A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
В этой работе используется подход восстановления in vitro для изучения пороэластичности гелей актомиозина в контролируемых условиях. Количественно определена динамика геля актомиозина и встроенного растворителя, с помощью которой продемонстрирована сетчатая пороупругость. Мы также обсуждаем экспериментальные проблемы, распространенные ошибки и отношение к механике клеточного цитоскелета.
Клетки могут активно менять свою форму и становиться подвижными, что зависит от их способности активно реорганизовывать свою внутреннюю структуру. Эта особенность объясняется механическими и динамическими свойствами клеточного цитоскелета, в частности, цитоскелета актомиозина, который представляет собой активный гель полярных актиновых филаментов, миозиновых моторов и вспомогательных белков, которые проявляют внутренние свойства сокращения. Общепринятая точка зрения состоит в том, что цитоскелет ведет себя как вязкоупругий материал. Однако эта модель не всегда может объяснить экспериментальные результаты, которые больше согласуются с картиной, описывающей цитоскелет как пороупругий активный материал — эластичную сеть, встроенную в цитозоль. Градиенты сократимости, генерируемые миозиновыми моторами, управляют потоком цитозоля через поры геля, что делает вывод о том, что механика цитоскелета и цитозоля тесно связана. Одной из основных особенностей пороупругости является диффузионная релаксация напряжений в сети, характеризующаяся эффективной константой диффузии, которая зависит от модуля упругости геля, пористости и вязкости цитозоля (растворителя). Поскольку клетки имеют много способов регулировать свою структуру и свойства материала, наше нынешнее понимание того, как связаны механика цитоскелета и динамика потока цитозолей, остается плохо изученным. Здесь используется подход восстановления in vitro для характеристики свойств материала пороэластичных гелей актомиозина в качестве модельной системы для клеточного цитоскелета. Сокращение геля обусловлено моторной сократимостью миозина, что приводит к возникновению потока проникающего растворителя. В статье описано, как приготовить эти гели и провести эксперименты. Мы также обсудим, как измерять и анализировать поток растворителя и сжатие геля как в локальном, так и в глобальном масштабе. Приведены различные соотношения масштабирования, используемые для количественной оценки данных. Наконец, обсуждаются экспериментальные проблемы и распространенные ошибки, в том числе их отношение к механике клеточного цитоскелета.
Живые клетки обладают уникальными механическими свойствами. Помимо способности пассивно реагировать на приложенные силы, они также способны активно генерировать силы в ответ на внешние раздражители1. Эти характеристики, которые необходимы для различных клеточных процессов, особенно во время подвижности клеток, в первую очередь объясняются механическими и динамическими свойствами клеточного цитоскелета, особенно цитоскелета актомиозина, который представляет собой активный гель полярных актиновых филаментов, молекулярных моторов миозина и вспомогательных белков. Эти актомиозиновые сети проявляют присущие им свойства самоорганизации и сокращения, обусловленные моторными белками миозина, которые сшивают актиновые филаменты и активно генерируют механические напряжения в сети, подпитываемой гидролизом АТФ2.
Были проведены многочисленные экспериментальные и теоретические исследования по изучению свойств материала цитоскелета3. Общепринятая точка зрения состоит в том, что цитоскелет ведет себя как вязкоупругий материал4. Это означает, что на коротких временных масштабах цитоскелет ведет себя как эластичный материал, а на длительных временных масштабах он ведет себя как вязкая жидкость из-за сшивающих белков и моторной отслойки миозина (и повторного прикрепления), что позволяет сети динамически вращаться. Однако во многих ситуациях вязкоупругая модель не может описать экспериментальные результаты, которые в большей степени согласуются с картиной, описывающей цитоскелет и, в более общем плане, цитоплазму клетки, описываемую как пороупругий активный материал 5,6. Эти типы материалов характеризуются двумя основными особенностями. (i) Первой основной особенностью является генерация потока проникающего цитозоля («растворителя») через поры геля за счет градиентов сократительной способности, управляемых моторами миозина, что лежит в основе таких процессов, как клеточный блеббинг7, подвижность8 и колебания формы клетки9. Возникновение таких цитозольных потоков может быть локальным, для блеббинга, или глобальным, как при подвижности клеток. В последнем случае сократительные напряжения в задней части клетки направляют поток цитозольной жидкости к передней части клетки, что пополняет белковый пул, необходимый для сборки ламеллиподий8. (ii) Вторая основная особенность заключается в том, что релаксация напряжений является диффузионной и характеризуется эффективной константой диффузии, которая зависит от модуля упругости геля, пористости геля и вязкости растворителя5. Константа пороупругой диффузии определяет, насколько быстро система реагирует на приложенное напряжение. Более высокие константы диффузии соответствуют более быстрому перераспределению напряжений. Это, в свою очередь, определяет, сколько времени требуется внутриклеточной цитозольной жидкости для перераспределения внутри клетки после приложенного механического напряжения, будь то внешнего или внутреннего, такого как активные сократительные напряжения, генерируемые миозиновыми моторами. Эти примеры, таким образом, демонстрируют, что механика цитоскелета и цитозоля тесно связана и не может рассматриваться отдельно3.
