Многолетнее культивирование и мониторинг изолированных Caenorhabditis elegans на твердых средах в многолуночных устройствах

Caenorhabditis elegans обычно используются в исследованиях старения из-за их короткого времени генерации (примерно 3 дня), короткой продолжительности жизни (около 3 недель), простоты культивирования в лаборатории, высокой степени эволюционного сохранения молекулярных процессов и путей с млекопитающими, а также широкой доступности методов генетических манипуляций. В контексте исследований старения C. elegans позволяет быстро генерировать данные о долголетии и возрастных популяциях для анализа фенотипов позднего возраста у живых животных. Типичный подход к проведению исследований старения червей включает ручное измерение продолжительности жизни популяции червей, содержащихся в группах от 20 до 70 животных на твердой питательной среде агаровой нематоды (NGM) в 6-сантиметровых пластинах Петри¹. Использование популяций, синхронизированных по возрасту, позволяет измерять продолжительность жизни или фенотипы поперечного сечения у отдельных животных в популяции, но этот метод исключает мониторинг характеристик отдельных животных с течением времени. Этот подход также является трудоемким, что ограничивает размер популяции, которая может быть протестирована.

Существует ограниченное количество методов культивирования, которые позволяют проводить продольный мониторинг отдельных C. elegans на протяжении всей их жизни, и каждый из них имеет определенный набор преимуществ и недостатков. Устройства микрофлюидики, в том числе WormFarm², NemaLife³ и чип «поведения»⁴, среди прочих ^5,6,7, позволяют контролировать отдельных животных с течением времени. Культивирование червей в жидкой культуре с использованием многолуночных планшетов аналогичным образом позволяет контролировать как отдельных животных, так и небольшие популяции C. elegans с течением времени ^8,9. Жидкая среда представляет собой особый экологический контекст от обычной культурной среды на твердых средах в пластинах Петри, что может изменять аспекты физиологии животных, имеющие отношение к старению, включая содержание жира и экспрессию генов реакции на стресс^10,11. Возможность прямого сравнения этих исследований с большинством данных, собранных о старении C. elegans, ограничена различиями в потенциально важных переменных окружающей среды. Worm Corral¹² — это один из подходов, разработанный для размещения отдельных животных в среде, которая более точно воспроизводит типичную культуру твердых сред. Загон для червей содержит герметичную камеру для каждого животного на предметном стекле микроскопа с использованием гидрогеля, что позволяет проводить продольный мониторинг изолированных животных. Этот метод использует стандартную визуализацию светлого поля для записи морфологических данных, таких как размер тела и активность. Тем не менее, животные помещаются в гидрогелевую среду в качестве эмбрионов, где они остаются нетронутыми на протяжении всей своей жизни. Это требует использования условно стерильных мутантных или трансгенных генетических фонов, что ограничивает как возможности для генетического скрининга, поскольку каждая новая мутация или трансген должны быть скрещены на фоне с условной стерильностью, так и способность к скринингу лекарств, поскольку лечение может быть применено только один раз к животным в качестве эмбрионов.

Альтернативный метод, разработанный лабораторией Fang-Yen, позволяет культивировать червей на твердых средах в отдельных лунках микрофабрикованного устройства из полидиметилсилоксана (PDMS) под названием WorMotel^13,14. Каждое устройство помещается в однолуночный лоток (т.е. с теми же размерами, что и 96-луночная пластина) и имеет 240 лунок, разделенных рвом, заполненным аверсивным раствором, чтобы предотвратить перемещение червей между лунками. В каждой скважине может находиться один червь в течение всей его жизни. Устройство окружено водопоглощающими гранулами полиакриламидного геля (называемыми «кристаллами воды»), а лоток запечатан лабораторной пленкой Parafilm для поддержания влажности и минимизации высыхания среды. Эта система позволяет собирать данные о продолжительности жизни и продолжительности жизни отдельных животных, в то время как использование твердых сред лучше повторяет окружающую среду, в которой обитают животные в подавляющем большинстве опубликованных исследований продолжительности жизни C. elegans, что позволяет проводить более прямые сравнения. Недавно аналогичная методика была разработана с использованием полистирольных микролотков, которые первоначально использовались для анализов микроцитотоксичности¹⁵ вместо устройства¹⁶ PDMS. Метод микролотка позволяет собирать индивидуализированные данные о червях, культивируемых на твердых средах, и обладает улучшенной способностью удерживать червей в условиях, которые обычно вызывают бегство (например, стрессоры или диетические ограничения), при этом компромисс заключается в том, что каждый микролоток может содержать только 96 животных¹⁶, тогда как используемое здесь многолуночное устройство может содержать до 240 животных.

Здесь представлен подробный протокол подготовки многолуночных устройств, оптимизированный для согласованности между пластинами и параллельной подготовки нескольких устройств. Этот протокол был адаптирован из оригинального протокола из лаборатории Fang-Yen¹³. В частности, описаны методы минимизации загрязнения, оптимизации последовательной сушки как твердой среды, так и бактериального источника пищи, а также доставки РНК-интерференции и лекарств. Эта система может использоваться для отслеживания индивидуальной продолжительности здоровья, продолжительности жизни и других фенотипов, таких как размер и форма тела. Эти многолуночные устройства совместимы с существующими высокопроизводительными системами для измерения продолжительности жизни, что может устранить большую часть ручного труда, связанного с традиционными экспериментами по продолжительности жизни, и предоставить возможность автоматизированного прямого измерения продолжительности жизни и отслеживания здоровья у отдельных C. elegans в масштабе.

1. Приготовление исходных растворов и сред

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом подготовки многолуночных устройств подготовьте следующие исходные растворы и среды.

