Method Article

Механика (поро-)эластичных сократительных сетей актомиозина как модельная система клеточного цитоскелета

DOI:

10.3791/64377

⸱

March 10th, 2023

 ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Ben Gurion University of the Negev, 2Department of Chemical Engineering, Ilse Kats Institute for Nanoscale Science and Technology, Ben Gurion University of the Negev

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой работе используется подход восстановления in vitro для изучения пороэластичности гелей актомиозина в контролируемых условиях. Количественно определена динамика геля актомиозина и встроенного растворителя, с помощью которой продемонстрирована сетчатая пороупругость. Мы также обсуждаем экспериментальные проблемы, распространенные ошибки и отношение к механике клеточного цитоскелета.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки могут активно менять свою форму и становиться подвижными, что зависит от их способности активно реорганизовывать свою внутреннюю структуру. Эта особенность объясняется механическими и динамическими свойствами клеточного цитоскелета, в частности, цитоскелета актомиозина, который представляет собой активный гель полярных актиновых филаментов, миозиновых моторов и вспомогательных белков, которые проявляют внутренние свойства сокращения. Общепринятая точка зрения состоит в том, что цитоскелет ведет себя как вязкоупругий материал. Однако эта модель не всегда может объяснить экспериментальные результаты, которые больше согласуются с картиной, описывающей цитоскелет как пороупругий активный материал — эластичную сеть, встроенную в цитозоль. Градиенты сократимости, генерируемые миозиновыми моторами, управляют потоком цитозоля через поры геля, что делает вывод о том, что механика цитоскелета и цитозоля тесно связана. Одной из основных особенностей пороупругости является диффузионная релаксация напряжений в сети, характеризующаяся эффективной константой диффузии, которая зависит от модуля упругости геля, пористости и вязкости цитозоля (растворителя). Поскольку клетки имеют много способов регулировать свою структуру и свойства материала, наше нынешнее понимание того, как связаны механика цитоскелета и динамика потока цитозолей, остается плохо изученным. Здесь используется подход восстановления in vitro для характеристики свойств материала пороэластичных гелей актомиозина в качестве модельной системы для клеточного цитоскелета. Сокращение геля обусловлено моторной сократимостью миозина, что приводит к возникновению потока проникающего растворителя. В статье описано, как приготовить эти гели и провести эксперименты. Мы также обсудим, как измерять и анализировать поток растворителя и сжатие геля как в локальном, так и в глобальном масштабе. Приведены различные соотношения масштабирования, используемые для количественной оценки данных. Наконец, обсуждаются экспериментальные проблемы и распространенные ошибки, в том числе их отношение к механике клеточного цитоскелета.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Живые клетки обладают уникальными механическими свойствами. Помимо способности пассивно реагировать на приложенные силы, они также способны активно генерировать силы в ответ на внешние раздражители1. Эти характеристики, которые необходимы для различных клеточных процессов, особенно во время подвижности клеток, в первую очередь объясняются механическими и динамическими свойствами клеточного цитоскелета, особенно цитоскелета актомиозина, который представляет собой активный гель полярных актиновых филаментов, молекулярных моторов миозина и вспомогательных белков. Эти актомиозиновые сети проявляют присущие им свойства самоорганизации и сокращения, обусловленные моторными белками миозина, которые сшивают актиновые филаменты и активно генерируют механические напряжения в сети, подпитываемой гидролизом АТФ2.

