. Добавьте примерно 20-40 мл ледяного PBS и энергично встряхивайте в течение 5-15 с, чтобы удалить слизь и мусор.
   9. Выбросьте содержимое трубки на свежую чашку Петри и замените кишечные фрагменты в ту же трубку объемом 50 мл с помощью щипцов.
   10. Повторите шаги 3.1.8 и 3.1.9 3-4 раза или до тех пор, пока PBS не станет ясным.
2. Удаление эпителия
   1. Поместите фрагменты кишечника в свежую чашку Петри на льду. С помощью щипцов подберите сегменты кишечника и удалите лишнюю жидкость, постукивая по сухой поверхности.
   2. Разрежьте ткань на ~0,75-1 см кусочки и переложите их в свежий тюбик объемом 50 мл. Добавьте 5-7 мл буфера эпителиального удаления (таблица 1). Вихрь трубки и убедитесь, что все сегменты кишечника погружены в буфер.
   3. Инкубировать образцы при 37 °C с раскачиванием (100-150 об/мин) в течение 12-15 мин. Вихрь трубки в течение 20-30 с.
   4. Повторите шаги 3.2.1-3.2.3 еще раз, отбросив мутный супернатант (фракция содержит эпителиальные и внутриэпителиальные клетки) и заменив его свежим буфером эпителиального удаления.
3. Переваривание тканей
   1. Нанесите содержимое на свежую чашку Петри. Используя щипцы, подберите сегменты кишечника и постучите по сухой поверхности, чтобы отбросить лишнюю жидкость. Поместите сегменты в свежую чашку Петри на льду.
   2. Сгруппируйте сегменты в центр чашки Петри в плотную массу. Используя два скальпеля или острые ножницы, мелко измельчите ткань, пока она не достигнет вязкой консистенции, которая может пройти через кончик пипетки p1000.
   3. С помощью пинцета поместите измельченную ткань в чистую пробирку объемом 50 мл. Промыть чашку Петри 1-2 мл буфера пищеварения (таблица 1), чтобы собрать оставшуюся ткань и объединить ее в пробирку объемом 50 мл с измельченной тканью.
   4. Добавьте 5-7 мл буфера пищеварения в измельченную ткань и убедитесь, что вся ткань собрана на дне трубки.
   5. Инкубируйте образцы при 37 °C, со средним раскачиванием (~100-150 об/мин) в течение 15 мин. Вращайте трубку в течение 20-30 с каждые 5 минут, чтобы помочь пищеварению.
   6. Пока образцы инкубируются, поместите клеточный ситечко 40 мкм поверх свежей пробирки объемом 50 мл для каждого образца. Покрыть фильтры 1-2 мл нейтрализующего буфера (табл. 1).
   7. Вихрь образцов в течение 20-30 с после окончания инкубации.
   8. Отфильтруйте частично переваренную ткань через фильтр с покрытием 40 мкм в трубку объемом 50 мл, содержащую нейтрализующий буфер.
   9. Используйте пинцет, чтобы собрать непереваренную ткань из фильтра 40 мкм и поместить ее обратно в трубку объемом 50 мл, в которой было выполнено пищеварение, для второго раунда пищеварения. Удалите фильтры и промойте их буфером пищеварения, чтобы вытеснить любую непереваренную ткань, прилипшую к фильтру.
   10. После того, как из фильтра было удалено как можно больше непереваренной ткани и помещено обратно в трубку объемом 50 мл, в которой осуществлялось пищеварение, промойте фильтр нейтрализующим буфером 1-2 мл над трубкой объемом 50 мл, содержащей фильтрованный супернатант.
   11. Добавьте 20-25 мл нейтрализующего буфера к фильтрованному супернатанту и поместите его на лед для поддержания жизнеспособности изолированных клеток во время второго раунда переваривания тканей.