Поскольку ячейки могут регулировать свои механические свойства различными способами, взаимодействие между сетевой механикой и динамикой потока жидкости остается плохо изученным. Мощным альтернативным подходом является использование восстановленных in vitro систем, которые позволяют полностью контролировать различные микроскопические компоненты и параметры системы, что делает эти модельные системы оптимальными для физического анализа10,11. Этот подход был успешно использован для изучения влияния белкового состава и геометрии системы на актиновую подвижность 12,13,14,15,16,17,18, 2D-паттернирование актомиозиновых сетей 19,20,21,22 , а также взаимодействие между сократимостью сети и динамикой потока жидкости пороэластичных гелей актомиозина, которое находится в центре внимания данной статьи23.
В этой рукописи обсуждается получение сократительных эластичных сетей актомиозина контролируемых размеров и свойств материала на основе работы Ideses et al.23. Проанализирована и количественно определена динамика сжимающегося геля и дренированного растворителя, с помощью которой продемонстрировано, что эти гели актомиозина могут быть описаны как пороупругий активный материал. Изучение влияния вязкости растворителя на диффузию напряжений еще раз подтверждает пороупругую природу этих сетей. Приведены различные соотношения масштабирования, используемые для количественной оценки данных. Наконец, также обсуждаются экспериментальные проблемы, распространенные ошибки и актуальность экспериментальных результатов для клеточного цитоскелета.
1. Обработка и пассивация поверхности стекла:
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел включает три основных этапа (см. рис. 1): (i) очистка и гидрофилизация, (ii) силанизация и (iii) пассивация поверхности.
2. Очистка белка
3. Пробоподготовка
ПРИМЕЧАНИЕ: Полимеризуйте актиновые мономеры в присутствии больших агрегатов моторов миозина II и сильного пассивного сшивающего фасина для получения макроскопически сократительных эластичных сетей актомиозина19,23. Добавление флуоресцентных шариков в раствор позволяет отслеживать поток растворителя во время сжатия геля.
4. Проведение эксперимента
5. Методы микроскопии
Для эксперимента используются два стеклянных покровных стекла. Покровные стекла очищаются и пассивируются полимерами ПЭГ. Пассивация необходима для предотвращения прилипания солюбилизированных белков к стеклянным поверхностям на ранних экспериментальных стадиях и для минимизации взаимодействия сжимающейся сети со стеклянными стенками. Неспособность достичь хорошей пассивации может привести к неэффективному сокращению и, в крайних случаях, может даже ингибировать образование актиновой сети.
На рисунке 1 описаны три основных этапа процедуры обработки поверхности. Эти этапы включают следующее: (i) очистка поверхности и гидрофилизация с использованием раствора Piranha, который удаляет органические загрязнения с поверхностей покровного стекла и обнажает группы ОН на поверхности стекла; (ii) поверхностная силанизация (3-меркаптопропил) триметоксисиланом, целью которой является ковалентное связывание силана с поверхностью стекла, где каждая молекула силана заканчивается SH-группой; (iii) пассивация полимерами ПЭГ (mPEG-mal, 5 кДа) - на этом этапе малеимидная группа полимера ПЭГ ковалентно взаимодействует с SH-группой на (3-меркаптопропил)триметоксисилане, что приводит к образованию монослоя ПЭГ на поверхности стекла.
