Пассивная система тестирования тыльного сгибания голеностопного сустава для модели in vivo тендинопатии, вызванной чрезмерным использованием

Поскольку сухожилия соединяют мышцы с костью и испытывают ежедневные повторяющиеся движения на протяжении всей своей жизни, они очень склонны к травмам, которые являются болезненными и ограничивающими и приводят к нарушению механической функции, затрагивая 30-50^{% населения.} Тендинопатии - это хронические состояния, которые считаются травмами из-за повторяющихся усталостных движений и неадекватного заживления до уровня, существовавшего до травмы. Обычно поражаются как верхние, так и нижние конечности, включая вращательную манжету плеча, локоть, ахиллово сухожилие и сухожилие надколенника 2,3,4,5. Тендинопатия ахиллова сухожилия часто встречается при занятиях, связанных с бегом и прыжками, особенно у спортсменов, занимающихся легкой атлетикой, бегом на средние и длинные дистанции, теннисом и другими видами спорта с мячом, поражая 7-9% бегунов ^6,7. Травмы, полученные при беге и прыжках, также могут вызвать ограниченное тыльное сгибание голеностопного сустава, что является фактором риска развития ахиллов и надколенниковых тендинопатий ^8,9,10. Таким образом, существует необходимость в лучшей оценке и характеристике тендинопатии, которую это исследование может предоставить в качестве крысиной модели пассивного тыльного сгибания голеностопного сустава при травмах ахиллова сухожилия.

Предыдущая работа с использованием моделей мелких животных была направлена на изучение развития и маркеров тендинопатии. К ним относятся упражнения на беговой дорожке, повторяющиеся упражнения, прямая нагрузка на сухожилия, инъекции коллагеназы, хирургическое вмешательство и исследования in vitro 11,12,13,14,15,16. Несмотря на то, что в литературе удалось выявить маркеры повреждений при использовании этих моделей тендинопатии, ограничения включают нагрузку на сухожилие при нефизиологически значимых движениях сустава, как в случае прямой нагрузки на сухожилие, без прямого измерения приложенных нагрузок, например, для исследований на беговой дорожке, и отказ от физиологического чрезмерного использования, как в случае инъекций коллагеназы. среди прочих. С этой целью данное исследование было направлено на разработку системы, которая неинвазивно применяет количественные нагрузки к ахиллову сухожилию с применением для исследований тендинопатии, вызванной чрезмерным использованием, чтобы заполнить пробелы в ранее разработанных моделях тендинопатии на мелких животных. Мы провели пилотное исследование, чтобы продемонстрировать, что система вызывает воспроизводимые изменения механических свойств в течение ряда циклов нагружения. Эта система позволяет физиологически значимым движениям и нагрузкам вызывать чрезмерную нагрузку, одновременно количественно оценивая и измеряя силы, приложенные к сухожилию и испытываемые им во время режима нагрузки.

Это исследование было проведено с одобрения Комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) в медицинском центре Beth Israel Deaconess. Животных обезболивали с использованием 5% изофлурана для индукции и 2,5% для поддерживающей терапии, а также соблюдали меры предосторожности, чтобы избежать гипотермии.

1. Настройка системы тестирования

1. Управляйте пассивным вращением голеностопного сустава с помощью шагового двигателя для обеспечения стабильного вращения и крутящего момента. Управление шаговым двигателем с помощью микроконтроллера. Используйте входные данные из 3D-системы позиционирования и ориентации, чтобы отметить градусы поворота. Используйте выходы датчика крутящего момента для обеспечения управления обратной связью для увеличения угла тыльного сгибания, если предел порога не достигнут.
2. Для начала подключите микроконтроллер, датчик крутящего момента, систему 3D-электромагнитного позиционирования и ориентации к компьютеру и источнику питания. Управляйте системой, созданной по индивидуальному заказу, с помощью кода MATLAB, разработанного компанией (рис. 1). Скачайте файлы кода MATLAB с GitHub и следуйте конкретным инструкциям по запуску кода со страницы инструкций на GitHub (https://github.com/Nazarian-Lab/PassiveAnkleDorsiflexionSystem).
3. Откройте MATLAB с файлами кода. Откройте программное обеспечение PDImfc, чтобы подключить систему 3D электромагнитного позиционирования и ориентации к программе MATLAB. Нажмите Подключить | Непрерывный P&O | StartSockExport(). Держите приложение открытым в фоновом режиме.