   12. Добавьте еще 5-10 мл буфера пищеварения в непереваренную ткань и повторите шаги 3.3.5-3.3.10, обеспечив фильтрацию переваренной ткани в ту же пробирку, которая используется на этапе 3.3.8 (тот же фильтр также может быть использован повторно). Промойте фильтр нейтрализующим буфером до тех пор, пока не будет достигнута линия 50 мл, а затем выбросьте все оставшиеся непереваренные ткани.
4. Выделение лимфоцитов по градиенту плотности
   1. Вращайте собранные супернатанты для каждой биологической реплики при 500 х г в течение 10 мин.
   2. На этапе 3.4.1 добавьте 5 мл 80% изотонического LVDGM в пробирку объемом 15 мл для каждой биологической реплики.
   3. После центрифугирования выбросьте супернатант из отфильтрованной, переваренной ткани. Повторно суспендируйте гранулу в 10 мл 40% изотонического LVDGM, гарантируя, что гранула хорошо гомогенизирована, и не останется больших кусков.
   4. Установка пипетки помогает на самую медленную установку, наклоните трубку объемом 15 мл, содержащую 80% изотонической LVDGM, и очень осторожно наложите 10 мл клеточной суспензии в 40% изотонической LVDGM, гарантируя, что клеточная суспензия не смешивается с 80% фракцией.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если фракции когда-либо случайно смешиваются, быстро распределите лимфоциты, которые достигли 80% фракции, между двумя трубками по 50 мл, заполненными PBS, и центрифугой в течение 10 мин при 500 х г. Затем отбросьте супернатант и повторите шаги 3.4.3-3.4.4.
   5. Вращайте трубки при 900 x g и 20 °C, при этом ускорение и снижение ускорения устанавливаются на самую низкую настройку, чтобы гарантировать, что фракции не нарушаются. Центрифуга в течение 20 мин (не включая время перерыва).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, начиная с этого этапа, должны проводиться в асептической культуральной вытяжке с использованием стерильных материалов и реагентов.
   6. Предварительно покройте пробирку объемом 50 мл для каждого образца PBS2 и добавьте 45 мл ледяного PBS.
   7. После центрифугирования аккуратно удалите верхний слой мусора из трубки объемом 15 мл. Покройте наконечник p1000 PBS2 и используйте его для сбора насыщенной лимфоцитами интерфазы между градиентами 40%-80% в трубку объемом 50 мл, содержащую 45 мл ледяного PBS.
   8. Раскрутите пробирки при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C.
   9. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл буфера FACS (PBS, 2% FCS, 0,5 мМ ЭДТА и 10 мМ HEPES; см. Таблицу 1). Предварительно покройте фильтр 40 мкм буфером FACS и используйте его для фильтрации клеточной суспензии в проточную трубку. Промыть трубку объемом 50 мл дополнительным буфером FACS объемом 500 мкл и фильтровать в ту же проточную трубку.
   10. Удалите 10 мкл аликвоты из полученного 1 мл клеточной суспензии. Подсчитайте выход лимфоцитов с помощью счетчика клеток или гемоцитометра и рассчитайте концентрацию клеток для каждого образца.
5. Пробоподготовка к сортировке - внеклеточное окрашивание
   ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела, используемые в внеклеточном окрашивании mastermix, а также реагенты для приготовления фиксируемого красителя жизнеспособности и раствора Блока Fc, используются в концентрациях, достаточных для 5 х 10⁶ ячеек на 100 мкл. Объемы должны быть соответствующим образом отрегулированы. Для машинной компенсации FACS для сортировки ILC1 требуются одноцветные элементы управления для каждого из флуорофоров во внеклеточном мастермиксе окрашивания. Для антител могут быть использованы компенсационные шарики, которые содержат положительную популяцию бусин, связывающих антитела, и популяцию несвязывающихся бусин с отрицательным антителом. Для ультрафиолетового (УФ) поправимого жизнеспособности красителя одноцветного контроля могут использоваться компенсационные шарики, содержащие амино-реактивные (для положительного сигнала) и нереактивные (для отрицательного сигнала) популяции. Не рекомендуется использовать клетки из RORγt^GFPрепортерные мыши для УФ-поправимой жизнеспособности красителя одноцветного контроля, так как эти клетки будут содержать GFP⁺ сигнал.