Для обработки и силанизации Piranha 10-12 стеклянных покровных стекол #1.5 (22 мм x 22 мм) помещают в держатель из политетрафторэтилена (рис. 2A), и этот держатель переносят в стакан объемом 400 мл. На этапе пассивации два стеклянных покровных стекла переносятся на чашку Петри с парапленочным покрытием (рис. 2B). Размещение покровных стекол на гидрофобном слое парапленки гарантирует, что гидрофильный полимерный раствор ПЭГ остается ограниченным поверхностью стекла в течение всего времени инкубации. Каждое покровное стекло инкубируют с 1 мл 4 мг·мл-1,5 кДа мПЭГ-мала в 1x PBS в течение 1 ч при 22 °C (рис. 2B). Для этой молекулярной массы и концентрации ПЭГ-полимера пассивация стекла приводит к образованию монослоя ПЭГ, где каждый ПЭГ-полимер находится в грибовидной конформации29. В конце процесса инкубации каждое покровное стекло промывают 5 мл DDW и сушат потоком N2 (газ). Если покровные стекла не используются немедленно, 1 мл 10 мМ Tris следует нанести на пегилированные поверхности, чтобы поверхности покровного стекла оставались влажными. Покровные стекла сушат потоком N2 (газ) непосредственно перед началом эксперимента. Лучше использовать покровные стекла в течение 2 часов.
Макроскопически сократительные эластичные сети актомиозина образуются путем смешивания 5 мкМ G-актина с 16,7 нМ миозином, который добавляется в виде крупных агрегатов (~ 150 димеров/агрегатов миозина) и 280 нМ сильного сшивающего фасина. Раствор включает 1 мМ АТФ, который поддерживается постоянным с помощью АТФ-регенерирующей системы и антиотбеливающего раствора (подробности см. в разделе протокола). Для анализа потока проникающего растворителя в раствор актомиозина добавляют флуоресцентные шарики.
Эксперименты проводятся в самодельном держателе для образцов, который соответствует размерам стандартного столика микроскопа (рис. 3). Смазанная прокладка из парапленки толщиной h (~ 150 мкм) помещается на одно из двух ПЭГ-пассивированных покровных стекол, и это покровное стекло помещается в держатель образца (рис. 3A). Затем раствор актомиозина готовят на льду в микроцентрифужной пробирке путем включения различных микроскопических компонентов, добавляя в последнюю очередь G-актин, агрегаты миозина, а затем EGTA, который запускает полимеризацию актина. Раствор необходимо хорошо перемешать – это задает время начала экспериментов (t = 0). Сразу же 1,1 мкл этого раствора помещают на покровное стекло (рис. 3B), поверх него помещают второе ПЭГ-пассивированное покровное стекло (рис. 3C) и завинчивают держатель, чтобы зафиксировать каплю между ними (рис. 3D). Для этого объема капли и типа спейсера диаметр капли составляет около 3000 мкм, но исследователи не должны полагаться на эти оценочные значения. Фактическая толщина и диаметр капли всегда должны измеряться непосредственно по изображениям микроскопии. Для толщины следует использовать конфокальный микроскоп.
Держатель образца помещается на микроскоп, и начинается сбор данных. Микроскоп должен быть подготовлен заранее, чтобы сократить время начала съемки до минимума. Обычно для начала визуализации образца требуется 1-2 минуты. Образцы возбуждаются при длине волны 488 нм и/или 561 нм и визуализируются с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа, управляемого специальным программным обеспечением. Изображения должны быть получены со скоростью 100 мс на кадр (или меньше) в потоковом режиме с камерой EMCCD. Для одновременного изображения актиновой сети и миозиновых моторных агрегатов или флуоресцентных шариков в растворе следует использовать систему двойного излучения. Интенсивность люминесцентной лампы должна быть как можно ниже, чтобы избежать насыщения сигнала на поздних стадиях сжатия сети.
Объектив Plan-NEOFLUAR 2,5x/0,075 используется для характеристики динамики бокового сжатия геля и направленности и скорости потока жидкости на шкале длин геля. Это изображения с низким разрешением, которые полезны для отслеживания изменений радиуса геля с течением времени, из которых можно вывести радиальную (боковую) скорость сжатия геля. Для определения структуры и пористости сети, расположения агрегатов миозиновых моторов в сети и движения отдельных флуоресцентных шариков по порам геля следует использовать объективы с более высоким увеличением (например, объектив 10x/0,3 Ph1 UPlanFL). Также можно использовать более высокие увеличения, но за счет уменьшенного поля зрения, что более важно, если используется двухцветный режим изображения. Данные (2D) флуоресцентной микроскопии должны быть дополнены конфокальной визуализацией сжимающегося геля в 3D, чтобы охарактеризовать динамику сокращения как в боковом, так и в вертикальном направлениях. Конфокальная микроскопия используется для измерения расстояния между двумя покровными стеклами - это расстояние определяет начальную толщину геля. Кроме того, толщина геля должна быть измерена в конце эксперимента, когда достигается механически стабильное состояние.