Были проведены многочисленные экспериментальные и теоретические исследования по изучению свойств материала цитоскелета3. Общепринятая точка зрения состоит в том, что цитоскелет ведет себя как вязкоупругий материал4. Это означает, что на коротких временных масштабах цитоскелет ведет себя как эластичный материал, а на длительных временных масштабах он ведет себя как вязкая жидкость из-за сшивающих белков и моторной отслойки миозина (и повторного прикрепления), что позволяет сети динамически вращаться. Однако во многих ситуациях вязкоупругая модель не может описать экспериментальные результаты, которые в большей степени согласуются с картиной, описывающей цитоскелет и, в более общем плане, цитоплазму клетки, описываемую как пороупругий активный материал 5,6. Эти типы материалов характеризуются двумя основными особенностями. (i) Первой основной особенностью является генерация потока проникающего цитозоля («растворителя») через поры геля за счет градиентов сократительной способности, управляемых моторами миозина, что лежит в основе таких процессов, как клеточный блеббинг7, подвижность8 и колебания формы клетки9. Возникновение таких цитозольных потоков может быть локальным, для блеббинга, или глобальным, как при подвижности клеток. В последнем случае сократительные напряжения в задней части клетки направляют поток цитозольной жидкости к передней части клетки, что пополняет белковый пул, необходимый для сборки ламеллиподий8. (ii) Вторая основная особенность заключается в том, что релаксация напряжений является диффузионной и характеризуется эффективной константой диффузии, которая зависит от модуля упругости геля, пористости геля и вязкости растворителя5. Константа пороупругой диффузии определяет, насколько быстро система реагирует на приложенное напряжение. Более высокие константы диффузии соответствуют более быстрому перераспределению напряжений. Это, в свою очередь, определяет, сколько времени требуется внутриклеточной цитозольной жидкости для перераспределения внутри клетки после приложенного механического напряжения, будь то внешнего или внутреннего, такого как активные сократительные напряжения, генерируемые миозиновыми моторами. Эти примеры, таким образом, демонстрируют, что механика цитоскелета и цитозоля тесно связана и не может рассматриваться отдельно3.

Поскольку ячейки могут регулировать свои механические свойства различными способами, взаимодействие между сетевой механикой и динамикой потока жидкости остается плохо изученным. Мощным альтернативным подходом является использование восстановленных in vitro систем, которые позволяют полностью контролировать различные микроскопические компоненты и параметры системы, что делает эти модельные системы оптимальными для физического анализа10,11. Этот подход был успешно использован для изучения влияния белкового состава и геометрии системы на актиновую подвижность 12,13,14,15,16,17,18, 2D-паттернирование актомиозиновых сетей 19,20,21,22 , а также взаимодействие между сократимостью сети и динамикой потока жидкости пороэластичных гелей актомиозина, которое находится в центре внимания данной статьи23.

В этой рукописи обсуждается получение сократительных эластичных сетей актомиозина контролируемых размеров и свойств материала на основе работы Ideses et al.23. Проанализирована и количественно определена динамика сжимающегося геля и дренированного растворителя, с помощью которой продемонстрировано, что эти гели актомиозина могут быть описаны как пороупругий активный материал. Изучение влияния вязкости растворителя на диффузию напряжений еще раз подтверждает пороупругую природу этих сетей. Приведены различные соотношения масштабирования, используемые для количественной оценки данных. Наконец, также обсуждаются экспериментальные проблемы, распространенные ошибки и актуальность экспериментальных результатов для клеточного цитоскелета.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Обработка и пассивация поверхности стекла:

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел включает три основных этапа (см. рис. 1): (i) очистка и гидрофилизация, (ii) силанизация и (iii) пассивация поверхности.