   1. Извлеките небольшую аликвоту ~10 мкл из каждого образца и объедините ее в отдельную проточную трубку, содержащую 250 мкл буфера FACS. Поместите трубку на лед. Это будет использоваться для незапятнанного контроля.
   2. Добавьте 1 мл PBS к оставшемуся объему в пробирках. Центрифуга при 300-400 х г в течение 3-5 мин.
   3. Приготовьте 200 мкл УФ-фиксируемого раствора красителя для жизнеспособности на образец. Разбавляйте УФ-фиксируемый краситель жизнеспособности (повторно суспендированный в DMSO в соответствии с инструкциями производителя) 1:500 в PBS (или следуя инструкциям производителя).
   4. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте образцы в 200 мкл УФ-фиксируемого раствора для жизнеспособности. Вихрьте трубки и высиживайте в темноте при 4 °C в течение 10-15 мин.
   5. Добавьте 2 мл буфера FACS в трубки, чтобы погасить УФ-фиксируемый краситель жизнеспособности, вихрь в течение 10 с и центрифугировать трубки при 300-400 х г в течение 3-5 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант из центрифугированных трубок.
   6. Приготовьте 200 мкл раствора блока Fc на образец (0,25 мг/мл блока Fc в буфере FACS).
   7. Добавляют 200 мкл раствора блока Fc к каждому из образцов со стадии 3.5.5, вихрь в течение 10 с и инкубируют в темноте при 4 °C в течение 10 мин.
   8. Добавьте 500 мкл буфера FACS в трубку со свежим потоком. Извлеките 2-5 мкл аликвоты из каждого образца и объедините ее в трубку для флуоресцентного минус один (FMO) контроля.
   9. Вращайте трубку FMO в течение 10 с и равномерно распределяйте (100 мкл на трубку) в трубки со свежим потоком, помеченные для каждого из элементов управления FMO (коктейль Lineage FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO и NK1.1 FMO; см. Таблицу 3). Добавьте все антитела, кроме интересующего антитела к каждой трубке (как описано в таблице 3) и вихря в течение 10 с. Поместите элементы управления FMO в сторону в темноте при температуре 4 °C.
   10. Центрифугирование образцов (не FMO контролирует) при 300-400 х г в течение 3-5 мин при 4 °C.
   11. Готовят внеклеточный окрашивающий мастермикс (200 мкл на образец) с окончательным разведением антител, как описано в таблице 4. Отрегулируйте объем окрашивания для соответствующей концентрации клеток (до 5 х 10⁶ клеток на 100 мкл) в зависимости от количества клеток на этапе 3.4.10.
   12. Добавьте к образцам внеклеточный мастермикс окрашивания, вихрь в течение 10 с и поместите их в сторону в темноте при 4 °C.
   13. Подготовьте свежий одноцветный контроль для каждого антитела, предназначенного для использования в стратегии гатинга (рисунок 2). Вихревые антитела компенсируют шарики в течение 20 с, добавляют 1 каплю шариков в проточную трубку, окрашивают 0,5 мкл антитела (как показано в таблице 2 или следуя инструкциям производителя) и вихрь в течение 10 с.
   14. Подготовьте УФ-поправляемый краситель для одноцветного контроля жизнеспособности с помощью набора шариков для компенсации амино-реактивной компенсации. Вихревые аминореактивные компенсационные шарики в течение 20 с добавляют 1 мкл живого/мертвого УФ-красителя (как показано в таблице 2 или в соответствии с инструкциями производителя) и вихрь в течение 10 с.
   15. Инкубируйте образцы, GMO и одноцветные элементы управления в темноте в течение 30 минут при 4 °C.