1. Исходные растворы для сред для выращивания нематод (NGM) и низкоплавких NGM (lmNGM):
   1. Приготовьте 1 M K 2 HPO₄: Добавьте 174,18 г K₂HPO4 в бутылку объемом 1 л и залейте ее до 1 л стерильной деионизированной водой. Автоклав (121 °C, 15 фунтов на кв. дюйм) в течение 30 минут и хранить при комнатной температуре (RT).
   2. Приготовьте 1 M KP_i, pH 6,0: добавьте 136,09 г KH₂HPO₄ во флакон объемом 1 л и залейте его до 1 л стерильной деионизированной водой. Титруют 1 М К₂HPO₄ до рН 6,0. Автоклав (121 °C, 15 фунтов/кв. дюйм) в течение 30 минут и хранить при температуре RT.
   3. Подготовьте 1 М CaCl 2: добавьте 73,5 г CaCl₂ в бутылку объемом 500 мл и залейте ее до 500 мл стерильной деионизированной водой. Автоклав (121 °C, 15 фунтов/кв. дюйм) в течение 30 минут и хранить при температуре RT.
   4. Приготовьте 1 М MgSO 4: добавьте 123,25 г MgSO₄ в бутылку объемом 500 мл и залейте ее до 500 мл стерильной деионизированной водой. Автоклав (121 °C, 15 фунтов/кв. дюйм) в течение 30 минут и хранить при температуре RT.
   5. Подготовьте 5 мг / мл холестерина: смешайте 2,5 г холестерина, 275 мл 100% этанола и 25 мл стерильной деионизированной воды в янтарной бутылке объемом 500 мл. Хранить в RT.
   6. Приготовьте 50 мМ флоксуридина: смешайте 0,1231 г флоксуридина и 10 мл стерильной деионизированной воды в конической пробирке объемом 15 мл. Фильтруйте-стерилизуйте его фильтром 0,22 мкм с помощью шприца объемом 10 мл. Аликвотируйте по 1 мл в 10 микроцентрифужных пробирок и храните их при -20 ° C.
   7. Приготовьте 50 мг / мл карбенициллина: в конической пробирке объемом 15 мл смешайте 500 мг карбенициллина с 10 мл стерильной деионизированной воды. Фильтруйте-стерилизуйте его фильтром 0,22 мкм с помощью шприца объемом 10 мл. Аликвотируйте по 1 мл в 10 микроцентрифужных пробирок и храните их при -20 ° C.
   8. Приготовьте 1 мМ изопропил ß-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG): в конической пробирке объемом 15 мл смешайте 2,38 г IPTG с 10 мл стерильной деионизированной воды. Фильтруйте-стерилизуйте его фильтром 0,22 мкм с помощью шприца объемом 10 мл. Аликвотируйте по 1 мл в 10 микроцентрифужных пробирок и храните их при -20 ° C.
   9. Приготовьте 100 мг / мл ампициллина: в конической пробирке объемом 15 мл смешайте 1 г ампициллина с 10 мл стерильной деионизированной воды. Фильтруйте-стерилизуйте его фильтром 0,22 мкм с помощью шприца объемом 10 мл. Аликвотируйте по 1 мл в 10 микроцентрифужных пробирок и храните их при -20 ° C.
2. Подготовка питательных сред нематод (NGM) для общего содержания C. elegans
   1. Чтобы приготовить 50 тарелок, в колбе объемом 1 л смешайте 10 г агара Bacto, 1,5 г NaCl, 1,25 г пептона Bacto и 486 мл сверхчистой воды. Автоклав в жидкостном цикле (121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм) в течение не менее 30 минут для стерилизации.
   2. После автоклава, после охлаждения среды до 55 °C, добавляют 12,5 мл 1 М KP_i, 500 мкл 1 M MgSO₄, 500 мкл 1 M CaCl2 и 500 мкл 5 мг/мл холестерина.
   3. Используя стерильную технику, налейте 10 мл среды в каждую 60-миллиметровую пластину (всего 50). После того, как среда затвердеет (по крайней мере, через 30 минут после заливки), пипеткой 300 мкл бактериальной культуры (приготовленной в соответствии с этапами 4 и 10), которые были выращены в течение ночи, на центр пластины. Оставьте тарелку на скамейке, дав бактериальной культуре высохнуть и загустеть (1-2 дня). Храните пластины при температуре 4 °C.
3. Приготовьте предварительную смесь низкоплавких сред для роста нематод (lmNGM):
   1. В колбе объемом 500 мл смешайте 4 г легкоплавкой агарозы, 0,5 г пептона Bacto и 195 мл сверхчистой воды. Автоклав в жидкостном цикле (121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм) в течение не менее 30 минут для стерилизации.
   2. Пока среда еще расплавлена, распределите 10 мл аликвот в стерильные стеклянные пробирки. Запечатайте каждую пробирку парапленкой, а затем крышкой пробирки, чтобы сохранить предварительную смесь lmNGM и предотвратить высыхание. Носитель затвердеет и может храниться в течение ~ 2 недель при RT перед использованием.
4. Приготовьте 142,8 мМ NaCl: Во флаконе объемом 250 мл смешайте 0,8345 г NaCl и 100 мл стерильной деионизированной воды. Автоклав (121 °C, 15 фунтов/кв. дюйм) в течение 30 минут и хранить при температуре RT.
5. Приготовьте раствор моющего средства: в конической пробирке объемом 15 мл смешайте 3 мл 20 и 7 мл стерильной деионизированной воды. Тщательно перемешайте, простерилизуйте фильтром 0,22 мкм с помощью шприца объемом 10 мл и храните при РТ.
6. Приготовьте раствор сульфата меди: в стерильной бутылке объемом 50 мл смешайте 20 мл стерильной деионизированной воды, 0,5 г CuSO₄ и 100 мкл раствора моющего средства (приготовленного на этапе 1.5). Перемешивайте, пока CuSO₄ не растворится. Хранить в RT.
7. Подготовьте водопоглощающие кристаллы полиакриламида: в бутылке, безопасной для отжима в автоклаве, смешайте 150 мл деионизированной воды и 1 г суперабсорбирующего полимера типа S. Аккуратно перемешайте, перевернув бутылку несколько раз. Автоклав в жидкостном цикле (121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм) не менее 20 мин и хранить при RT.
8. Приготовьте лизогенный бульон (LB): В стакане объемом 1 л или больше смешайте 20 г порошка LB с 1 л деионизированной воды. Аликвота в два стакана по 500 мл. Автоклав (121 °C, 15 фунтов на кв. дюйм) в течение 30 минут и хранить при температуре RT
9. Приготовьте лизогенный бульон (LB) агаровые пластинки:
   1. В колбе объемом 1 л смешайте 10 г порошка LB, 7,5 г бакто-агара и 500 мл деионизированной воды. Автоклав в жидкостном цикле (121 °C, 15 фунтов на кв. дюйм) в течение 30 мин.
   2. При желании добавить дополнительные антибиотики (после автоклава, после охлаждения среды до 55 °C): 500 мкл 100 мг/мл ампициллина. Используя стерильный метод, налейте 20 мл среды в каждую 100-миллиметровую пластину (всего 25) и храните при температуре 4 °C.