  1. Очистка и гидрофилизация
    1. Используйте раствор Piranha для очистки поверхности стекла.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор пираньи представляет собой смесь 30% Н2О2 и 70%Н2СО4 (Таблица материалов). Его основная цель - удалить органические загрязнения с поверхностей покровного стекла и обнажить группы ОН на поверхности стекла. Таким образом, поверхность стекла становится гидрофильной.
    2. Поместите 10-12 #1,5 (22 мм x 22 мм) стеклянные покровные стекла (Таблица материалов) в самодельный держатель из политетрафторэтилена (площадь основания: 5,5 см x 5,5 см). Переложите держатель политетрафторэтилена в стакан объемом 400 мл (таблица материалов) и инкубируйте его с 300 мл раствора пираньи в течение 2 часов. Проделайте этот шаг на льду и в химическом колпаке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полюс из политетрафторэтилена, привинченный к основанию держателя, имеет длину 12 см, что длиннее, чем стакан (11 см), что позволяет безопасно переносить/вытаскивать держатель в/из раствора Piranha. Поскольку раствор Пираньи все еще может быть высокореакционноспособным и очень горячим, необходимо обязательно остановить реакцию. Самый простой способ остановить реакцию - это залить раствор Пираньи в (водопроводную) воду, чтобы добиться 50-кратного разбавления (как минимум). После этого раствор можно смело выбросить. Никогда не храните использованный раствор Piranha в закрытой стеклянной бутылке - это может закончиться взрывом бутылки.
    3. Переложите держатель политетрафторэтилена в чистый стакан, наполненный свежей двойной дистиллированной водой (DDW), чтобы смыть излишки пираньи с покровных стекол.
    4. Перенесите стакан в ванну для обработки ультразвуком (Таблица материалов) и обработайте ультразвуком на частоте 80 Гц на полной мощности в течение 10 минут при 25 °C. Повторите этот шаг еще два раза со свежим DDW. Используйте свежий DDW каждый раз.
  2. Силанизация
    1. Перенесите держатель в чистый стакан (400 мл), заполненный 300 мл чистого метанола (Таблица материалов), а затем в ванну для обработки ультразвуком (Таблица материалов). Обработка ультразвуком при 80 Гц на полной мощности в течение 30 минут при 25 °C.
    2. После обработки ультразвуком переведите держатель в силановый раствор, приготовленный с использованием 15 мл DDW, 3,1 мл уксусной кислоты (таблица материалов), 340 мл метанола и 7,6 мл силана ((3-меркаптопропил) триметоксисилана) (таблица материалов). Запечатайте стакан парапленкой и храните его в холодильнике при температуре 4 °C на ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовление и обработка раствора силана должны выполняться в химическом колпаке. После этапа силанизации поместите использованный раствор силана (отходы) в специальную стеклянную бутылку в химическом колпаке.
    3. На следующий день переложите держатель в чистый стакан, наполненный 300 мл чистого метанола на 15 с. Затем переложите держатель в чистый стакан, не раньше, чем высушите дно держателя из политетрафторэтилена, чтобы удалить излишки метанола. Перенесите стакан в духовку (Таблица материалов), чтобы высушить стеклянные покровные стекла в течение 5 минут при температуре 120 °C.
  3. Пассивация поверхности инертным полимером
    1. Добейтесь пассивации поверхности путем инкубации стеклянных покровных стекол с инертным полимером (Таблица материалов). Для каждого эксперимента возьмите два покровных стекла и поместите их в чашку Петри, покрытую слоем парапленки, первоначально очищенным этанолом (EtOH) (DDW/EtOH: 30/70 об./об.) (Таблица материалов).
    2. Инкубируйте каждое покровное стекло с 1 мл метоксиполиэтиленгликоля малеимида с молекулярной массой 4 мг·мл-1 5 кДа (mPEG-mal , Mw = 5 кДа) (таблица материалов) в 1x фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS) (таблица материалов) в течение 1 ч при 22 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение покровных стекол на гидрофобном слое парапленки ограничивает гидрофильный полимерный раствор ПЭГ поверхностью стеклянного покровного стекла. Время инкубации имеет решающее значение для достижения оптимальной пассивации. Используйте время инкубации от 45 минут до 2 часов. По истечении этого времени инкубации поверхность стеклянных покровных стекол может испортиться, что приведет к адгезии белка и потере прозрачности.
    3. В конце процесса инкубации промойте каждое покровное стекло 5 мл DDW и высушите с потоком N2 (газ). Не сушите покровные стекла под пылесосом. Поскольку покровные стекла должны оставаться влажными после пассивации, немедленно нанесите 1 мл 10 мМ Tris на пегилированные поверхности. Используйте покровные стекла в течение 2 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Различные этапы должны выполняться в камере с ламинарным потоком, чтобы предотвратить загрязнение поверхности стекла.