2. Ex-vivo и посмертно

1. Усыпить шесть 13-недельных крыс Спрэга-Доули с помощью ингаляции CO₂ и вторичного метода эвтаназии с помощью торакотомии. Рассекают правое ахиллово сухожилие с неповрежденным пяточным и миотендинозным соединением. Заморозьте при -20 ° C, чтобы позже провести механические испытания. После того, как сухожилие разморожено, мелко рассечено и подготовлено к механическим испытаниям, выполняют нагружение на растяжение до разрушения для получения предела прочности на растяжение (UTS) сухожилия (преднатяг до 0,1 Н, предварительное кондиционирование на 10 циклов от 0,1 - 1 Н, нарастание до разрушения при постоянном смещении 0,1 мм/с). Используйте 15% UTS в качестве входных данных для системы, чтобы выполнить предварительную подготовку для более позднего этапа, как описано в шаге 3.4.
2. Усыпите еще одну группу из пяти животных с помощью той же процедуры измерения мгновенной руки и напряжения. Сделайте рентген левой ноги с тыльным сгибанием голеностопного сустава на 90° рядом с линейкой в качестве ориентира. Откройте рентгеновское изображение на Фиджи, используя линейку на изображении в качестве эталона, измерьте сухожильный момент руки от центра вращения голеностопного сустава до задней части голеностопного сустава, чтобы использовать его в качестве входных данных в коде MATLAB для преобразования входной силы для предварительного обусловливания, описанного в шаге 2.1, в соответствующее значение крутящего момента, а также преобразования между выходным крутящим моментом и силой для анализа данных.
3. Обездвижьте левую заднюю конечность, наложив две шины, чтобы полностью разгибать колено. Слегка сгибайте голеностопный сустав, надавливая на пальцы ног, чтобы убедиться, что вращение голеностопного сустава происходит за счет изолированного сухожилия, а не за счет окружающих мягких тканей и находится в напряжении. Если он не натянут или есть движение в колене, наложите шину на повторную ленту.
4. Обнажите сухожилие, удалив кожу вокруг ахиллова сухожилия. Нанесите клей на алюминиевую бусину размером 1/32 дюйма, поместите ее на свободное сухожилие, ближайшее к миотендинному соединению ахиллова сухожилия, и используйте ватный тампон с физиологическим раствором, чтобы удалить излишки клея. Многократно наносите физраствор на ахиллово сухожилие на протяжении всей оставшейся процедуры, чтобы обеспечить влажность тканей.
5. Измерьте площадь поперечного сечения сухожилия с помощью цифрового штангенциркуля, прежде чем прикладывать какую-либо нагрузку. Предположим, что сухожилие представляет собой эллипс, и измерьте ширину и толщину в трех экземплярах.
6. Поместите крысу на платформу для всего тела в положении лежа. Закрепите лодыжку на приводе сустава с помощью стяжки-молнии вокруг лодыжки и еще одной вокруг пальцев ног, а колено закрепите двумя стяжками. Поверните ось так, чтобы голеностопный сустав находился в полном подошвенном сгибании.
7. Подключите перо оцифровки электромагнитной системы позиционирования и ориентации 3D к компьютеру и включите питание.
8. Запустите системный код (более подробно описанный в шаге 3) для указанного количества циклов (в этом исследовании шесть усыпленных крыс получили 7200 циклов).
9. При 0, 500, 1000, 2000, 3600 и 7200 циклах для измерений деформации ex vivo приостановите режим циклического нагружения и измерьте длину сухожилия от пяточной кости до алюминиевого шарика с шагом 5° от 0 до 40° тыльного сгибания (предел срабатывания из-за физических ограничений системы) с помощью 3D-оцифровывающего пера в трех экземплярах попеременно.
10. Рассчитайте деформацию сухожилия под различными углами, используя длины, полученные на шаге 2.9, где начальная длина равна тыльному сгибанию 0° для каждого номера цикла. Выполните линейную подгонку, чтобы получить зависимость между углом тыльного сгибания и деформацией на каждом номере цикла. Используйте эту связь для преобразования необработанных данных угла в деформацию для анализа данных.
11. Рассчитайте площадь поперечного сечения сухожилия с помощью цифрового штангенциркуля при тыльном сгибании 40°, предполагая несжимаемость (постоянный объем) с измерениями длины сухожилия под углом 0° и 40° и измеренной площадью поперечного сечения при 0°. Используйте эту площадь поперечного сечения в каждом количестве циклов, чтобы преобразовать силу в напряжение для анализа данных (напряжение = сила / площадь поперечного сечения).