2. Печать 3D-формы многолуночного устройства

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое устройство отливается из PDMS с использованием специальной пресс-формы, напечатанной на 3D-принтере. Одна пресс-форма может производить столько устройств, сколько необходимо; однако, если вы пытаетесь подготовить несколько устройств одновременно, для каждого устройства, которое будет изготовлено параллельно, требуется одна 3D-печатная форма.

1. Загрузите файл STL (см. Дополнительный файл 1).
2. Распечатайте форму на 3D-принтере с высоким разрешением.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разрешение принтера должно быть достаточно высоким, чтобы обеспечить стабильные объемы колодцев и рвов. Рекомендуемое разрешение принтера составляет минимальное разрешение XY ~ 40 мкм и разрешение слоя 28 мкм. Материал, используемый 3D-принтером, не менее важен, так как многие типы материалов препятствуют отверждению PDMS. По опыту, пресс-формы, изготовленные на принтерах PolyJet с высоким разрешением (разрешение: ось X = 600 точек на дюйм, ось Y = 600 точек на дюйм, ось Z = 1,600 точек на дюйм) с использованием печатного материала Vero Black, работают стабильно. 3D-печать пресс-форм, использованных в этом исследовании, была передана на аутсорсинг (подробности печати можно найти в таблице материалов).

3. Подготовка многолуночного устройства

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается, как пресс-форма, напечатанная на 3D-принтере, используется для создания многолуночного устройства PDMS.

1. Установите печь для отверждения на 55 °C, чтобы обеспечить предварительный нагрев.
2. Определите количество устройств, которые должны быть подготовлены в одной партии. Для каждого устройства смешайте 60 г основы PDMS и 6 г отвердителя в большой одноразовой лодке для взвешивания (или аналогичном одноразовом контейнере) с помощью одноразового шпателя.
3. Поместите смесь PDMS в вакуумную камеру на 30 мин при давлении −0,08 МПа для удаления пузырьков.
4. Залейте смесь PDMS в каждую форму, напечатанную на 3D-принтере. Заполните форму полностью, при этом смесь PDMS немного выходит над верхней частью формы. Сохраняйте излишки смеси PDMS, чтобы заполнить форму в случае разливов.
5. Поместите заполненную форму и любую дополнительную смесь PDMS в вакуумную камеру на 25 минут при давлении -0,08 МПа, чтобы удалить пузырьки, образующиеся в процессе заливки.
6. Выньте заполненную форму из вакуумной камеры и лопните оставшиеся пузырьки одноразовым шпателем. Используйте шпатель, чтобы смахнуть видимый мусор или оставшиеся пузырьки с края формы подальше от лунок. Любой оставшийся мусор или пузырьки потенциально могут помешать визуализации на более поздних этапах.
7. Убедитесь, что форма полностью заполнена смесью PDMS; Обычно небольшая часть смеси выливается во время нахождения в вакуумной камере или во время переноса. Заправьте с помощью дополнительной смеси PDMS, которая была дегазирована на шаге 3.5. Это не должно создавать пузырьков, но если таковые все же образуются, их можно аккуратно смахнуть шпателем сбоку от формы.
8. Поместите плоский акриловый лист поверх формы, заполненной PDMS, сначала поместив один край и медленно опустив другой, пока акрил не сядет ровно поверх формы, вытесняя любую смесь PDMS, выступающую над краем. Если при укладке акрилового листа образуются пузырьки, медленно удалите акрил, при необходимости заполните форму смесью PDMS и возобновите укладку акрила. Акриловый лист сформирует плоское дно для формованного устройства и обеспечит то, что все лунки находятся на одном уровне относительно основания.
9. Поместите груз весом 2.5 фунта поверх акрила. Несколько форм, каждая из которых имеет отдельный акриловый лист, могут быть сложены друг на друга. Поместите утяжеленные формы в духовку и дайте им застыть при температуре 55 ° C в течение ночи.
10. На следующий день достаньте утяжелители и формочки из духовки.
11. Осторожно проведите бритвенным лезвием между акрилом и отвержденным PDMS, чтобы сломать уплотнение. Аккуратно снимите акрил с верхней части формы. К этому моменту PDMS установится, и удаление акрила может потребовать некоторого усилия.
12. С помощью бритвы или металлического шпателя аккуратно отсоедините стенки отвержденного PDMS от формы. На этом этапе легко порвать PDMS; Медленно и осторожно работайте по краю, чтобы удалить устройство PDMS неповрежденным.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Свеженапечатанные формы особенно липкие для первых трех применений, и PDMS часто рвется при попытке снять устройство. При большем количестве применений становится легче удалить отвержденную PDMS из формы.
13. Заверните устройство в алюминиевую фольгу и заклейте его автоклавной лентой. Автоклав в сухом цикле не менее 15 мин при 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм для стерилизации. После автоклавирования храните обернутые устройства на столе и используйте их по мере необходимости.

4. Полосы бактерий

ПРИМЕЧАНИЕ: Начните готовить бактерии, которые будут использоваться в качестве источника пищи для червей, пока они находятся на многолуночном устройстве. Наиболее распространенной бактерией является штамм Escherichia coli OP50 (или штамм HT115 для экспериментов с РНКи). Выполните этот шаг как минимум за 2 дня до добавления червей в устройство.

1. Выложите бактерии на свежую тарелку LB. Убедитесь, что любые специфичные для штамма селективные добавки (например, ампициллин для выбора плазмиды, придающей бактериям устойчивость к ампициллину) включены в пластины LB.
2. Инкубируйте тарелку при 37 ° C в течение ночи (~ 18 часов), чтобы колонии могли расти.