2. Очистка белка

  1. Очистите G-актин из порошка ацетона скелетных мышц кролика, используя методгель-фильтрации 24.
    1. Очищение актина занимает 1 неделю. Храните очищенный G-актин в G-буфере (5 мМ Tris pH 7,8, 0,01% NaN3, 0,1 мМ CaCl2,0,2 мМ АТФ и 1 мМ DTT) и храните его на льду. Используйте раствор в течение 2 недель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Меняйте лед каждые пару дней.
    2. Пометьте актин флуоресцентным красителем, модифицированным малеимидом16 (Таблица материалов). Очистите GST-фашин по методу Ono et al.25. Заморозьте оба белка в жидкости N2 и храните при температуре -80 °C.
  2. Используйте стандартный протокол для очистки миозина II из скелетных мышц кролика26. Буфер с очищенным запасом миозина II (димеры) включает 10 мМ Tris pH 7,4, 0,5 М KCl и 35% сахарозы. Миозин заморозить во время вспышки в жидкости N2 и хранить при температуре -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Высокая концентрация KCl удерживает моторы миозина в димерной форме, в то время как высокий процент сахарозы гарантирует, что активность двигателей не снижается при замерзании. Используйте специальную пипетку для работы с вязкими жидкостями при работе со стоковыми растворами миозина II (таблица материалов).
    1. Маркируйте димеры миозина II флуоресцентным красителем (Таблица материалов) по парам сконструированных остатков цистеина19,27. Используйте для этой цели мутант RLC Aкуриного желудка 26. Заморозьте меченый миозин II в жидкости N2 и храните при температуре -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура маркировки гарантирует, что меченый миозин активен как нативный белок миозина II.
  3. Используйте УФ-ВИД спектрофотометр (таблица материалов) для измерения поглощения исходных белковых растворов и выведите концентрации белка с помощью закона Бера-Ламберта, используя следующие коэффициенты экстинкции: G-актин (ε290 = 26 460 М-1 · см -1), GST-фасин (ε 280 = 99 330 М-1 · см-1), димер миозина II (ε280 = 268 800 М-1 · см-1), и мутант RLC A (ε280 = 3,960 M−1·cm−1)19.

3. Пробоподготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Полимеризуйте актиновые мономеры в присутствии больших агрегатов моторов миозина II и сильного пассивного сшивающего фасина для получения макроскопически сократительных эластичных сетей актомиозина19,23. Добавление флуоресцентных шариков в раствор позволяет отслеживать поток растворителя во время сжатия геля.

  1. Раствор белка («актомиозина»)
    1. За исключением G-актина, храните белки при -80 ° C в небольших аликвотах и размораживайте их при 37 ° C перед использованием. Общий объем раствора актомиозина составляет 40 мкл.
    2. Приготовьте раствор путем смешивания 10 мМ Tris pH 7,4, 2 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 1 мМ АТФ, регенерирующей системы АТФ (0,5 мг·мл-1 креатинкиназы и 5 мМ креатинфосфата), 200 мкМ EGTA (хелаты ионов Ca2+), антиотбеливающего раствора (0,1 мг·мл-1 глюкозооксидазы, 0,018 мг·мл-1 каталазы и 5 мг·мл-1 глюкозы), 5 мкМ G-актин, 280 нМ GST-фасин и 1,67 нМ миозин II. Процент меченого G-актина составляет 5% (молярный процент).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте низкий процент меченого G-актина, чтобы избежать насыщения флуоресцентного сигнала на поздних стадиях сжатия геля.
  2. Приготовление моторных агрегатов миозина II
    1. Добавьте миозиновые моторы в белковый раствор в виде агрегатов. Чтобы сформировать большие агрегаты миозина (150 димеров миозина / агрегат), разбавьте исходный раствор миозина 10 мМ Tris pH 7,4 до достижения конечной концентрации 25 мМ KCl.
    2. Держите разбавленный раствор миозина в течение 10 минут при комнатной температуре (RT), а затем переложите его на лед до использования. Двигатели полностью активны до 2 часов.
  3. Измерение расхода растворителя
    1. Чтобы отследить течение растворителя через поры геля, добавьте флуоресцентные шарики в раствор актомиозина. Уменьшите взаимодействие между шариками и актомиозиновой сетью, пассивируя шарики. Практически, инкубируют 1 мкл шариков (Таблица материалов) с 5 мкМ G-актином в течение 20 мин при RT, а затем удаляют избыток G-актина центрифугированием (Таблица материалов) (условия: 6000 x g в течение 5 мин при 4 °C).
    2. Повторите этот шаг с 10 мг · мл - 1 бычьего сывороточного альбумина (BSA) (таблица материалов), чтобы заблокировать (возможно) оставшуюся поверхность без покрытия. Используйте бусины при окончательном разведении 1:10 000 об./об. в экспериментах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно адаптировать диаметр шариков к размеру пор геля таким образом, чтобы соотношение шариков и пор составляло <1 на всех этапах.
  4. Влияние вязкости раствора
    1. Контролируйте вязкость раствора, добавляя глицерин (Таблица материалов) к раствору актомиозина. Добавление глицерина в весовом проценте в диапазоне от 0% до 34% вызывает соответствующее увеличение вязкости раствора с η Ом до 2,76 η Ом, где η ω - вязкость воды при 20 °C28.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с глицерином необходимо использовать специальную пипетку для работы с вязкими жидкостями (Таблица материалов).