Чтобы показать, что сети актомиозина ведут себя как пороупругий материал, необходимо выполнить несколько критериев: (i) сеть не реконструируется, из чего можно сделать вывод, что она ведет себя как эластичный материал (рис. 4), (ii) поток воды (растворителя) через поры геля обусловлен сократимостью миозина (рис. 5), и (iii) релаксация упругих напряжений характеризуется эффективной константой диффузии, D ~ κ / γ, который зависит от эффективного модуля упругости геля, κ, и постоянной эффективного трения, γ, которая учитывает трение между движущимся растворителем и порами геля (рис. 6). Ниже мы обсудим каждый критерий отдельно и продемонстрируем, как они выполняются в текущей системе.
Цель (i)
Во-первых, следует проанализировать структуру и пористость геля, а также определить, является ли сеть динамически ремоделирующейся. Схематическое изображение сети актомиозина изображено на рисунке 4А. Образование сетки начинается со спонтанного зарождения и полимеризации актиновых филаментов, которые впоследствии расслаиваются (рис. 4B). Затем сеть активно самоорганизуется в макроскопически изотропную взаимосвязанную сеть актиновых пучков, которая динамически грубеет со временем и в конечном итоге сжимается. Самоорганизация и сжатие сети обусловлены миозиновыми агрегатами, которые преимущественно локализуются в точках пересечения филаментальных пучков (рис. 4C). Агрегаты миозина остаются прикрепленными к сети посредством сжатия геля, из чего можно заключить, что эти гели актомиозина ведут себя как эластичные активные материалы (рис. 4C). Кроме того, в этих гелях актомиозина сжатие регулируется скольжением нити, что выводится путем сравнения сквозных расстояний пучков нитей, l от конца до конца, и длин контуров, lcont (рис. 4D, E). Это контрастирует с сокращением свободных пучков актина, сшитых α-актинином, в которых преобладает изгиб актиновой нити29.
Пористость геля характеризуется размером пор геля, через которые движется поток растворителя. Для очищенных актиновых сетей размер ячеек, определяющий расстояние между сшивками в геле (в данном случае агрегаты миозина), также дает хорошую оценку размера пор геля. Размер ячеек может быть извлечен непосредственно из (2D) флуоресцентных изображений и оценивается по среднему геометрическому расстоянию между парами противоположных пучков актина в гелевой поре (рис. 4B). Поскольку сеть изотропна до начала сжатия, средние размеры ячеек в вертикальном (т. е. по толщине) и боковом (по радиусу) направлениях одинаковы: ξ 0, = ξ 0,ll
= ξ0 (= 67 мкм). Поскольку актиновые пучки остаются прямыми во время сокращения, размеры сетки и пор уменьшаются пропорционально изменениям толщины и диаметра геля. Для текущей экспериментальной системы плоское (радиальное) сжатие начинается после того, как вертикальное сжатие практически заканчивается (не показано), так что радиальное сжатие протекает при постоянной толщине геля, меньшей начальной толщины в ~ 0,3 раза. Следовательно, в то время как размер ячеек в плоскости сжатия, ξ ll (t) = r (t) / R, уменьшается во время радиального сжатия, где r (t) - радиус геля в момент времени t, средний размер ячейки в перпендикулярном направлении постоянен, ξ
= 20мкм 23. Эти значения размеров ячеек/пор используются для оценки модуля упругости геля κ и коэффициента трения γ, как подробно описано ниже (цель [iii], рис. 6).