5. Подготовка многолуночного устройства к загрузке среды

ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхность силиконового материала PDMS, из которого состоит устройство, является гидрофобной, что предотвращает заполнение лунок малого объема и аверсивных рвов NGM и сульфатом меди соответственно. Чтобы обойти эту проблему, кислородная плазма используется для временного изменения поверхностных свойств устройства, чтобы они были гидрофильными, что позволяет заполнять лунки и ров в течение ограниченного временного окна (до ~ 2 ч). В этом разделе изложены шаги для завершения процесса плазменной очистки. Выполните этот шаг по крайней мере за 1 день до обнаружения лунок устройства с бактериями, так как затяжные эффекты очистки плазмы могут помешать кровянистым выделениям. Учитывая сроки выполнения разделов 5-7, практическим пределом для этих шагов для одного технического специалиста является три устройства параллельно.

1. Разогрейте инкубатор для ванны с сухим бисером до 90 °C при подготовке к разделу 6.
2. Поскольку общий объем среды, необходимый для заполнения лунок многолуночного устройства, невелик по сравнению с объемом для планшетов Петри, приготовьте большую партию NGM и аликвотируйте ее в пробирки (см. шаг 1.3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно сделать заранее, так как трубки со средой можно хранить на столе в течение ~ 2 недель. Если носитель подготовлен и аликвотирован в пробирки, переходите к шагу 5.3.
3. Надев перчатки, разверните автоклавное многолуночное устройство; Не прикасайтесь ни к одному из колодцев. Вырежьте небольшую выемку в правом верхнем углу устройства, чтобы указать, сколько раз оно использовалось/использовалось повторно (см. раздел 15 ниже для инструкций и рекомендаций по очистке и повторному использованию каждого устройства).
4. Поместите до трех неупакованных устройств в плазменный очиститель лунками вверх. Запустите плазменный очиститель.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие подробные инструкции относятся к плазменному очистителю Plasma Etch PE-50. Конкретные шаги и настройки должны быть адаптированы и, возможно, повторно оптимизированы для других плазменных очистителей.
   1. Убедитесь, что уровень мощности плазменного очистителя установлен на 75%.
   2. Убедитесь, что вентиляционный и запорный клапаны находятся в положении ВЫКЛ.
   3. Откройте главный вентиль на кислородном баллоне. Подождите, пока давление регулятора не упадет до 15–20 фунтов на квадратный дюйм, а затем поверните запорный клапан в положение ON .
   4. Включите вакуумный насос и плазменный очиститель.
   5. Введите следующие настройки на плазменном очистителе (первое использование) или проверьте правильность ранее запрограммированных настроек:
      Время плазмы: 3:00 мин
      Заданное значение вакуума: 149,5 мТорр
      Атмосферное отверстие: 45 с
      Вентиляционное отверстие для продувки: 5 с
      Газовая стабилизация: 15 с
      Вакуумная сигнализация: 3:00 мин
      Автоматическое выключение: ВКЛ
   6. Нажмите Enter , чтобы перейти в меню команд. С помощью клавиши СТРЕЛКА ВПРАВО выберите пункт Меню настройки и нажмите клавишу ВВОД. Прокрутите все настройки, нажимая Enter , чтобы подтвердить каждую текущую настройку, а затем стрелку вправо , чтобы перейти к следующей настройке.
   7. Вернитесь в меню команд, нажав стрелку вверх, а затем стрелку влево.
   8. На экране Меню команд нажмите клавишу ВВОД. Выберите Commands PLASMA , нажав Enter. Система будет циклически проходить через следующие этапы:
      Плазменная накачка
      Стабилизация газа: На этом этапе отрегулируйте ручку газа 1 на плазменном очистителе до тех пор, пока расходомер не достигнет 10 куб. см / мин.
      Время плазмы
      Продувочная откачка
      Плазменный цикл завершен
      Вентиляционное отверстие камеры
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс должен занять примерно 5-10 минут. Когда все этапы будут завершены, на экране снова отобразится меню команд . Если во время фазы плазменной откачки давление не станет достаточно низким, плазменный очиститель не перейдет к следующему этапу, и на экране отобразится сообщение об ошибке. В этом случае проверьте масло в вакуумном насосе. Если уровень масла низкий или масло мутное/грязное, замена масла может привести к тому, что давление вакуума достигнет необходимого уровня.
   9. Перекройте главный вентиль кислородного баллона.
   10. Очень медленно поверните вентиляционный клапан в положение ON и дайте регулятору давления кислородного баллона вернуться к нулю.
   11. Поверните запорный клапан в положение ВЫКЛ .
   12. Выключите вакуумный насос и плазменный очиститель.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Гидрофильная модификация поверхности многолуночного устройства плазменным очистителем носит временный характер и становится все менее эффективной с течением времени (примерно до 2 часов). Пройдите разделы 6 и 7 как можно быстрее.

6. Заполнение скважин lmNGM

ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубатор для ванны с сухим бисером должен быть включен и предварительно нагрет, начиная с шага 5.1. Убедитесь, что температура ванны достигла 90 °C.