4. Проведение эксперимента

  1. Самодельное обращение с держателем образца
    1. Возьмите одно из ПЭГ-пассивированных покровных стекол, поместите поверх него смазанную прокладкой для парапленки и поместите ее в держатель образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прокладку парапленки можно заменить на любую проставку.
  2. Приготовление раствора актомиозина
    1. Приготовьте раствор актомиозина на льду в микроцентрифужной пробирке, включив различные микроскопические компоненты, добавив моторные агрегаты миозина II и добавив EGTA в последнюю очередь. Хорошо перемешайте раствор. Добавление EGTA инициирует полимеризацию актомиозиновой сети, которая устанавливает время начала эксперимента.
  3. Нанесите 1,1 мкл этого раствора на защитное стекло, установленное на держателе, и поместите второе покровное стекло сверху. Закрутите держатель, чтобы запечатать образец. Этот процесс слегка сжимает каплю, которая принимает дискообразную форму. Диаметр капли колеблется от 2 800 до 3 000 мкм.
  4. Поместите держатель образца на микроскоп и начните сбор. Подготовьте микроскоп заранее, чтобы сократить время первоначального сбора. Обычно после смешивания требуется 1-2 минуты, чтобы начать визуализацию образца.

5. Методы микроскопии

  1. Изображение образцов с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа (Таблица материалов), управляемого специальным программным обеспечением (Таблица материалов).
    1. Используйте малые увеличения объектива Plan-NEOFLUAR 2,5x/0,075 (таблица материалов), чтобы визуализировать всю область геля и проследить ее макроскопическое сокращение со временем.
    2. Используйте цель 10x/0,3 Ph1 UPlanFL (таблица материалов), чтобы охарактеризовать пористость и структуру сети, а также проследить самоорганизацию и сжатие сети с течением времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта цель также полезна для локализации моторных агрегатов миозина II в сети и отслеживания движения флуоресцентных шариков через поры геля. Более высокие увеличения можно использовать за счет уменьшенного поля зрения, что еще более существенно в режиме двухцветной визуализации (Таблица материалов).
  2. Возбуждайте образцы при длине волны 488 нм (актин/флуоресцентные шарики) и 561 нм (моторные агрегаты миозина/флуоресцентные шарики). Получайте изображения со скоростью 100 мс на кадр с помощью специального программного обеспечения (Таблица материалов) в потоковом режиме с камерой с устройством умножения заряда на электрон (EMCCD) (Таблица материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность люминесцентной лампы (таблица материалов) должна поддерживаться на минимально возможном значении, чтобы избежать насыщения сигнала во время сжатия сети.
  3. Одновременная двухцветная визуализация
    1. Используйте этот режим для двух целей: (i) обнаружение локализации моторных агрегатов миозина в актиновой сети и (i) характеристика потока растворителя наружу внутри и снаружи во время сжатия сети.
    2. Возбуждайте моторы актина и миозина II на длине волны 488 нм и 561 нм соответственно и одновременно записывайте изображения на камеру EMCCD (таблица материалов) с помощью устройства с двойным излучением (таблица материалов). Используйте одну и ту же систему визуализации для одновременного изображения актинового геля (488 нм) и флуоресцентных шариков (561 нм).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для эксперимента используются два стеклянных покровных стекла. Покровные стекла очищаются и пассивируются полимерами ПЭГ. Пассивация необходима для предотвращения прилипания солюбилизированных белков к стеклянным поверхностям на ранних экспериментальных стадиях и для минимизации взаимодействия сжимающейся сети со стеклянными стенками. Неспособность достичь хорошей пассивации может привести к неэффективному сокращению и, в крайних случаях, может даже ингибировать образование актиновой сети.