Цель (ii)
Эта цель включает в себя демонстрацию того, что поток растворителя наружу генерируется сократимостью миозина. Для отслеживания потока растворителя в раствор актомиозина добавляют флуоресцентные шарики. Шарики пассивируются, чтобы уменьшить взаимодействие между движущимися шариками и сетью актомиозина. В целом, 1 мкл шариков (Таблица материалов) инкубируют с 5 мкм G-актином в течение 20 мин при комнатной температуре, а избыток G-актина удаляют центрифугированием (Таблица материалов, подробности см. в разделе протокола). Этот шаг повторяется с 10 мг · мл -1 BSA (Таблица материалов). Гранулы добавляют в белковый раствор при окончательном разведении 1:10 000 об./об. Поскольку цель состоит в том, чтобы позволить шарикам свободно перемещаться по порам геля, важно адаптировать диаметры шариков к размеру пор геля, чтобы их соотношение размеров всегда составляло <<1. Таким образом, шарики диаметром 2,300 нм используются для анализа начальной и промежуточной стадий сжатия (рис. 5A, B), когда средний размер пор превышает 15 мкм, и шарики диаметром 200 нм используются, когда размер пор меньше (рис. 5D-G). Положение центра масс шариков извлекается для каждого раза, t, (x(t),y(t))шарика, используя стандартный алгоритм отслеживания частиц (Таблица материалов), из которого можно вывести траекторию (рис. 5B) и локальную скорость 
валика. Шарики и, таким образом, проникающий растворитель движутся в среднем в радиальном направлении наружу (рис. 5A, B), в то время как гель сжимается внутрь, как показано при анализе скорости изображения частиц (PIV) (см. зеленые стрелки на рисунке 6A). Это радиальное движение может быть дополнительно развито путем извлечения радиальной скорости местных шариков, νr, которая оценивается путем проецирования локальной скорости шарика на радиальное направление, определяемое единичным вектором, соединяющим гелевый центр (x 0, 
y0) и положение центра масс шарика в момент времени t: 
где 
Данные показывают, что по мере того, как шарики движутся наружу от центра геля, их скорости сначала увеличиваются, а затем замедляются по мере приближения к границе геля (рис. 5C). Примечательно, что скорость шарика может быть в 20 раз больше, чем скорость радиального сжатия геля (синяя кривая на рисунке 5C). Заполненные круги отмечают время, когда шарики покидают гель. Шарики продолжают двигаться после выхода из границы геля в течение некоторого времени. Это движение не может быть результатом инерционных эффектов, так как число Рейнольда равно <10-4. Радиальная скорость шарика уменьшается со временем, сопутствующим уменьшению сокращения геля; Примечательно, что когда скорость радиального сжатия геля значительно снижается, скорость шариков значительно колеблется.
Чтобы проверить, являются ли эти колебания результатом пористой структуры актомиозина, сеть отслеживает движение шариков с более высоким пространственным разрешением, что возможно, когда сокращение геля значительно замедлилось (рис. 5D-F). Траектория шариков действительно извилиста (рис. 5D, E), со значительными колебаниями локальной скорости шариков, которая отражает пористую структуру геля, то есть локальная скорость самая быстрая вблизи центра пор и самая медленная в непосредственной близости от актинового пучка (рис. 5F).
Наконец, расчет корреляционной функции скорости геля и скорости растворителя показывает, что локально поток жидкости направлен противоположно сжимающемуся гелю. Используя локальные яркие пятна в геле в качестве реперных маркеров, можно рассчитать их положение центра масс для каждого момента времени, t, (x(t),y(t))gel, и можно вывести локальную скорость геля: 
. Затем для каждой бусины и ближайшей точки геля вычисляется локальная корреляция скорости шарика и пары скоростей геля для извлечения угла θ между двумя векторами: 
, где 
и — локальные скорости (величина) шарика и 
геля соответственно. Данные показывают, что независимо от положения шарика в порах геля, локально поток жидкости направлен в противоположном направлении по отношению к гелю (рис. 5G). В целом, результаты показывают, что поток жидкости наружу генерируется сократимостью миозина, как и ожидалось для пороупругого активного материала 3,7,23,30.
Цель (iii)
Эта цель заключается в демонстрации того, что релаксация напряжений характеризуется эффективной постоянной пороупругой диффузии D, которая зависит от модуля упругости сети, пористости и вязкости растворителя. Во-первых, количественно определяется латеральная (плоская) скорость сжимающегося геля (рис. 6А). Во-первых, флуоресцентные изображения бинаризируются, и гелевая проецируемая область в каждой точке времени t, A (t), извлекается. Затем вычисляется 
радиус геля (рис. 6B). Из этого выводится радиальная скорость сжатия в момент времени t,
которая описывает скорость края геля (рис. 6C). Краевая скорость показывает типичный временной профиль эволюции, характеризующийся начальной линейной фазой, в которой краевая скорость увеличивается с постоянной скоростью, до тех пор, пока максимальная скорость, ν max, 
не будет достигнута в момент времени t max. Затем скорость экспоненциально затухает с характерным временем релаксации, τ, пока не будет достигнуто механически стабильное состояние (рис. 6C). r max- радиус геля в начале этой фазы релаксации.
Для пороупругого материала время 
релаксации , где 
— эффективная константа пороупругой диффузии, κ — эффективный модуль упругого геля, а γ — эффективная константа трения, которая учитывает движение водного раствора через поры актинового геля. Модуль упругости имеет единицы энергии на единицу объема и обратно пропорционален объему элементарной ячейки в геле, определяемому расстоянием между сшивками или размером ячейки, таким образом, что 
. Коэффициент трения, γ, зависит от грани пор, перпендикулярной потоку растворителя. Для плоского сжатия геля соответствующей гранью пор является 
, и, следовательно, коэффициент 
трения , где η — вязкость растворителя31,32. В целом, мы получаем следующее соотношение: 
, где соответствующий размер 
пор в плоскости оценивается при t max. В целом мы получаем 
, из чего следует, что время релаксации должно линейно масштабироваться с вязкостью растворителя23.