3. Протокол механического нагружения

1. Для этой части исследования мы использовали 25 самок 11-недельных крыс Sprague-Dawley, по 5 крыс были случайным образом распределены для получения 500, 1000, 2000, 3600 или 7200 циклов усталостной нагрузки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительная подготовка, первоначальная калибровка, а также предварительное и последующее измерение занимают около 15 минут, а режим циклического усталостного нагружения занимает 1 секунду за цикл. Таким образом, самое длительное время, в течение которого крыса находится под наркозом, составляет около 2 часов, что было выполнено в соответствии с протоколами, одобренными IACUC.
2. Подключите микроконтроллер, датчик крутящего момента, систему 3D-электромагнитного позиционирования и ориентации к компьютеру и источнику питания. Управляйте системой, созданной по индивидуальному заказу, с помощью кода MATLAB, разработанного компанией (рис. 1).
3. Включите компьютер и откройте MATLAB с файлами кода. Откройте программное обеспечение PDImfc, чтобы подключить систему 3D электромагнитного позиционирования и ориентации к программе MATLAB. Нажмите Подключить | Непрерывный P&O | StartSockExport(). Держите приложение открытым в фоновом режиме.
4. Индуцируют анестезию 5% изофлураном путем ингаляции в индукционной камере. После индукции закрепите животное на платформе всего тела с помощью нагревательного элемента на водной основе, прикрепленного для поддержания температуры и анестезии 2,5% изофлураном через насадку на носовой конус. Наносите влажную мазь на глаза, чтобы не допустить сухости во время анестезии.
5. Поместите крысу на платформу для всего тела в положении лежа. Закрепите лодыжку на приводе сустава с помощью стяжки-молнии вокруг лодыжки и еще одной вокруг пальцев ног, а колено закрепите двумя стяжками. Поверните ось так, чтобы голеностопный сустав находился в полном подошвенном сгибании.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что застежки-молнии не вызывают сужения или повреждений, будьте осторожны при затягивании и, при необходимости, поместите марлю между стяжкой и кожей для слоя защиты.
6. Для следующих шагов, связанных с выполнением системного кода, нажмите кнопку Run on MATLAB для каждого раздела кода, соответствующего конкретному нагрузочному тесту.
7. Цикл лодыжки от 50 раз до 15% от предельного растягивающего напряжения на основе значения предельного растягивающего напряжения ахиллова сухожилия от растяжения ex vivo до испытаний на разрушение, измеренных на этапе 2.1.
8. Выполните первичную калибровку сухожилия, трижды сгибнув его до 12°. Используйте наклон линейной области области нагружения кривой гистерезиса для вычисления экспоненциальной области кривой.
9. Постепенно сгибайте голеностопный сустав под возрастающими углами до тех пор, пока не будет получена экспоненциальная область кривой путем вычисления наклона пика области нагрузки кривой (рассчитанного с использованием разработанного нами кода MATLAB) или до тех пор, пока она не будет повернута на 40°, в зависимости от того, что произойдет раньше.
10. При окончательном полученном угле выполните пять циклических механических измерений в качестве базовой линии предварительного натяга.
11. Выполняйте режим циклического усталостного нагружения в течение заданного количества циклов (в данном исследовании для 500, 1000, 2000, 3600 или 7200 циклов).
12. Каждые 50 циклов вычисляйте наклон нагруженной части кривой гистерезиса (рассчитанный с помощью разработанного нами кода MATLAB), чтобы убедиться, что она все еще находится в экспоненциальной области. Увеличьте угол тыльного сгибания на 1°, если он уже не равен 40°, пока не будет достигнута эта экспоненциальная область.
13. После завершения циклического нагружения выполните пять циклических механических измерений в качестве измерений после нагружения под изначально выбранным углом для измерения механических свойств сухожилий.
14. Снимите застежки-молнии и шину. Верните животное в камеру восстановления. Животное не оставляют без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание, после чего его возвращают в клетку. Ежедневно наблюдайте за животными на предмет любых неблагоприятных клинических признаков и, если таковые имеются, вводите бупренорфин в дозе 1,2 мг/кг подкожно один раз в 72 ч или проводите раннюю эвтаназию. Эвтаназия животных проводится после 7 дней пребывания в клетке с помощью ингаляции_СО2 и вторичного способа эвтаназии с помощью торакотомии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Применение циклического нагружения и механические измерения были получены с помощью специально изготовленного приспособления, состоящего из датчика крутящего момента, напечатанного на 3D-принтере привода голеностопного сустава и лежанки животного, 3D-электромагнитной системы позиционирования и ориентации, а также шагового двигателя, вращающего вал для достижения тыльного сгибания, как ранее сообщала наша группа¹⁷. Эта система управляется сценарием MATLAB, упомянутым в шаге 1.2. Датчик крутящего момента и система позиционирования и ориентации фиксируют данные о крутящем моменте и положении на протяжении всего протокола загрузки системы.

