Создание и культивирование органоидов молочной железы пациента

Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее часто встречающимся злокачественным новообразованием у женщин: по оценкам, в 2022 году в Соединенных Штатах будет диагностировано 287 850 новых случаев¹. Несмотря на недавние достижения в области раннего выявления с ежегодными скринингами, таргетной терапией и лучшим пониманием генетической предрасположенности, он является второй по значимости причиной смерти от рака у женщин в Соединенных Штатах, с > 40 000 смертей ежегодно от рака молочной железы¹. Рак молочной железы в настоящее время классифицируется на несколько подтипов на основе гистопатологической и молекулярной оценки первичной опухоли. Лучшая стратификация подтипов улучшила результаты лечения пациентов с вариантами лечения для конкретных подтипов². Например, идентификация HER2 как протоонкогена³ привела к разработке трастузумаба, который сделал этот высокоагрессивный подтип управляемым у большинства пациентов⁴. Дальнейшие исследования генетики и транскриптомики этого сложного заболевания с учетом специфики пациента помогут в разработке и прогнозировании более эффективных персонализированных схем лечения для конкретного пациента ^2,5. Органоиды, полученные от пациентов (PDO), являются многообещающей новой моделью для получения информации о раке на молекулярном уровне, выявления новых мишеней или биомаркеров и разработки новых стратегий лечения ^6,7,8.

PDO представляют собой многоклеточные трехмерные (3D) структуры, полученные из недавно резецированных первичных образцов тканей ^8,9. Они выращиваются трехмерно, будучи встроенными в гидрогелевую матрицу, обычно состоящую из комбинации белков внеклеточного матрикса (ECM), и, следовательно, могут использоваться для изучения взаимодействий опухолевой клетки с ECM. PDO представляют разнообразие пациентов и повторяют клеточную гетерогенность и генетические особенности опухоли^10,11,12. Будучи моделями in vitro, они позволяют проводить генетические манипуляции и высокопроизводительные скрининги лекарств^13,14,15. Кроме того, PDO могут быть правдоподобно использованы для оценки чувствительности пациента к лекарственным средствам и стратегий лечения параллельно с клиникой и помогают прогнозировать результаты лечения пациентов^16,17,18. Помимо химиотерапии, некоторые органоидные модели также использовались для изучения индивидуальных реакций пациентов на химиолучевую терапию^19,20. Учитывая многообещающую применимость PDO для исследований и клинического использования, Национальный институт рака инициировал международный консорциум The Human Cancer Models Initiative (HCMI)²¹ для создания и предоставления этих новых моделей рака, полученных из опухолей. Многие из органоидных моделей различных типов рака, разработанных с помощью HCMI, доступны через Американскую коллекцию типовых культур (ATCC)²².

Было показано, что нормальные органоиды молочной железы состоят из различных популяций эпителиальных клеток, присутствующих в молочной железе ^11,23, и, таким образом, служат отличными моделями для изучения основных биологических процессов, анализа мутаций-драйверов, вызывающих онкогенез, и для исследований происхождения раковых клеток ^6,15 . Органоидные модели опухолей молочной железы были использованы для идентификации новых мишеней, которые обнадеживают перспективы для разработки новых методов лечения, особенно для резистентных опухолей^24,25,26. Используя ксенотрансплантат пациента (PDX) и соответствующие модели органоидов, полученных из PDX (PDxO) резистентных к лечению опухолей молочной железы, Guillen et al. показали, что органоиды являются мощными моделями для точной медицины, которые могут быть использованы для параллельной оценки реакции на лекарства и принятия решений о прямой терапии²⁸. Кроме того, разработка новых методов совместного культивирования ЗОП с различными иммунными клетками^27,28,29, фибробластами 30,31 и микробами ^32,33 дает возможность изучить влияние микроокружения опухоли на прогрессирование рака. В то время как многие такие методы совместного культивирования активно внедряются для PDO, полученных из опухолей поджелудочной железы или колоректальных опухолей, аналогичные установленные методы совместного культивирования PDO молочной железы были зарегистрированы только для естественных клеток-киллеров³⁴ и фибробластов³⁵.