Чтобы проверить, соблюдается ли это соотношение, эксперименты повторяют с различными количествами глицерина. Использование глицерина выгодно, поскольку ожидается, что он не повлияет на активность белков, особенно моторов миозина. Кроме того, корреляции между вязкостью водно-глицериновых растворов и количеством добавленного глицерина имеются в литературе28. Эти корреляции показывают, что увеличение весового процента глицерина с 0% до 34% приводит к пропорциональному увеличению вязкости водно-глицеринового раствора с η ω до 2,76 ηом, где η ω— вязкость воды при 20 °C. В этом диапазоне глицерина и при том же начальном диаметре капли, 2R = 2,800 мкм, увеличение вязкости увеличивает продолжительность фаз сетчатой полимеризации и самоорганизации, хотя линейное ускорение и максимальная радиальная скорость сжатия (νmax) совершенно не изменились. Эти данные свидетельствуют о том, что вязкость23 раствора не влияет как на реорганизацию сети (пористость), так и на активность миозина, и влияние вязкости растворителя должно быть существенно отражено во времени, необходимом для ослабления упругих напряжений. Действительно, время релаксации показывает линейную зависимость от вязкости раствора (рис. 6D), из чего следует, что соотношение масштабирования, полученное выше, соблюдается, что еще раз подтверждает пороупругую природу системы.
Рисунок 1: Схематическое описание трех основных этапов процедуры обработки поверхности покровного стекла. (i) Очистка поверхности стекла (обработка Piranha) и гидрофилизация, (ii) силанизация поверхности и (iii) пассивация с помощью mPEG-mal. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Пассивация покровного стекла. (A) Очистка и силанизация Piranha выполняются в стакане объемом 400 мл с использованием самодельного политетрафторэтиленового держателя, состоящего из 12 линейных канавок. (B) Пассивация поверхности осуществляется в чашке Петри, покрытой парапленкой. Каждое покровное стекло инкубируют с 1 мл 5 кДа мПЭГ-мала при 4 мг·мл-1 в 1x PBS (Таблица материалов) в течение 1 ч при 22 °C. Гидрофобный слой парапленки гарантирует, что гидрофильный полимерный раствор ПЭГ остается ограниченным поверхностью стекла в течение всего времени инкубации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Проведение эксперимента - самодельный держатель образца. Эксперименты проводятся в самодельном держателе для образцов, который соответствует размерам стандартного столика микроскопа. (A) Смазанная маслом парапленочная прокладка толщиной h (~150 мкм) помещается на ПЭГ-пассивированное покровное стекло, и это покровное стекло помещается в держатель образца. (B) Раствор актомиозина готовят на льду в пробирке Эппендорфа, и 1,1 мкл этого раствора помещают на покровное стекло; затем (C) поверх него помещают второе PEG-пассивированное покровное стекло, и (D) держатель образца завинчивается, чтобы ограничить каплю, которая принимает дискообразную форму. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Цель пороупругости (i). Сеть актомиозина ведет себя как эластичный материал. (А) Схематическое изображение сети актомиозина. (Б) Формирование сети актомиозина. Изображения флуоресцентной микроскопии показывают, что актиновые нити самопроизвольно зарождаются и полимеризуются в изотропную взаимосвязанную сеть, которая со временем грубеет и в конечном итоге макроскопически сжимается. Пористость сети характеризуется размером сетчатой ячейки, ξ (двойная стрелка). (С-Е) Сокращение актомиозиновой сети обусловлено скольжением пучка актиновых нитей. (C) Сжатие сети начинается на периферии геля («P») и распространяется внутрь в гелевую массу. Белые стрелки показывают направление сокращения. Гелевый центр отмечен буквой «С». Флуоресцентные изображения показывают, что моторные агрегаты миозина (561 нм, красные точки) встроены в актиновую сеть (488 нм, зеленый) и остаются прикрепленными к ней на протяжении всего сокращения сети. (D) Пучки актиновых филаментов остаются прямыми во время сжатия сети. Отношение длины контура, l продолжения, и сквозного расстояния, lот конца до конца, в зависимости от времени. е) Распределение соотношения между длиной контура и сквозным расстоянием при t = 316 с (сплошной красный) и t = 327 с (полосатый, серый). Вставка: длина контура (синий) и