1. Стерилизуйте один однолунный лоток из полистирола на устройство, распылив на внутреннюю часть лотка 70% этанола и вытерев его насухо рабочей салфеткой.
2. Извлеките каждое устройство из плазменного очистителя рукой в перчатке и поместите его в очищенный лоток.
3. Поместите одноразовый таз для пипеток объемом 25 мл в инкубатор для ванны с шариками, нагрев его до 90 °C.
4. Соберите одну пробирку затвердевшей предварительной смеси lmNGM на каждое заполняемое устройство (см. шаг 1.3).
5. Поместите пробирки с предварительной смесью lmNGM в стеклянный стакан объемом 200 мл и снимите колпачки и парапленку. Разогрейте в микроволновой печи ~ 20 с, пока среда не расплавится настолько, чтобы ее можно было вылить (на этом этапе нормально наличие твердых носителей).
6. Смешайте расплавленную предварительную смесь lmNGM из нескольких пробирок в другой стерильный стакан объемом 200 мл. Продолжайте готовить в микроволновой печи еще 20 секунд, чтобы достичь в общей сложности 40 секунд. Если предварительная смесь lmNGM начинает кипеть, выключите микроволновую печь и дайте предварительной смеси lmNGM отстояться, прежде чем продолжить.
7. Выньте расплавленную предварительную смесь lmNGM из микроволновой печи и дайте ей остыть до ~60 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе носитель остынет и затвердеет через ~ 5 минут. Сразу переходите к шагам 6.8 и 6.9.
8. На каждые 10 мл предварительной смеси lmNGM добавьте следующее (по порядку): 250 мкл 1 М КП_i, 10 мкл 1 М MgSO₄, 10 мкл 1 М CaCl₂ и 10 мкл 5 мг/мл холестерина.
   1. Чтобы предотвратить вылупление яиц при наблюдении за взрослыми особями на устройстве, добавьте 10 мкл 50 мМ флоксуридина.
   2. Чтобы выбрать плазмиду РНК и индуцировать экспрессию РНК, добавьте 5 мкл 50 мг/мл карбенициллина и 12 мкл 1 мМ IPTG.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Антибиотики или другие добавки могут быть изменены в зависимости от дизайна эксперимента. На этом этапе в среду также могут быть добавлены тестовые соединения/лекарственные средства.
9. Вылейте расплавленный lmNGM в бассейн объемом 25 мл в ванне для шариков.
10. Заполните лунки устройства lmNGM с помощью многоканальной пипетки-ретранслятора 200 мкл.
    1. Настройте ретранслятор на дозирование аликвот по 14 мкл (14 мкл можно дозировать до 14 раз при использовании наконечника пипетки объемом 200 мкл).
    2. Установите пять наконечников пипетки. Лунки устройства имеют такое же расстояние, как и пластина на 384 лунки. Стандартные многоканальные дозаторы расположены таким образом, что пользователь может вводить пипетки в любую другую лунку в строке/столбце.
    3. Загрузите наконечники расплавленным lmNGM. Распределите первые 14 мкл обратно в бассейн, содержащий lmNGM.
    4. Двигаясь быстро, но осторожно, дозируйте 14 мкл во внутренние лунки (белые на рисунке 1B), начиная с тех, которые отмечены знаком «x» на рисунке 1B, и двигаясь по пластине вправо, а затем вниз, дозируя в общей сложности 12 раз (60 лунок).
    5. Вылейте оставшийся lmNGM обратно в бассейн, так как конечная аликвота обычно составляет менее 14 мкл.
    6. Повторяйте шаги 6.10.3-6.10.5 до тех пор, пока все внутренние колодцы не будут заполнены.
    7. Затем установите ретранслятор на выдачу аликвот по 15 мкл. Повторите шаги 6.10.3-6.10.5, но вместо внутренних лунок заполните крайнее внешнее кольцо лунок (серое на рисунке 1B), начиная с лунок, отмеченных знаком «+» на рисунке 1B, и двигаясь по внешнему краю пластины.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро, чтобы носитель не затвердел в наконечниках пипетки. Избегайте попадания lmNGM в ров. Наружные лунки, как правило, высыхают быстрее. Дополнительный 1 мкл lmNGM позволяет конечной высушенной скважине иметь ровную поверхность за то же время высыхания, что и внутренние лунки.
11. В качестве этапа контроля качества исследуйте каждую скважину, чтобы выявить те скважины с дефектами, которые могут мешать визуализации, включая скважины, которые недозаполнены (поверхность lmNGM погружена ниже края скважины), переполнены (поверхность lmNGM имеет куполообразную вершину) и содержат пузырьки или мусор.
12. Удалите затвердевший lmNGM из неудовлетворительных лунок с помощью короткой платиновой проволочной кирки или вакуумного аспиратора. Заполните пустые колодцы свежим расплавленным lmNGM. Кроме того, удалите все среды, которые переливались в ров, с помощью короткого платинового проволочного медиатора или вакуумного аспиратора.

7. Добавление медного купороса в ров

ПРИМЕЧАНИЕ: Колодцы этого устройства окружены сплошным рвом. Здесь ров заполнен медным купоросом, который действует как репеллент и удерживает червей от бегства из своих колодцев.

1. Используя пипетку объемом 200 мкл, дозируйте 200 мкл раствора сульфата меди (см. шаг 1.6) в ров устройства в каждом углу, по 2 раза на угол. Это должен быть достаточно большой объем, чтобы медный купорос протекал по всему рву. Будьте осторожны, чтобы ни в коем случае не переполнить ров; Медный купорос не должен касаться верхней поверхности лунок.
2. Если медный купорос не проходит легко через весь ров, используйте короткую платиновую проволоку, чтобы снять натяжение и протащить медный купорос через ров.
3. После того, как медный купорос пройдет через весь ров, удалите как можно больше медного купороса из рва с помощью пипетки объемом 200 мкл или аспирации вакуумом. Оставшегося остатка будет достаточно, чтобы удержать червей от выхода из своих колодцев. Если оставить ров заполненным раствором медного купороса, существует риск попадания сульфата меди в колодцы, что приведет к бегству червей.

8. Добавление автоклавных кристаллов воды

ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания влажности внутри пластины и предотвращения высыхания lmNGM каждое устройство окружено насыщенными водопоглощающими кристаллами полиакриламида.

1. Подготовьте кристаллы воды (см. шаг 1.7).
2. Используя бутылку для выжимки, добавьте кристаллы воды в промежутки между устройством и стенками лотка. Закройте крышку лотка и оберните все четыре стороны куском парапленки. Добавьте два дополнительных кусочка парапленки, чтобы полностью запечатать пластину.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кристаллы воды можно приготовить в стакане и зачерпнуть в лоток стерилизованной лопаткой. Однако это увеличивает время процедуры и увеличивает время, в течение которого каждый лоток открыт и подвергается воздействию потенциальных загрязнений.
3. Оставьте запечатанное устройство на скамейке до следующего дня, когда бактерии будут готовы к обнаружению. Убедитесь, что устройства хранятся колодцами вверх после добавления lmNGM.