4. Анализ данных

1. Загружайте данные до и после измерений отдельно в MATLAB.
2. Преобразуйте крутящий момент в напряжение на основе измеренного момента плеча из шага 2.2 и площади поперечного сечения, измеренной при указанном количестве приложенных нагрузок, полученной из шага 2.11, используя уравнения (1) и (2):
   (1)
   (2) См.
3. Преобразуйте угол в деформацию на основе преобразования, полученного на шаге 2.10.
4. Рассчитайте средний гистерезис (площадь между кривыми нагружения и разгрузки), пиковое напряжение (максимальное значение напряжения цикла) и модули нагружения и разгрузки (линейная аппроксимация последних 50% кривых нагружения и первых 60% кривых разгрузки) для циклов до и после измерения.
5. Рассчитайте процентное изменение механических свойств по сравнению с этапом 4.4 между циклами до и после измерения.

С увеличением числа применяемых циклов наблюдалось большее снижение механических свойств сухожилий in vivo . Было отмечено значительно меньшее снижение гистерезиса и модулей нагружения и разгрузки для группы с 500 циклами по сравнению с группами с 3600 и 7200 циклами (p < 0,05) (рис. 2). В то время как наблюдалось значительное снижение пикового стресса за цикл от 500 до 3600 циклов, между группами 500 и 7200 циклов не было значительного снижения. Наблюдалось последовательное процентное снижение гистерезиса, пикового напряжения и модулей нагрузки и разгрузки для групп 3600 и 7200. Гематоксилин и эозин, а также трихромные изображения образцов сухожилий, окрашенные Массоном, подтвердили более высокие уровни микроструктурных повреждений с более высокими циклами тыльного сгибания с более округлыми клетками, гиперцеллюлярностью, разрушением волокон и обжимом волокон (рис. 3). Результаты в этой работе показывают, что более высокие циклы тыльного сгибания вызывают повышенный уровень повреждения ахиллова сухожилия.

Рисунок 1: Пассивная система тестирования тыльного сгибания голеностопного сустава. (A) Источник питания, (B) микроконтроллер, (C) шаговый двигатель, (D) датчик крутящего момента, (E) 3D-электромагнитный датчик позиционирования и ориентации, (F) 3D-печатное крепление для лодыжки, (G) 3D-печатная кровать для животных, (H) 3D-печатный держатель носового конуса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Репрезентативные кривые зависимости напряжения и деформации циклического нагружения. Кривые гистерезиса на 0, 500, 1 000, 2 000, 3 600 и 7 200 циклов. Стрелка указывает на уменьшение пикового напряжения с увеличением числа циклов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Репрезентативные гистологически окрашенные изображения образцов сухожилий. Гематоксилин и эозин (слева) и трихромные изображения сухожилий Массона (справа) для 500, 1000, 2000, 3600 и 7200 циклов для этого исследования продемонстрировали, что увеличение количества примененных циклов приводит к более округлым клеткам, гиперцеллюлярности (звезды), разрушению волокон и обжиму волокон (стрелки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.