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь используется подход in vitro для характеристики механики пороэластичных гелей актомиозина как модельной системы клеточного цитоскелета и, в более общем плане, цитоплазмы клетки, которая, как было показано, ведет себя как пороэластический материал 3,5. Реология клеточного цитоскелета (цитоплазмы) характеризуется константой пороупругой диффузии, которая определяет, сколько времени требуется внутриклеточной цитозольной жидкости для перераспределения в...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Благодарим Дину Аранович за очистку и маркировку белка. Г.Л. благодарен Министерству науки, технологий и космоса Израиля за стипендию доктора философии им. Жаботинского. A.B.G. благодарен Израильскому научному фонду (грант 2101/20) и Министерству науки и технологий Государства Израиль (грант 3-17491) за финансовую поддержку.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(3-меркаптопропил)триметоксисиланкомпании Sigma-Aldrich 175617храниться в атмосфере аргона при температуре 4°°; С 
Уксусная кислотаBio-Lab ltd 1070521
Alexa-Fluor 488InvitrogeneA10254Разведенный ДМСО, хранящийся в атмосфере аргона при температуре -20°С; С 
Alexa-Fluor 647InvitrogeneA20347Разбавленный ДМСО, хранящийся в атмосфере аргона при температуре -20 °° С 
BSASigma -Aldrich CompanyA3059хранится при 4 ° С 
КаталазаСигма-Олдрич КомпанияC9322Стоковый флакон хранится в сухой атмосфере (силикагель) при температуре -20 °°; C
CoverslipsMezel-glaserCG2222-1.5Выдерживается в воде milliQ после процедуры Piranha и используется в течение 3 недель
КреатинкиназаRoche Life Science Products10736988001Приготовлены в свежем виде в глициновом буфере, хранятся на льду и используются в течение 3 дней. Бутылочка со складом хранится в сухой атмосфере (силикагель) при температуре 4 °°; C
Креатин фосфатRoche Life Science Products10621714001При растворении следует хранить при температуре -20 °°; C и использовать в течение 3 месяцев. Бутылочка со складом хранится в атмосфере аргона и хранится при температуре 4°С; C
DTTRoche Life Science Products10708984001при растворении следует хранить при температуре -20 °°; C и используется в течение 3 месяцев
Система одновременной визуализации с двойным видом ФотометрикаDV2-CUBE
EGTAMP Biomedicals195174
EM-CCD камераAndor Technology LtdDV 887
EM-CCD камераPhotometricsEvolve Delta
EthanolBio-Lab ltd525050300
Флуоресцентная лампаRapp Optoelectronic
Fluoresbrite YG MicrospheresPolysciences17151-10диаметр 200 нм Глюкоза
ICN Biomedicals Inc194024При растворении должна сохраняться при температуре -20 °°; C и использовать в течение 3 месяцев.
ГлюкозооксидазаSigma-Aldrich компанииG7141выдерживается при -20°С; C и использовать в течение 3 месяцев. Исходный порошок хранится в атмосфере аргона и хранится при температуре -20 °°С; C
глицеринICN Biomedicals Inc800687
глицинMP биомедикалс808822
перекисью водородаSigma-Aldrich Company216763хранить при 4 градусах; С 
KClEMD Millipore Corp.
MethanolBio-Lab ltd1368052100
MgCl2EMD Millipore Corp.
МикроскопLeica MicrosystemsDMI3000
mPEG-malNanocsPG1-ML-5k Mw = 5000 Da. Делится на мелкие партии по весу. Хранится в атмосфере аргона при температуре -20°°С; C
Нильские красные микросферыSpherotechFP-2056-2 Диаметр 2300 нм
Объектив (10x)Leica GermanyHC PL AP0UPlanFL числовая апертура = 0,3
Объектив (2,5x)Leica Германия506304  Plan-NEOFLUAR Числовая апертура = 0.075
ПечьВТЦ Связующее
вещество ПарапленкаAmcorPM-996
PBS БуферSigma-Aldrich CompanyP4417
Драйвер затвораVincet AssociatesVMM D1
СиликагельMerck1.01907.5000
СоникElmaElmasonic P
Серная кислотаКарло Эрба реактивы410301
двухканальная система одновременной визуализации DV2Фотометрия
TRISMP Biomedicals819620
УФ-ВИД спектрофотометрPharmaciaUltraspec 2100 pro
MICROMAN EGilsonFD100011– 10 мкл
MATLAB R2017bКоличественная оценка данных MathWorks 
МетаМорф Молекулярные приборыУправляющее программное обеспечение оптической системы визуализации; количественная оценка данных (анализ слежения за частицами, размер сетки сети)
529552442615

