Замораживание травмы жевательной мышцы мыши для создания модели фиброза орофациальных мышц

Орофациальные мышцы имеют решающее значение в повседневной физиологической деятельности, такой как жевание, речь, дыхание и мимика¹. Однако при врожденных орофациальных деформациях эти мышцы демонстрируют атрофические и фиброзные изменения, что приводит к нарушению здоровья тела и социального познания². Реконструктивная хирургия лица остается лечением первой линии, но до 30-70% послеоперационных пациентов по-прежнему страдают от потери мышечной массы и мышечной дисфункции ^3,4 Неудача регенерации орофациальных мышц объясняется внутренними факторами, которые не могут быть исправлены только хирургическим путем.

Появление орофациальных мышц является эволюционным новшеством, сопровождающим сложную голову позвоночных и камерное сердце ^5,6. В отличие от своих сомитных аналогов конечностей, орофациальные мышцы берут начало от жаберной дуги⁷. Эти филогенетические и онтогенетические признаки могут предрасполагать их к различным регенеративным моделям^{поведения.} Сообщалось, что жевательная мышца (MAS) развила тяжелый фиброз в то время, когда передняя мышца большеберцовой кости (TA) полностью регенерировалась после воздействия той же степени ^{травмы.} Тем не менее, основной механизм регенерации остается плохо изученным.

В этом исследовании была создана модель травмы замораживания жевательной мышцы мышей, чтобы облегчить исследование регенерации орофациальных мышц. Мы выбрали 14 дней после травмы в качестве временной точки для оценки фенотипа фиброза, поскольку это была самая ранняя временная точка, когда было обнаружено заметное расхождение между двумя мышцами. Для полной регенерации МАС после травмы требуется не менее 40 недель¹. Как и следовало ожидать, в этом исследовании было выявлено значительное отложение коллагена после замораживания МАС по сравнению с регулярной регенерацией ТА через 14 дней после травмы. С помощью этой модели можно проводить дальнейшие механистические исследования мышечной атрофии и фиброза, что, в свою очередь, поможет разработке потенциальных терапевтических путей для содействия регенерации орофациальных мышц после операции.

Все процедуры на животных в этом исследовании были рассмотрены и одобрены Этическим комитетом Западно-Китайской школы стоматологии Сычуаньского университета (WCHSIRB-D-2020-114). Самцы мышей C57BL/6 (в возрасте 5 недель) выращивались в помещении с контролируемой влажностью (53 ± 2%) и температурой (23 ± 2 °C) и находились на 12-часовом цикле свет/темнота. Подробные сведения обо всех материалах, реагентах и инструментах, используемых в данном протоколе, см. в Таблице материалов .