9. Подготовка синхронизированной по возрасту популяции червей

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги дают синхронизированную популяцию червей, которые готовы к добавлению в многолуночное устройство на четвертой личиночной стадии (L4). Тем не менее, черви на разных стадиях развития также могут быть добавлены. Этот шаг должен быть выполнен за 2 дня до добавления червей в устройство, если желательны L4s. Отрегулируйте время синхронизации для желаемого жизненного этапа.

1. Для последовательных исследований старения поддерживайте C. elegans на стандартных планшетах NGM (см. шаг 1.2 при 20 ° C в хорошо откормленных условиях).
2. Получение синхронизированной популяции животных из тарелки с поголовьем стандартными методами, например, обесцвечиванием¹⁷ или временной кладкой яиц¹.
3. Добавьте изолированные яйца в тарелку NGM, отмеченную бактериями. Яйца вылупятся на этой тарелке, и черви достигнут личиночной стадии L4 через 2 дня для животных дикого типа.

10. Инокуляция бактериальной культуры

ПРИМЕЧАНИЕ: Бактерии используются в качестве основного источника пищи для C. elegans, чаще всего штаммов E. coli OP50 или HT115. Бактерии концентрируются в 10 раз, что должно учитываться в объеме подготовленной культуры. Подготовьте бактериальный посев за день до появления пятен на устройстве.

1. Из планшета LB, подготовленного на шаге 4, выберите одну колонию и инокулируйте 12 мл стерильного LB на устройство, которое необходимо обнаружить. Включите селективные агенты, если это необходимо для используемого штамма бактерий.
2. Выращивают бактериальную культуру в течение ночи (~18 ч) в инкубаторе с температурой 37 °C при встряхивании при ~250 об/мин.

11. Обнаружение лунок с концентрированными бактериями

ПРИМЕЧАНИЕ: В каждую лунку добавляется небольшой объем концентрированных бактерий, которого достаточно для питания червей в течение всей их жизни на устройстве. Бактериальную культуру необходимо высушить, прежде чем червей можно будет добавить в лунки. Поскольку объем среды в каждой лунке невелик (14-15 мкл) по сравнению с объемом добавляемых бактерий (5 мкл), химическое содержание бактериальной среды может влиять на химическую среду скважины. Чтобы объяснить это, бактерии концентрируются и ресуспендируются в соленой воде, чтобы удалить истощенный LB, избегая при этом гипоосмотического стресса. В рецепт lmNGM не добавляется соль (см. шаги 1.3-1.4), так как она добавляется на этом этапе.

1. После выращивания бактерий в течение ночи, как описано в разделе 10, сконцентрируйте бактериальную культуру в 10 раз. Гранулируют бактерии центрифугированием при ~ 3 400 x g в течение 20 мин, утилизируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу в 1/10 исходного объема культуры 142,8 мМ NaCl (см. этап 1.4). Например, чтобы обнаружить одно 240-луночное устройство, открутите 12 мл культуры и ресуспендируйте в 1,2 мл 142,8 мМ NaCl.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тестовые составы/лекарства могут быть добавлены в ресуспендированную бактериальную культуру перед обнаружением пятен.
2. Используя повторную пипетку, найдите в каждой лунке 5 мкл концентрированных бактерий. Избегайте прямого контакта с поверхностью lmNGM, так как наконечник пипетки может проткнуть lmNGM и позволить червю зарыться под поверхность скважины. Будьте осторожны, чтобы бактерии не попали в ров, потому что черви будут привлечены к нему и убегут в ров.
3. Высушите пятнистые бактерии, сняв крышки лотков. Этот шаг важен для долгосрочной целостности окружающей среды скважины, и существует множество способов сушки пятнистых устройств. Какой бы метод ни использовался, убедитесь, что устройство остается в стерильной среде, так как оно должно оставаться открытым, пока бактерии высыхают. Увеличенный воздушный поток значительно сокращает время сушки. Сушку можно выполнить, как описано ниже:
   1. Оставьте устройство открытым в чистом герметичном контейнере, например, в пластиковом контейнере, который был очищен 10% отбеливателем, а затем 70% этанолом. Такой способ сушки может занять несколько часов.
   2. Поместите открытые устройства в стерильный колпак с ламинарным потоком (аналогично предпочтительному методу, приведенному ниже).
   3. Высушите устройства с помощью специально изготовленной «сушильной камеры» (оптимизированный метод, применяемый в этом исследовании), которая может быть изготовлена с минимальными затратами с использованием вентиляторов компьютерных корпусов и фильтров HEPA (см. Дополнительный файл 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Независимо от используемого метода, этап сушки должен быть оптимизирован для местных условий. Часто контролируйте, как быстро высыхают скважины, пока не будет определено типичное время сушки. В условиях низкой влажности использование сушильной камеры приводит к времени высыхания ~ 30-40 минут. Не допускайте слишком высыхания пластин, так как среда в лунках будет сжиматься и тонуть. Лучше вынуть устройство из сушки, пока несколько лунок еще влажные, чем дать ему высохнуть дольше и потенциально пересушить большое количество лунок.
4. Проверьте кристаллы воды. Если большинство кристаллов воды в лотке высохли и потеряли объем в процессе сушки, добавьте в лоток еще больше.
5. После того, как бактерии высохнут, немедленно добавьте червей (раздел 12) или запечатайте лоток, чтобы использовать его позже. Чтобы запечатать, закройте крышку лотка и оберните все четыре стороны одним куском парапленки. Повторите дважды, чтобы получить в общей сложности три слоя Parafilm. После полного заворачивания лотка устройство можно оставить на скамейке при комнатной температуре на срок до 4 дней перед добавлением червей (раздел 12).

12. Добавление червей в многолуночное устройство

1. Вручную добавьте по одному червяку на лунку в каждую лунку, используя платиновую кирку, чтобы перенести животных с пластин червей, приготовленных в разделе 9. Выбирайте только тех червей, которые находятся на желаемой стадии жизни и возраста.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление червей в устройство может привести к высыханию lmNGM, поэтому червей следует добавлять как можно быстрее. Сбор нескольких червей (20+) одновременно перед добавлением их в колодцы устройства может помочь увеличить скорость.