   16. За это время подготовьте трубки для сбора отсортированных клеток. Добавьте 400-500 мкл 10% FBS в пробирках Advanced DMEM/F12 до 1,5 мл для каждого образца.
   17. После инкубации добавьте 2 мл PBS2 к каждому из образцов, элементов управления FMO и элементов управления одним цветом.
   18. Центрифугирование образцов, элементов управления FMO и одноцветных элементов управления при 300-400 х г в течение 3-5 мин при 4 °C.
   19. Выбросьте супернатант из всех центрифугированных трубок. Повторное суспендирование образцов и элементов управления FMO в буфере FACS 250 мкл и вихре в течение 10 с.
   20. Повторное суспендирование одноцветных элементов управления в 250 мкл PBS2. Добавьте 1 каплю аминных нереактивных шариков к УФ-поправимому красителю жизнеспособности только одноцветного контроля. Вихрь всех органов управления в течение 10 с.
   21. Теперь ячейки готовы к сортировке. Храните образцы, элементы управления FMO и одноцветные элементы управления на льду в темноте, когда это возможно, чтобы повысить жизнеспособность клеток и предотвратить потерю сигнала от фотоотбеливания.

4. Кокультура органоидов тонкого кишечника с врожденными лимфоидными клетками

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается совместная культивирование отсортированного тонкокишечного кишечника ILC1 (выделенного в соответствии с протоколом в разделе 3) с мышиными тонкокишечными органоидами (описанными в разделах 1 и 2). Органоиды следует оптимально использовать через 1-2 дня после прохождения. Кокультура включает в себя извлечение органоидов, добавление соответствующего количества ILC1, центрифугирование к гранулированным органоидам и ILC1 вместе и повторное использование в TBEM. Завершите этот раздел как можно скорее после изоляции ILC1. Все процедуры должны проводиться в асептической среде с использованием стерильных материалов и реагентов.

1. Убедитесь, что TBEM из шага 3.1.1 был разморожен.
2. Извлеките 1-2-дневные органоиды, как описано в шагах 2.3 и 2.4.
3. Повторно суспендировать органоидную гранулу в 1 мл холодного ледяного Advanced DMEM/F12. Не сгибайте наконечник p1000, как это делается при прохождении органоидов, так как цель здесь состоит в том, чтобы сохранить органоидную структуру для совместной культуры. При необходимости поместите органоиды в отдельные трубки PBS2, покрытые 1,5 мл, на льду на короткий период для распределения между различными условиями кокультуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Начинать подготовку органоидов можно только после того, как образцы ILC будут готовы к совместному культивированию; работать на льду и быстро, как только органоиды были извлечены, чтобы свести к минимуму гибель эпителиальных клеток.
4. Предварительно покройте одну трубку объемом 1,5 мл PBS2 на образец реплицирования ILC. Распределите ~100-200 органоидов (примерно 1 лунку из 24-луночной пластины) в каждую трубку.
5. Предварительно нанесите наконечник p1000 в PBS2 и используйте его для оценки объема ILC1 после очистки FACS (250-300 мкл + отсортированный объем). Определите концентрацию ILC1 на мл, используя количество клеток, записанных из сортировки, и определите необходимый объем.
6. Используя тот же наконечник p1000, покрытый PBS2, добавьте не менее 500 ILC1 в трубку PBS2, покрытую 1,5 мл, содержащую органоиды. Если количество ILC1, полученных от сорта, меньше 500, добавьте органоид непосредственно в трубку, содержащую исходный сорт, чтобы свести к минимуму потерю клеток от переноса.
7. Откручивайте ILC1 и органоиды при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C. Если возможно, избегайте настольных центрифуг малого диаметра, так как они будут объединять ячейки вдоль края внутренней части трубки, а не создавать гранулу на кончике трубки. Поскольку количество клеток очень низкое, крайне важно свести к минимуму потерю клеток во время этих этапов.