Первый биобанк из >100 органоидов, полученных от пациентов, представляющих различные подтипы рака молочной железы, был разработан группой Ханса Клеверса^36,37. В рамках этих усилий группа Clevers также разработала первую сложную питательную среду для роста органоидов молочной железы, которая в настоящее время широко используется³⁶. Последующее исследование предоставило всесторонний отчет о создании и культивировании PDO молочной железы и органоидных ксенотрансплантатов, полученных от пациентов (PDOX)³⁸. Лаборатория Welm разработала большую коллекцию моделей BC PDX и PDxO, которые культивируются в сравнительно более простой питательной среде, содержащей эмбриональную бычью сыворотку (FBS) и меньшее количество факторов роста^39,40. Мы независимо разработали и охарактеризовали большой массив наивных моделей органоидов рака молочной железы¹¹ и участвовали в разработке моделей BC PDO в рамках инициативы^{HCMI 21}. Здесь мы стремимся предоставить практическое руководство с подробным описанием методологии, используемой нами при создании систем моделей органоидов молочной железы, полученных от пациентов.

Резекции опухолей у пациентов с раком молочной железы вместе с дистальными и прилегающими нормальными тканями были получены от Northwell Health в соответствии с протоколами Институционального наблюдательного совета IRB-03-012 и IRB 20-0150 и с письменного информированного согласия пациентов.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, упомянутые ниже, были выполнены в комнате культуры тканей млекопитающих BSL2, предназначенной для образцов пациентов, после одобрения комитета по биобезопасности. Все процедуры должны выполняться в соответствии с протоколами безопасности, поддерживающими асептические условия в шкафах биобезопасности. Каждая стадия центрифугирования выполняется при комнатной температуре (RT), если не указано иное. Ткани / органоиды и матричные запасы базальной мембраны всегда помещаются на лед, если не указано иное. Новые тарелки инкубируют в течение ночи для предварительного разогрева. Нанесение куполов на предварительно разогретые плиты обеспечивает наилучшие результаты для получения округлых куполов, которые не сплющиваются при нанесении покрытия или не отрываются позже от поверхности плиты.

1. Средняя подготовка и рецепты

1. Подготовьте кондиционированную среду R-спондин1, как описано ниже (в качестве альтернативы можно купить в продаже).
   1. Приготовьте две отдельные питательные среды, состоящие из модифицированной среды орла (DMEM) Дульбекко, 10% FBS, 5% пенициллина-стрептомицина и с добавлением цеоцина 300 мкг / мл или без него.
   2. Разморозьте флакон с клетками HEK293T-HA-Rspondin1-Fc (полученными в лаборатории Кельвина Куо в Стэнфордском университете, а также коммерчески доступными) в колбе для культуры тканей размером 75 см² с 15 мл среды.
   3. Разделите клетки на 2 колбы для культивирования^{размером 2} x 175 см, каждая из которых содержит 35 мл среды, содержащей цеоцин.
   4. Снова пройдите через ячейки, чтобы получить столько колб, сколько необходимо для получения желаемой партии кондиционированной среды R-спондина1. Используйте питательную среду без зеоцина.
   5. Когда колбы, содержащие среду без зеоцина, сливаются, удалите и замените питательную среду Ad-DF+++ (этап 1.2; Таблица 1). Поместите клетки в инкубатор с температурой 37 °C с 5%_CO2 на 1 неделю.
   6. Открутите среду до 400 x g в течение 5 минут, чтобы удалить все неприкрепленные клетки. Отфильтруйте среду через фильтр 0,22 мкм. Сделайте аликвоты объемом 25 мл и храните их при температуре -20 °C (можно хранить до 6 месяцев).
   7. Используя клетки HEK293T, проведите двойной анализ люциферазы TOPFLASH^41,42 с использованием коммерческого реагента для трансфекции ДНК с соотношением реагента к ДНК 4,8: 1 с разбавителем DMEM (высокое содержание глюкозы^, пируват). Добавьте 100 мкл кондиционированной среды R-спондина1 (или базальной среды для отрицательного контроля) к 100 мкл трансфицированных клеток. Затем выполните двойной анализ люциферазы в соответствии с протоколом производителя, чтобы проверить активность Wnt кондиционированной среды R-спондин1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В анализе используется плазмида TOP со считыванием активности люциферазы Firefly, а плазмида FOP используется в качестве отрицательного контроля.
2. Подготовьте базальную среду (среда Ad-DF+++, как ранее было опубликовано Sachs et ^al.36).

   Реагент	Концентрация запасов	Окончательная концентрация
   Усовершенствованный DMEM/F12	1x	1x
   ГлутаМакс	В 100 раз	1x
   ХЕПЕС	1 м	10 мМ
   Пенициллин-стрептомицин	10 000 ЕД/мл; 10 000 мкг/мл	100 ЕД/мл; 100 мкг/мл

   
   Таблица 1: Базальный состав среды Ad-DF+++.
3. Подготовьте полную среду для органоидов молочной железы, полученных от пациента, как ранее было опубликовано Sachs et ^al.36.