13. Окончание подготовки прибора к длительному использованию

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги гарантируют, что лунки устройства останутся гидратированными на протяжении всего эксперимента.

1. Исследуйте кристаллы воды. Убедитесь, что кристаллы воды находятся на одном уровне с верхней частью устройства, но не переливаются на него. При необходимости добавьте в лоток дополнительные кристаллы воды.
2. Добавьте каплю приготовленного раствора моющего средства (см. шаг 1.5) внутрь крышки лотка и втирайте салфеткой, пока раствор моющего средства не высохнет. Это предотвращает запотевание крышки после того, как устройство запечатано внутри лотка, чтобы черви были хорошо видны.
3. Оберните лоток тремя кусочками Parafilm, используя специальную технику, которая способствует долговременной целостности пломбы Parafilm.
   1. Слегка растяните кусок парапленки так, чтобы он покрывал только две стороны лотка. Повторите это со вторым куском парапленки, чтобы покрыть две другие стороны.
   2. Наложив слой поверх первого слоя Parafilm, возьмите последний кусок Parafilm, полностью растяните его и оберните со всех четырех сторон. При правильной герметизации лунки устройства должны оставаться гидратированными в течение ~ 2 месяцев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Целостность парапленки следует контролировать каждые 1-2 недели, и парапленку следует заменить, если она повреждена.
4. Удалите отпечатки пальцев с верхней части лотка с помощью рабочей салфетки, смоченной 70% этанолом.

14. Сбор данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Целью данного исследования является описание методологии культуры. После заселения многолуночные устройства совместимы с продольным мониторингом различных фенотипов. Здесь приведены основные рекомендации по измерению нескольких наиболее распространенных параметров.

1. Продолжительность жизни: Следите за продолжительностью жизни, постукивая по тарелке или подвергая червей ярко-синему свету каждые 1-3 дня. Засчитывайте как мертвый, если не наблюдается никакого движения. Эти многолуночные устройства также совместимы с автоматизированными конвейерами визуализации и анализа для оценки срока службы^13,18.
2. Активность: Отслеживайте активность отдельных животных на протяжении всей жизни, делая статические изображения или видео животных в колодцах устройства и оценивая пройденное расстояние, скорость или другие показатели движения. Устройства также совместимы с автоматизированными конвейерами визуализации и анализа для оценки активности^13,18.
3. Размер и форма тела: Отслеживайте изменения размера и формы тела, делая статические изображения животных в лунках устройства и количественно оценивая визуальные параметры с использованием стандартных методов визуализации. В принципе, этот метод культивирования должен быть совместим с существующим программным обеспечением для более сложной оценки формы тела червя 19,20,21.

15. Повторное использование устройств

ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения эксперимента многолуночные устройства можно очистить и повторно использовать до трех раз. Дополнительное повторное использование начинает влиять на фенотипы червей, возможно, вызванное химическими веществами из среды или бактериями, накапливающимися в стенках материала PDMS.

1. Выбросьте Parafilm и извлеките устройство из лотка. Проверьте насечки в правом верхнем углу устройства, которые показывают, сколько раз оно использовалось. Если он использовался три раза, выбросьте устройство. Если он использовался менее трех раз, очистите и используйте его повторно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лотки изготовлены из полистирола и не находятся в непосредственном контакте с lmNGM, бактериями или какими-либо добавками в среду. Их можно использовать многократно, если они остаются визуально четкими.
2. Смойте с поддона оставшиеся кристаллы воды. Опрыскайте внутреннюю часть лотка 10% раствором отбеливателя и оставьте на 10 минут. Промойте деионизированной водой и сразу же высушите, чтобы избежать пятен от воды.
3. Подержите устройство под проточной водой, чтобы начать очистку среды из колодцев. Аккуратно сгибайте и скручивайте устройство под водой, чтобы помочь ослабить среду из лунок, но не сгибайте так далеко, чтобы устройство порвалось. Выделите все оставшиеся среды, застрявшие в лунках, с помощью наконечника пипетки объемом 200 мкл.
4. Наполните стакан объемом 2 л мешалкой ~ 3/4 деионизированной водой и доведите до кипения на горячей плите.
5. Добавьте в кипящую воду одно-два многолуночных устройства и мешалку. Включите магнитное перемешивание на низкую скорость (~200 об/мин), чтобы аккуратно перемешать устройства в воде. Дайте устройствам закипеть в течение 10 минут.
6. Выньте устройства из воды металлическим пинцетом и положите их хорошей стороной вниз на бумажные полотенца, чтобы они стекли. Дайте устройствам высохнуть как минимум за ночь.
7. Когда устройства полностью высохнут, заверните их в фольгу и заклейте автоклавным скотчем. Напишите на автоклавной ленте, сколько раз устройство использовалось. Автоклав на сухом цикле в течение 15 мин при 121 °C для стерилизации. Теперь устройства готовы к повторному использованию.

Культурная система WorMotel может использоваться для сбора различных данных, в том числе о продолжительности жизни, продолжительности здоровья и активности. В опубликованных исследованиях использовались многолуночные устройства для изучения продолжительности жизни и здоровья 13,14, покоя и сна 22,23,24 и поведения 25. Продолжительность жизни может быть оценена вручную или с помощью набора изображений и последующего анализа изображений. В первом подходе червей можно наблюдать вручную после стимула (например, постукивания по пластине или воздействия синего света) каждые 1-3 дня и оценивать как мертвых, если не наблюдается движения, аналогично стандартным методам на планшетахПетри 1. Последний подход аналогичен, за исключением того, что движение червя можно определить путем сравнения кадровых различий между изображениями, сделанными после применения стимула. Это дает дополнительное преимущество в том, что движение предоставляет информацию как об уровне активности отдельных животных в этот момент времени, так и обеспечивает метрику, с помощью которой можно определить продолжительность жизни (например, прекращение движения) и продолжительность здоровья (было предложено несколько определений). Изображения могут быть дополнительно использованы для извлечения дополнительных физиологических параметров, таких как размер тела, форма тела и положение тела.