8. Медленно и осторожно удалите как можно больше супернатанта, не нарушая гранулу (которая может быть не видна на глаз, особенно в неорганоидных контрольных группах без ILC). Поместите образец на лед.
9. Повторно суспендировать холодную гранулу в 30 мкл на лунку TBEM. Удерживая трубку на холодной поверхности (например, небольшой ящик со льдом, помещенный в вытяжку для культивирования тканей), смешайте органоиды и ILC не менее 10-15 раз, чтобы обеспечить равномерное распределение. Тритурируйте часто, но осторожно, чтобы избежать повреждения органоидов и образования пузырьков.
10. Нанесите 30 мкл на лунку ILC-органоидов в TBEM на предварительно нагретую 24- или 48-луночную пластину, чтобы сформировать один купол. Непосредственно поместите пластину в инкубатор (37 °C и 5% CO₂) на 10-20 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется настроить контроль только для ILC и органоидов для последующего анализа. ILC1 встречаются редко, но ^GFP-ILC2 может быть заменен иммунофлуоресценцией или контролем проточной цитометрии FSC / SSC, где это научно целесообразно.
11. Добавьте 550 мкл (на лунку) полной среды ILC1 (ENR + IL-2 + IL-7 + IL-15 + 2-меркаптоэтанол; см. Таблицу 1) с любыми желаемыми экспериментальными цитокинами или блокирующими антителами и инкубируйте при 37 °C и 5% CO₂ в течение 24 ч.
12. Через 24 ч аккуратно извлеките пластину из инкубатора и дайте пластине посидеть в вытяжке для культивирования тканей в течение 1 мин, чтобы убедиться, что лимфоциты оседают.
13. Удалите 200-250 мкл среды и поместите ее в пустой колодец из 24-луночной пластины. Проверьте этот супернатант с помощью инвертированного микроскопа, чтобы убедиться, что лимфоциты не были удалены.
    1. Если супернатант прозрачный, добавьте 300 мкл свежей среды ILC1 к совместной культуре в исходной лунке. Если в супернатанте присутствуют лимфоциты, центрифугируют при 300-400 х г в течение 3-5 мин при 4 °С и повторно суспендируют в 300 мкл свежей среды ILC1 и добавляют к оставшимся 200-250 мкл среды в исходной лунке. Обеспечьте пополнение носителей каждые 1-2 дня или когда медиа становятся бледно-оранжевыми/желтыми.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте, чтобы среда испарялась настолько, что кончик матричного купола разбивает поверхность среды. Всегда следите за тем, чтобы матрица была полностью погружена в воду. Избыточного испарения можно избежать, используя центральные колодцы в тканевых культуральных пластинах и добавляя ~ 600 мкл PBS в окружающие скважины. Кокультуры со взрослыми ILC стабильны в течение 1-4 дней, после чего органоиды, которые были посеяны без серьезных нарушений, будут разрываться и пересеиваться как новые крипты. При анализе эпителия рекомендуется проводить анализ культур в течение 1-4 дней после создания сокультур.
    2. Выполнение последующего анализа с использованием иммунофлуоресценции, проточной цитометрии или очистки FACS целевых популяций в буфер лизиса для анализа экспрессии генов с помощью одноклеточной или объемной РНК-seq или RT-qPCR, как описано в ссылке⁸.

При успешном завершении свежеизолированные крипты должны образовать почковые криптовые структуры в течение 2-4 дней (рисунок 1А). Здоровые и крепкие органоидные культуры должны активно расти и могут проходить и расширяться, как подробно описано в протоколе.

Этот протокол описывает выделение ILC1 тонкой кишки из мышиной трансгенной репортерной линии RORγtGFP , что позволяет выделять живой ILC1 FACS (рисунок 2). Используя протокол, описанный здесь, ожидаемый диапазон подсчета ILC1 составляет 350-3 500 изолированных клеток.