   Реагент	Концентрация запасов	Окончательная концентрация
   Среда Ad-DF+++	1x	1x
   Р-спондин на собственном производстве	100%	10%
   Дополнение B-27	В 50 раз	1x
   Никотинамид	1 м	5 мМ
   НАК	500 мМ	1,25 мМ
   Примоцин	50 мг/мл	50 мкг/мл
   Башка	100 мкг/мл	100 нг/мл
   ЭФР человека	5 мкг/мл	5 нг/мл
   Герегулин человека β1/Неврегулин1	75 мкг/мл	37,5 нг/мл
   Y-27632 дигидрохлорид (Rho-киназа)	100 мМ	5 мкМ
   А83-01	5 мМ	500 нМ
   Человеческий FGF-7	100 мкг/мл	5 нг/мл
   Человеческий FGF-10	1 мг/мл	20 нг/мл
   П38И	30 мМ	498 нМ

   
   Таблица 2: Полный состав среды для органоидов молочной железы пациента.
4. Приготовьте 2 мг/мл раствора коллагеназы внутривенно, взвесив необходимое количество порошка коллагеназы IV и солюбилизировав его в базальной среде Ad-DF+++. Перед использованием фильтр процедите через фильтр 0,22 мкм.
5. Приготовьте 0,5% раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) из 7,5% исходного раствора, используя 1x фосфатный буферный физиологический раствор Dulbecco (DPBS) в качестве разбавителя. Перед использованием фильтр процедите через фильтр 0,22 мкм.

2. Определение опухоли молочной железы / нормальных органоидов из резецированной ткани (рис. 1)

1. Транспортируйте хирургически резецированный образец опухоли молочной железы / нормальной ткани в лабораторию в конической пробирке объемом 50 мл, содержащей Ad-DF+++. Храните пробирку на льду до начала изоляции.
2. Разморозьте бутылку матрицы базальной мембраны на льду или на ночь при температуре 4 °C.
3. Перенесите резецированную ткань в стерильную чашку Петри диаметром 10 см. Осмотрите ткань макроскопически и отметьте, кажется ли она морфологически жирной, васкуляризированной или некротической. Дополнительно запишите размер и форму ткани. В идеале сфотографируйте ткань с линейкой в поле зрения (рисунок 2).
4. Измельчите ткань на очень мелкие кусочки (~ 1 мм³) стерильным скальпелем No 10 и перенесите ее в коническую пробирку объемом 50 мл.
5. Добавьте 10 мл 2 мг / мл раствора коллагеназы для внутривенного введения и запечатайте пробирку прозрачной пленкой. Поместите трубку на орбитальный шейкер при 37 °C при 140 об/мин на 30-90 мин под углом (угол ~30°).
6. Во время инкубации поместите аликвоту полной среды для предварительного нагрева на водяной бане с температурой 37 °C.
7. Каждые 15 минут ресуспендируйте ткань, энергично перемешивая вверх и вниз стерильной серологической пипеткой объемом 5 мл. Предварительно покройте пипетку 0,5% раствором BSA, чтобы предотвратить потерю ткани, вызванную прилипанием образца к пипетке. Отслеживайте диссоциацию с течением времени, наблюдая за конической трубкой под микроскопом при 5-кратном или более увеличении.
8. После диссоциации ткани центрифугу при 400 x g в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость, добавьте 10 мл Ad-DF+++ и центрифугу при 400 x g в течение 5 мин.
9. Тщательно выбросьте надосадочную жидкость. Гранулы ткани иногда могут быть рыхлыми, поэтому будьте осторожны при аспирации. Повторите этот шаг еще раз.
10. Если тканевая гранула частично красная, добавьте 2 мл буфера для лизиса эритроцитов и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре. Не стоит инкубировать дольше, так как это значительно снизит жизнеспособность клеток.
11. Добавьте 10 мл Ad-DF+++ в пробирку, центрифугу при 400 x g в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте гранулы в 50-300 мкл неразбавленной холодной матрицы базальной мембраны и тщательно перемешайте пипеткой, чтобы избежать образования пузырьков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем добавляемой матрицы базальной мембраны зависит от размера гранул. Если вы не уверены, поместите небольшой купол ~ 10 мкл из ресуспендированной гранулы и наблюдайте за слиянием под микроскопом. Отрегулируйте, добавив больше матрицы базальной мембраны, если это необходимо. На рисунке 3 (изображение 1-го дня) приведена эталонная плотность посева.
12. Пластина 300 мкл матричного купола базальной мембраны, содержащего органоиды в каждой лунке предварительно разогретой, меченой, 6-луночной пластины для культивирования тканей. В таблице 3 приведены рекомендуемые матрицы базальной мембраны и средние объемы при использовании разных пластин.