сквозное расстояние (белый) типичного пучка. Условия: (B, C, E [вставка]): изображения получены на инвертированном флуоресцентном микроскопе с камерой EMCCD и воздушным объективом UPlanFL 10x/0,3 Ph1 в обычном режиме (B) и в режиме двойной визуализации после наложения изображения (C, E [вставка]). Масштабные линейки: (B, C) 100 мкм и (E[вставка]) 50 мкм. Этот рисунок был воспроизведен с разрешения Ideses et al.23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Цель пороупругости (ii). Поток растворителя наружу генерируется моторной сократимостью миозина. (A) Визуализация геля при малом увеличении на промежуточных стадиях сокращения: одновременная флуоресцентная визуализация сжимающейся актиновой сети (488 нм, слева) и флуоресцентных шариков 2,300 нм, добавленных к раствору (561 нм, справа) в зависимости от времени. Круги отмечают положение четырех бусин. Стрелки отмечают глобальное направление движения бусины. (B) Изображены траектории девяти выбранных бусин. Стрелки отмечают глобальное радиальное направление движения бусин. Обведенный крест обозначает центр геля (x0, y0) (C) Локальная радиальная скорость шарика νr (открытые круги) и (радиальная) скорость края геля (синие точки) в зависимости от времени. Заполненные круги указывают время, в течение которого данная бусина выходит за границу геля. (Д-Ж) Разрешение пористости сетки и движения растворителя по порам геля на поздних стадиях сжатия. (D) Эпифлуоресцентные изображения сжимающегося геля и флуоресцентных шариков диаметром 200 нм, добавленных в раствор. И актин, и бусины возбуждаются на длине волны 488 нм. Красные круги повторяют положение бусины со временем. Серая линия обозначает границу геля. (E) Траектория движения бусины, показанная в пункте (D). В показанном поле гель сокращается в среднем к дну. Координаты измеряются относительно начала координат камеры. (F) Локальная скорость шарика отражает пористую структуру геля. Вверху: локальная скорость шарика (открытые круги), локальная скорость геля (серые круги) и скорость края геля (синие круги) в зависимости от времени. Внизу: снимки показывают положение бусины в выбранное время. Бусина отмечена красным кругом. Пунктирной линией отмечено время выхода шарика из геля. (G) Распределение углов между локальными скоростями геля и местных шариков. Условия: Изображения получены на инвертированном флуоресцентном микроскопе с камерой EMCCD и (A) объективом Plan-NEOFLUAR 2,5x/0,075 и (D,F) объективом 10x/0,3 Ph1 UPlanFL. Масштабные линейки: (A) 400 мкм, (D) 100 мкм, (F) и 50 мкм. Этот рисунок был воспроизведен с разрешения Ideses et al.23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Цель пороупругости (iii). Релаксация напряжений характеризуется эффективной постоянной пороупругой диффузии. (A) Флуоресцентные изображения сжимающегося геля актомиозина сверху при малом увеличении от времени смешивания до стационарного состояния. Поле скоростей (зеленые стрелки) извлекается из анализа PIV. Изображения получены на инвертированном флуоресцентном микроскопе с камерой EMCCD и объективом 2,5x/0,075 Plan-NEOFLUAR. Длина волны возбуждения составляет 488 нм (актин). Масштабная линейка составляет 500 мкм. (B) радиус геля и (C) радиальная скорость сжатия (т. е. скорость края геля в зависимости от времени). a обозначает ускорение, vmax обозначает максимальную скорость 
, а τ — характерное время релаксации. (D) Сети актомиозина ведут себя как пороупругий активный материал. 
и вязкость растворителя, η, по сравнению с массовым процентом глицерина (мас.%). Количества нормализуются до их значений при 0 мас.% глицерина. Начальный радиус геля составляет R = 1,400 мкм. Полосы погрешности представляют собой стандартные отклонения экспериментальных значений. Этот рисунок был воспроизведен с разрешения Ideses et al.23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Авторам раскрывать нечего.
В этой работе используется подход восстановления in vitro для изучения пороэластичности гелей актомиозина в контролируемых условиях. Количественно определена динамика геля актомиозина и встроенного растворителя, с помощью которой продемонстрирована сетчатая пороупругость. Мы также обсуждаем экспериментальные проблемы, распространенные ошибки и отношение к механике клеточного цитоскелета.