Чтобы продемонстрировать возможности системы, мы изучили классическую эпистатическую взаимосвязь между рецептором инсулина, кодируемым геном daf-2, и нижестоящим фактором транскрипции семейства FOXO, кодируемым daf-16, в контексте продолжительности жизни, продолжительности здоровья и повседневной активности отдельных животных. Дикий тип (штамм N2) и daf-16 (mu68) с потерей функции (штамм CF1038) C. elegans, получавший E. coli (штамм HT115), экспрессируют либо контроль (пустой вектор; EV) или кормовые конструкции daf-2 RNAi культивировали в многолуночных устройствах, и каждое животное контролировалось на предмет продолжительности жизни (рис. 2A), продолжительности здоровья (рис. 2B) и суточной активности (рис. 2C). Активность контролировалась ежедневно путем получения серии неподвижных изображений каждые 5 с в течение 2 минут, при этом черви подвергались воздействию яркого синего света в течение 5 с в течение 1 минуты для стимуляции активности (согласно Churgin et al.13). Суточная активность для каждого животного оценивалась путем нормализации фона в колодцах и изображениях, определения области червя на каждом изображении и расчета изменения площади между соседними изображениями. Продолжительность жизни определялась как возраст, в котором в последний раз наблюдалась активность каждого червя, а продолжительность жизни определялась как возраст, в котором червь больше не мог двигаться на всю длину тела. Как и ожидалось из многочисленных предыдущих исследований (например, Kenyon et al.26, Murphy et al.27), мутация daf-16 (mu86) привела к короткой продолжительности жизни и предотвратила продление продолжительности жизни из-за нокдауна РНК-2 daf-2 (рис. 2A). Аналогичная картина наблюдалась и в отношении продолжительности жизни (рис. 2B). В качестве преимущества использования многолуночных систем культивирования, способность отслеживать отдельных животных на протяжении всей жизни позволяет детально анализировать индивидуальные вариации в каждом измеренном фенотипе в популяции. Например, различия в продолжительности жизни и продолжительности здоровья у отдельных животных можно сравнивать либо в абсолютном (рис. 2D) выражении, либо в виде доли от общей продолжительности жизни (рис. 2E). Фенотипы раннего возраста можно дополнительно сравнить с фенотипами позднего возраста, включая продолжительность жизни, у отдельных животных в популяции. Например, кумулятивная активность каждого отдельного животного на протяжении всей продолжительности жизни (т.е. площадь под кривой [AUC] для индивидуальной активности) лучше коррелировала с продолжительностью жизни (рис. 2F), чем кумулятивная продолжительность жизни до 5-го дня жизни (рис. 2G) во всех измеренных условиях. Подчеркнем, что целью данной работы является предоставление подробного протокола построения многолуночной среды для отслеживания отдельных животных с течением времени, а не для измерения конкретного фенотипа с помощью прибора. Репрезентативные результаты, представленные на рисунке 2, представляют собой лишь один пример фенотипов, которые могут быть измерены в этой системе. После создания многолуночная среда совместима с широким спектром методов измерения фенотипов свободно ползающих червей на твердых средах.

Рисунок 1: Схема микрофабрикованных многолуночных устройств . (A) Отдельные C. elegans культивируют на твердых низкоплавких питательных средах нематод (lmNGM), засеянных бактериальной пищей в отдельных лунках. Пространство между лунками покрыто аверсивным химическим веществом (сульфатом меди), чтобы изолировать каждого червя в его лунке. Каждое устройство закреплено внутри однолунного лотка. Периметр лотка заполняется кристаллами воды для поддержания влажности. Лоток герметизирован парапленкой для обеспечения кислородного обмена. Изображение создано с помощью BioRender.com. (B) Обзор многоскважинного устройства с указанием предлагаемого порядка загрузки скважин. Внутренние лунки (белые) получают 14 мкл лмНГМ. Наружные лунки (серые) получают 15 мкл лмНГМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Корреляция измеренных фенотипов в популяциях у отдельных животных с использованием многолуночных устройств. Все панели предоставляют данные одного и того же эксперимента, сравнивая четыре группы животных: животные дикого типа (N2), подверженные пустому вектору EV (RNAi) (N = 138), животные дикого типа, подверженные воздействию daf-2 (RNAi) (N = 151), животные daf-16 (mu86), подверженные EV (RNAi) (N = 123), и животные daf-16 (mu86), подверженные воздействию daf-2 (RNAi ) (N = 135). (A) Продление продолжительности жизни от daf-2 (RNAi) блокируется нулевой мутацией daf-16 (mu86). Попарная значимость между группами, определяемая логарифмическим критерием ранга (функция survdiff в R). (B) Продолжительность здоровья, определяемая здесь как день, когда животное больше не может двигаться на всю длину тела от daf-2 (RNAi), блокируется нулевой мутацией daf-16 (mu86). Попарная значимость между группами, определяемая логарифмическим критерием ранга (функция survdiff в R). (C) 3-дневное скользящее среднее значение активности на протяжении всей жизни снижается как на daf-16 (mu86), так и на daf-2 (RNAi). Значимость, рассчитанная с помощью U-критерия Манна-Уитни для сравнения площади под кривой активности на протяжении всей продолжительности жизни отдельных животных между группами. (D) Продолжительность здоровья и продолжительность жизни для каждой популяции в виде абсолютных значений (среднее значение ± стандартная ошибка среднего значения). (E) Продолжительность здоровья и продолжительность жизни для каждой популяции нормализованы к общей продолжительности жизни в каждой группе (среднее значение ± стандартной погрешности среднего значения). (F) Кумулятивная активность на протяжении всей продолжительности жизни (площадь под кривой [AUC] на протяжении всей продолжительности жизни) для отдельных животных лучше коррелирует с продолжительностью жизни, чем (G) активность отдельных животных в любой конкретный день на протяжении всей жизни (показана корреляция активности на 8-й день, представляющая точку, в которой средняя активность максимальна), рассчитанная с помощью линейной регрессии (функция lm в R). н.с. = не значимый, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Все p-значения были скорректированы для многократных сравнений с использованием метода Бонферрони для сравнений, сделанных внутри каждой панели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Файл STL для печати пресс-формы 3D-многолуночного устройства Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Авторы заявляют, что у них нет каких-либо конфликтов интересов, которые они могли бы раскрыть.