    Количество лунок на плиту	Матрица базальной мембраны на купол (мкл)	Среда на лунку (мкл)
    6	300	3000
    12	100	1000
    24	50	500
    48	25	250
    96	10 (подвеска вместо купола)	100

    
    Таблица 3: Рекомендуемое количество матрицы базальной мембраны и питательной среды на скважину в зависимости от размера пластины.
13. Оставьте пластину нетронутой в колпаке на 5 минут, а затем осторожно поместите в инкубатор при температуре 37 °C на 20-30 минут, чтобы купол матрицы базальной мембраны полностью затвердел.
14. Добавьте 3 мл предварительно подогретой полной среды по каплям в каждую лунку 6-луночной пластины и поместите в инкубатор при температуре 37 ° C и 5% CO₂. Сделайте снимки органоидов с помощью 5-кратного объектива на инвертированном светлопольном микроскопе.
15. Пополняют среду каждые 4-8 дней исходя из роста органоидов. Тщательно аспирируйте старую среду, не нарушая купола, и добавьте свежую, предварительно разогретую среду по каплям.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол одинаков для установления органоидов рака молочной железы, полученных из резецированной опухоли, и для нормальных органоидов, полученных из резецированной здоровой ткани молочной железы (либо из соседней и нормальной ткани молочной железы той же пациентки, либо из здоровой ткани молочной железы, полученной в результате операции редукционной маммопластики).

3. Пассирование и расширение органоидов молочной железы, полученных от пациентов, в культуре

1. Разморозьте бутылку матрицы базальной мембраны на льду или на ночь при температуре 4 °C.
2. Поднимите матричный купол базальной мембраны в среду в лунке с помощью клеточного скребка или наконечника пипетки объемом 1 мл.
3. Предварительно покройте наконечник пипетки 0,5% раствором BSA, а затем перенесите плавающий купол органоидов со средой в коническую пробирку объемом 15 мл или 50 мл, в зависимости от количества собираемых лунок. Для более чем двух скважин, содержащих 300 мкл матричных куполов базальной мембраны, используйте коническую трубку объемом 50 мл. Добавьте 1x DPBS, чтобы увеличить объем как минимум до 5 мл.
4. Отжимайте тюбики при дозе 400 х г в течение 5 мин. Матрикс базальной мембраны с органоидами образует слой на дне. Тщательно аспирируйте, чтобы удалить надосадочную жидкость.
5. Добавьте 5-20 мл 1x DPBS, в зависимости от количества лунок, объединенных в пробирку. Предварительно покройте стерильную одноразовую пипетку 0,5% BSA и равномерно перемешайте гранулы матрицы органоидно-базальной мембраны в DPBS путем пипетки вверх и вниз.
6. Отжимайте тюбики при дозе 400 х г в течение 5 мин. Тщательно аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость.
7. Добавьте в пробирку реагент для диссоциации клеток, в три раза превышающий объем матрицы базальной мембраны. Используя наконечник пипетки, покрытый 0,5% BSA, ресуспендируйте органоиды в реагенте для диссоциации клеток.
8. Поместите трубку на орбитальный шейкер при 37 °C при 140 об/мин на 8-15 мин в угловом положении. Контролируйте пробирку, наблюдая за ней под микроскопом каждые 5 минут, чтобы убедиться, что органоиды разбиты на более мелкие кластеры.
9. Добавьте базальную среду (т.е. Ad-DF+++) в объеме, равном или превышающем реагент для диссоциации клеток, и пипетку смешайте органоиды. Отжим при 400 x g в течение 5 мин при RT для получения органоидной гранулы.
10. Если гранула содержит органоиды, все еще встроенные в нерастворенную матрицу базальной мембраны, повторите шаги 3,7-3,9 для дополнительных 5-8 минут трипсинизации.
11. Как только будет получена белая органоидная гранула без нерастворенной матрицы базальной мембраны, выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 1 мл Ad-DF+++, чтобы ресуспендировать гранулу путем пипетирования. Затем добавьте больше Ad-DF+++ до 10 мл.
12. Отжим при 400 x g в течение 5 минут при RT для этапа стирки. Аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость.
13. Добавьте необходимое количество матрицы базальной мембраны к расщепленным органоидам на основе соответствующего коэффициента расщепления (это будет широко варьироваться для каждой линии органоидов в зависимости от скорости роста). На рисунке 3 (изображение 1-го дня) приведен пример плотности посева. Перемешайте, аккуратно пипеткой вверх и вниз, чтобы избежать образования пузырьков. Сразу же выложите на лед.
14. Откройте и пометьте предварительно разогретую 6-луночную тарелку. Рекомендуется установить купол объемом 10-20 мкл в углу лунки, чтобы наблюдать слияние под микроскопом. Если органоиды сливаются, можно добавить больше матрицы базальной мембраны, чтобы увеличить коэффициент расщепления.
15. Пластинчатые купола органоидов объемом 300 мкл, ресуспендированные в матрице базальной мембраны. Убедитесь, что трубка остается на льду при обшивке нескольких лунок, чтобы матрица базальной мембраны оставалась в растворе.
16. Оставьте тарелку нетронутой в вытяжке на 5 минут, а затем осторожно поместите в инкубатор с температурой 37 °C с 5% CO₂ , не нарушая купола.
17. Через 20-30 мин купола затвердевают. Добавьте по 3 мл предварительно подогретой полной среды в каждую лунку и поместите тарелку обратно в инкубатор. Добавляйте свежую полноценную среду каждые 5-7 дней. Проведите рутинное тестирование культур на предмет выявления микоплазменного загрязнения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол культивирования опухолей молочной железы и нормальных органоидов одинаков. Однако, по нашему опыту, нормальные органоиды, как правило, хорошо растут до прохода 6-8, прежде чем замедлиться. Желательно сделать как можно больше запасов раннего прохода для будущих исследований.