После посева органоидами кокультуры могут быть визуализированы иммуноцитохимией (рисунок 3А-В). ILC и эпителиальные клетки также могут быть проанализированы с помощью проточной цитометрии, как показано на рисунке 3C. ILC1 повышает регуляцию эпителиального CD44, что характеризуется проточной цитометрией (рисунок 4A-B) и иммуноцитохимией (рисунок 4C). В частности, ILC1 индуцирует экспрессию варианта сращивания CD44 v6 в органоидах, как показано в RT-qPCR (рисунок 4D).

Таблица 1: Композиции носителей и буферов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Одноцветные элементы управления. Композиция одноцветных элементов управления для выделения тонкой кишки lamina propria ILC1 с использованием стратегии гатирования, определенной на рисунке 2. Подробную информацию об используемых антителах можно найти в Таблице материалов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 3: Флуоресценция минус один (FMO) супермиксы. Состав мастермиксов FMO для коктейля Lineage FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO и NK1.1 FMO. Мастермиксы FMO содержат все используемые антитела, за исключением интересующего антитела, и используются для окрашивания образца аликвоты. Линейный коктейль определяется как CD19, CD3e, CD5, Ly-6G/Ly-6C. Подробную информацию об используемых антителах можно найти в Таблице материалов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 4: Внеклеточное окрашивание мастермикса. Концентрации регулируют для окрашивания до 5 х 106 клеток в 200 мкл буфера FACS. Подробную информацию об используемых антителах можно найти в Таблице материалов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Рисунок 1: Мышиные тонкокишечные органоиды кишечника. Репрезентативное изображение (А) успешно генерируется тонкокишечными органоидами через 2-3 дня после прохождения и (В) неудачной культивированием. Шкала: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Стратегия выделения ILC1s из тонкой кишки lamina propria трансгенных мышей-репортеров RORγtGFP . Репрезентативный цитометрический график выделения ILC1 из тонкой кишки lamina propria трансгенных мышей-репортеров RORγtGFP facS. ILC1 определяются как live, CD45+, Lin- (CD3, CD5, CD19, Ly6C), CD127+, KLRG1-, RORγt-, NKp46+ и NK1.1+. Представитель от N = >50 мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Совместные культуры Organoid и ILC1. Изображения яркого поля (A), изображения конфокальной микроскопии (B) и графики FACS (C) тонкокишечных органоидов (SIO), культивируемых отдельно (вверху) или с ILC1s (внизу) (репрезентативные эксперименты с ILC1s у N = 3 мышей). (B) Окрашивание CD45 иллюстрирует ILC1s и Zonula occludens белок 1 (ZO-1) отмечает эпителиальные клетки в органоидах. Шкала: 50 мкм. (C) Ранее закрыта на одиночных живых клетках. Молекула эпителиальной клеточной адгезии (EpCAM) отмечает эпителиальные клетки кишечника (IEC) в органоидах, а CD45 маркирует ILC1s. Рисунок взят из ссылки8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: ILC1s в кокультуре с тонкокишечными органоидами стимулирует регуляцию CD44 в эпителиальных клетках кишечника. (A) Репрезентативный цитометрический график экспрессии CD44 в эпителиальной клеточной адгезионной молекуле (EpCAM) положительных эпителиальных клеток (живых, CD45-, EpCAM+) из тонкокишечных органоидов (SIO), культивируемых отдельно (слева) или с ILC1s в течение 4 дней (справа). (B) Количественная оценка потока экспрессии CD44 в эпителиальных клетках кишечника (IEC) (ILC1s от N = 5 мышей). (C) Репрезентативное конфокальное микроскопическое изображение локализации CD44 только в d4 SIO (слева) или совместно культивируемое с ILC1s (справа) (представитель N = 3 мышей). Шкала: 50 мкм. (D) RT-qPCR с экзонно-специфическими праймерами для вариантов сращивания CD44 v4 и v6 (N = 3). Эта цифра взята из ссылки8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

У авторов нет конфликта интересов.