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alberts, B., et al. Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
  2. Howard, J. Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , Sinauer Associates. Sunderland, MA. (2001).
  3. Mogilner, A., Manhart, A. Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel. Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).
  4. Bausch, A. R., Kroy, K. A bottom-up approach to cell mechanics. Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).
  5. Moeendarbary, E., et al. The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material. Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).
  6. Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. Animal cell hydraulics. Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).
  7. Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells. Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).
  8. Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).
  9. Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments. Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).
  10. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
  11. Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. Toward the reconstitution of synthetic cell motility. Cell Adhesion & Migration. 10 (5), 461-474 (2016).
  12. Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -F., Sykes, C. The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters. Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).
  13. Bieling, P., et al. Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks. Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).
  14. Carvalho, K., et al. Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005(2013).
  15. Dayel, M. J., et al. In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility. PLoS Biology. 7 (9), e1000201(2009).
  16. Manhart, A., et al. Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks. eLife. 8, 42413(2019).
  17. Siton, O., et al. Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches. Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).
  18. Pontani, L. -L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
  19. Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity. Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).
  20. Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: Dynamics of patterning and self-organization. Physical Biology. 3 (4), 264(2006).
  21. Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).
  22. Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615(2016).
  23. Ideses, Y., et al. Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets. Nature Communications. 9 (1), 2461(2018).
  24. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  25. Ono, S., et al. Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin. Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).
  26. Margossian, S. S., Lowey, S. Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle. In Methods in Enzymology. 85, Academic Press. Cambridge, MA. 55-71 (1982).
  27. Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy. Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).
  28. Cheng, N. -S. Formula for the viscosity of a glycerol−water mixture. Industrial & Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).
  29. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  30. Strychalski, W., Guy, R. D. Intracellular pressure dynamics in blebbing cells. Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).
  31. Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks. Physical Review E. 68 (6), 061907(2003).
  32. MacKintosh, F. C., Levine, A. J. Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels. Physical Review Letters. 100 (1), 018104(2008).
  33. Melero, C., et al. Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins. Journal of Visualized Experiments. (152), e60092(2019).
  34. Bendix, P. M., et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

PoroelasticityActomyosin NetworksCell CytoskeletonMyosin ContractilityFluid FlowMechanical PropertiesActive MaterialsRheologyGlass CoverslipsPiranha SolutionSalinizationSilane SolutionSurface PassivationMethoxypolyethylene Glycol Maleimide