4. Замораживание органоидов молочной железы, полученных от пациента

1. Проход сливающихся лунок органоидов для удаления любой базальной мембраны матрицы, как указано в шагах 3.1-3.12.
2. Ресуспендируют гранулы органоидов в среде для замораживания клеток (размороженной в течение ночи при 4 ºC) с 1 мл среды на 200-300 мкл объема матрикса базальной мембраны перед пассажем. Выполните подсчет ячеек перед замораживанием для справки. Аликвотируйте небольшой объем (не менее 100 мкл) клеток для дальнейшей трипсинизации, если это необходимо, чтобы получить единичные клетки, а затем подсчитайте их с помощью счетчика клеток.
3. Перенесите 1 мл клеток в криовиалы объемом 2 мл, помеченные номером органоидной линии, датой и номером прохода. Обязательно пометьте пробирки перманентным маркером или используйте криометки.
4. Переместите флаконы в контейнер для замораживания клеток и перенесите контейнер в морозильную камеру с температурой -80 °C. После инкубации в течение ночи флаконы готовы к перемещению в морозильную камеру для хранения жидкого азота для длительного хранения.

5. Размораживание органоидов молочной железы, полученных от пациента

1. Разморозьте бутылку матрицы базальной мембраны на льду или на ночь при температуре 4 °C. Предварительно разогрейте среду Ad-DF+++ при температуре 37 °C. Аликвот 9 мл предварительно подогретой среды в конические пробирки по 15 мл для каждого замороженного флакона.
2. Быстро разморозьте замороженный флакон с органоидами, поместив его в ванну с шариками при температуре 37 °C. Распылите 70% этанол и перенесите трубку в шкаф биобезопасности.
3. Промойте наконечник пипетки 0,5% раствором BSA, чтобы избежать потери органоидов. Аккуратно перемешайте размороженные органоиды, пипеткой вверх и вниз, чтобы смешать все осевшие органоиды в пробирке.
4. Аккуратно перенесите 1 мл замороженных органоидов в 9 мл предварительно подогретого Ad-DF+++ по каплям. Отжимайте клетки при 400 x g в течение 5 мин, а затем осторожно выбросьте надосадочную жидкость.
5. Вымойте гранулы, добавив 10 мл свежего предварительно подогретого Ad-DF+++ в органоидную гранулу, и аккуратно перемешайте пипеткой, предварительно покрытой 0,5% BSA, чтобы ресуспендировать гранулы. Закрутите клетки при 400 х г в течение 5 мин и осторожно выбросьте надосадочную жидкость.
6. Поместите органоидную гранулу на лед и осторожно удалите остатки Ad-DF+++, используя наконечник пипетки меньшего объема. Ресуспендировать гранулу в 300 мкл матрицы базальной мембраны и пластины в предварительно разогретой 6-луночной пластине. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C с 5%_CO2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется поместить небольшой купол объемом 10 мкл из ресуспендированной гранулы в углу лунки, чтобы различить слияние под микроскопом. Если органоиды выглядят сливающимися, разбавьте, добавив 300 мкл матрицы базальной мембраны на пластину в две лунки 6-луночной пластины.
7. После 20-30-минутной инкубации добавьте 3 мл предварительно подогретой полной среды в затвердевший купол.