Благодарим Дину Аранович за очистку и маркировку белка. Г.Л. благодарен Министерству науки, технологий и космоса Израиля за стипендию доктора философии им. Жаботинского. A.B.G. благодарен Израильскому научному фонду (грант 2101/20) и Министерству науки и технологий Государства Израиль (грант 3-17491) за финансовую поддержку.
| (3-меркаптопропил)триметоксисилан | компании Sigma-Aldrich 175617 | храниться в атмосфере аргона при температуре 4°°; С | |
| Уксусная кислота | Bio-Lab ltd 1070521 | ||
| Alexa-Fluor 488 | Invitrogene | A10254 | Разведенный ДМСО, хранящийся в атмосфере аргона при температуре -20°С; С |
| Alexa-Fluor 647 | Invitrogene | A20347 | Разбавленный ДМСО, хранящийся в атмосфере аргона при температуре -20 °° С |
| BSA | Sigma -Aldrich Company | A3059 | хранится при 4 ° С |
| Каталаза | Сигма-Олдрич Компания | C9322 | Стоковый флакон хранится в сухой атмосфере (силикагель) при температуре -20 °°; C |
| Coverslips | Mezel-glaser | CG2222-1.5 | Выдерживается в воде milliQ после процедуры Piranha и используется в течение 3 недель |
| Креатинкиназа | Roche Life Science Products | 10736988001 | Приготовлены в свежем виде в глициновом буфере, хранятся на льду и используются в течение 3 дней. Бутылочка со складом хранится в сухой атмосфере (силикагель) при температуре 4 °°; C |
| Креатин фосфат | Roche Life Science Products | 10621714001 | При растворении следует хранить при температуре -20 °°; C и использовать в течение 3 месяцев. Бутылочка со складом хранится в атмосфере аргона и хранится при температуре 4°С; C |
| DTT | Roche Life Science Products | 10708984001 | при растворении следует хранить при температуре -20 °°; C и используется в течение 3 месяцев |
| Система одновременной визуализации с двойным видом | Фотометрика | DV2-CUBE | |
| EGTA | MP Biomedicals | 195174 | |
| EM-CCD камера | Andor Technology Ltd | DV 887 | |
| EM-CCD камера | Photometrics | Evolve Delta | |
| Ethanol | Bio-Lab ltd | 525050300 | |
| Флуоресцентная лампа | Rapp Optoelectronic | ||
| Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences | 17151-10 | диаметр 200 нм Глюкоза |
| ICN Biomedicals Inc | 194024 | При растворении должна сохраняться при температуре -20 °°; C и использовать в течение 3 месяцев. | |
| Глюкозооксидаза | Sigma-Aldrich компании | G7141 | выдерживается при -20°С; C и использовать в течение 3 месяцев. Исходный порошок хранится в атмосфере аргона и хранится при температуре -20 °°С; C |
| глицерин | ICN Biomedicals Inc | 800687 | |
| глицин | MP биомедикалс | 808822 | |
| перекисью водорода | Sigma-Aldrich Company | 216763 | хранить при 4 градусах; С |
| KCl | EMD Millipore Corp. | 529552 | |
| Methanol | Bio-Lab ltd | 1368052100 | |
| MgCl2 | EMD Millipore Corp. | 442615 | |
| Микроскоп | Leica Microsystems | DMI3000 | |
| mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-5k | Mw = 5000 Da. Делится на мелкие партии по весу. Хранится в атмосфере аргона при температуре -20°°С; C |
| Нильские красные микросферы | Spherotech | FP-2056-2 | Диаметр 2300 нм |
| Объектив (10x) | Leica Germany | HC PL AP0 | UPlanFL числовая апертура = 0,3 |
| Объектив (2,5x) | Leica Германия | 506304 | Plan-NEOFLUAR Числовая апертура = 0.075 |
| Печь | ВТЦ Связующее | ||
| вещество Парапленка | Amcor | PM-996 | |
| PBS Буфер | Sigma-Aldrich Company | P4417 | |
| Драйвер затвора | Vincet Associates | VMM D1 | |
| Силикагель | Merck | 1.01907.5000 | |
| Соник | Elma | Elmasonic P | |
| Серная кислота | Карло Эрба реактивы | 410301 | |
| двухканальная система одновременной визуализации DV2 | Фотометрия | ||
| TRIS | MP Biomedicals | 819620 | |
| УФ-ВИД спектрофотометр | Pharmacia | Ultraspec 2100 pro | |
| MICROMAN E | Gilson | FD10001 | 1– 10 мкл |
| MATLAB R2017b | Количественная оценка данных MathWorks | ||
| МетаМорф | Молекулярные приборы | Управляющее программное обеспечение оптической системы визуализации; количественная оценка данных (анализ слежения за частицами, размер сетки сети) |