Мы создали биобанк органоидов опухолей молочной железы, полученных от пациентов, включающий различные подтипы11. Кроме того, мы установили несколько нормальных органоидных линий молочной железы, полученных из образцов тканей редуктивной маммопластики или смежной/дистальной нормальной груди у пациентов с РМЖ, используя подход, описанный на рисунке 1.

Различные органоидные линии опухолей молочной железы, полученные от пациентов, различаются по морфологии (рис. 2) и скорости роста (рис. 3). Нормальные органоиды молочной железы и несколько установленных нами органоидов, полученных из ранней протоковой карциномы in situ (DCIS), напоминают нормальную структуру молочной железы с центральным просветом, окруженным протоковыми клетками (рис. 2A, B). Органоиды, полученные из инвазивной лобулярной карциномы (рис. 2C), имеют тенденцию образовывать слабо прикрепленные виноградные грозди, как сообщалось ранее в других лабораториях36,43. Между тем, органоиды, полученные из инвазивных протоковых карцином (гормональный рецептор-положительный и тройной отрицательный рак молочной железы), имеют тенденцию образовывать плотные, большие и круглые органоиды (рис. 2D, E). Органоиды фиксировали 4% параформальдегидом с последующим встраиванием в 2% агарозные формы. Затем в них вставляли парафин, а срезы размером 10 мкм окрашивали гематоксилином и эозином (как описано в Bhatia et al.11) для наблюдения за морфологией.

Чтобы продемонстрировать различия в скорости роста различных органоидных линий опухоли молочной железы, полученных от пациентов, 1000 жизнеспособных одиночных клеток были помещены в 10% суспензионный раствор матричного матрикса базальной мембраны на 96-луночную пластину, с шестью репликами для определения жизнеспособности клеток в разные моменты времени для мониторинга роста в течение 12 дней (рис. 3B ). Образование органоидов измеряли с помощью анализа жизнеспособности люминесцентных клеток на 3, 6, 9 и 12-й дни с базовым показанием на 1-й день после нанесения покрытия. На рисунке 3А показаны изображения в светлом поле тех же органоидов, расширенных в 6-луночных пластинах с течением времени. Некоторые линии органоидов, полученные от пациентов, имеют время удвоения 2 дня, в то время как некоторые занимают 5 дней (рис. 3B).

Рисунок 1: Установление органоидов молочной железы, полученных от пациента. (A) Схематическое изображение основных этапов в установлении опухолей молочной железы или нормальных органоидов, полученных от пациентов. (B) Репрезентативные изображения, показывающие рост органоидов опухоли молочной железы, полученных от пациентов DS117T, от укоренения (отрывок 0) до долгосрочного культивирования (пассаж 12). Синие стрелки = волокнистый материал, желтые стрелки = мусор / мертвые клетки, а красные стрелки = поддерживающие типы клеток из микроокружения (в основном фибробласты). Масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Органоиды молочной железы, полученные от пациентов, представляющие различные подтипы. Верхняя панель: морфологические различия между органоидными линиями, полученными из опухолей молочной железы пациенток (B-E) различных гистопатологических и молекулярных подтипов. (A) На рисунке представлены органоиды, полученные из нормальной ткани молочной железы человека, полученной после операции по восстановительной маммопластике. Масштабная линейка = 50 мкм. Нижняя панель: окрашенные H&E изображения тех же линий органоидов. Масштабная линейка = 100 мкм. Аббревиатура: TNBC = тройной негативный рак молочной железы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Рост в культуре различных органоидов опухолей молочной железы, полученных от пациентов. Репрезентативные изображения яркого поля и кривые жизнеспособности клеток (A и B), измеренные с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности клеток, показывающего рост в культуре различных органоидных линий опухоли молочной железы пациента в течение 12 дней. Масштабная линейка = 50 мкм. Полосы погрешностей представляют собой SEM для n = 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.