1. Обморожение травмы

1. Анестезия: Успокоить мышей ватными шариками, смоченными изофлураном, и ввести тилетамин-золазепам внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг. До- и послеоперационное обезболивание осуществлялось путем внутрибрюшинного введения мелоксикама в дозировке 1 мг/кг. Защитите их глаза с помощью ветеринарной мази. Грелка с температурой 38 °C была помещена под хирургическую простыню в течение всей процедуры, чтобы обеспечить тепловую поддержку животного. Зафиксируйте мышей лейкопластырем после того, как положите их на бок на операционный стол (рисунок 1). Оценивайте достаточность анестезии по потере рефлекса век, выпрямляющего рефлекса и рефлекса отмены педалей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При применении изофторновой анестезии держите мышь в одной руке, а ватный тампон, пропитанный изофтораном, в другой. Старайтесь держать ватный тампон на расстоянии от животного, чтобы избежать дискомфорта и раздражения кожи.
2. Предоперационная эпиляция: С помощью электрической бритвы сбрите шерсть на икре и морде мыши и нанесите пасту для депиляции ватным тампоном на кожу, покрывая жевательную мышцу и переднюю большеберцовую мышцу. Через 1-2 минуты смойте пасту хирургической салфеткой на основе этанола (Рисунок 2A и Рисунок 2G). Места проведения операций были продезинфицированы тремя раундами скраба на основе йода и 75% этанола.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Одной только электрической бритвы было недостаточно для удаления волос, особенно в области жевательной резинки. При нанесении пасты для депиляции важно не использовать чрезмерное количество пасты. Аккуратно протирайте кожу при смывании пасты, чтобы избежать ожогов кожи.
3. Воздействие на операционное поле: Накройте хирургическими простынями перед хирургической процедурой. Для мышцы MAS сначала пальпируйте вдоль нижнего края нижней челюсти. На расстоянии 5 мм от края сделайте разрез 7 мм по линии, соединяющей ротовую спайку с козелком (пунктирной линией обозначено место разреза на рисунке 2В).
4. Для мышцы ТА сначала пальпируйте вдоль икры, чтобы найти передний край большеберцовой кости. Скальпелем разрежьте кожу на расстоянии 2 мм кзади от края, начиная от колена и заканчивая лодыжкой (пунктирной линией обозначено место разреза на рисунке 2H). Для каждой мыши, если MAS и мышца TA с левой стороны повреждены, используйте другую мышцу на контралатеральной стороне в качестве контроля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот разрез очень поверхностный, чтобы мышцы не были травмированы во время разреза. Разрез на лице не должен находиться слишком близко к козелку. В противном случае околоушная железа будет оголена, что приведет к чрезмерному кровотечению во время последующего процесса замораживания.
5. Замораживание сухим льдом: Держите один кусок сухого льда с предварительно охлажденными щипцами вдоль длинных осей мышц MAS и TA (Рисунок 2C и Рисунок 2I соответственно). Поместите сухой лед непосредственно на поверхность мышцы на 5 секунд. Убедитесь, что мышца выглядит жесткой и бледно-белой сразу после удаления сухого льда (Рисунок 2D и Рисунок 2J), но что она возвращается к своему нормальному цвету и текстуре в течение 22-25 секунд, подобно соседней неповрежденной мышце (Рисунок 2E и Рисунок 2K).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Щипцы, удерживающие сухой лед, должны быть предварительно охлаждены, чтобы избежать быстрой сублимации сухого льда. Таймер является обязательным при проведении 5-секундной морозильной травмы и подсчете времени восстановления мышцы 22-25 секунд. Любая мышца с периодом восстановления короче 22 с или дольше 25 с должна быть оставлена. Этот шаг требует практики.
6. Закрытие раны: После полного восстановления мышцы закройте кожную рану не менее чем тремя швами 7-0 (Рисунок 2F и Рисунок 2L).
7. Реанимация: Когда наложение шва будет завершено, поместите мышей в клетку с термоподдержкой и постоянно наблюдайте за ними до тех пор, пока не будут восстановлены все рефлексы выпрямления.

2. Сбор мышечной массы

1. Усыпляют мышей с помощью передозировки изофлурана с последующим вывихом шейки матки. Соберите мышцы MAS и TA с обеих сторон для гистологического анализа.
2. Рассечение мышцы MAS: Разрежьте кожу на морде мыши и удалите околоушную железу, чтобы обнажить заднюю часть мышцы MAS. Рассеките MAS от его переднего прикрепления до заднего прикрепления на нижней челюсти. Белой пунктирной областью обозначена открытая часть MAS (рис. 3A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мышца MAS состоит из глубоких и поверхностных отделов, оба тесно прикреплены к поверхности нижней челюсти. Обязательно прижимайте ножницы к нижней челюсти во время вскрытия, чтобы обеспечить полную изоляцию МАС. Будьте осторожны, чтобы отличить скуловую челюсть от MAS по границам между скуловой и нижней челюстью.
3. Рассечение мышцы ТА: разрежьте кожу от лодыжки до колена и удалите фасцию, чтобы обнажить мышцу ТА. Используйте кончик микродиссекционных щипцов, чтобы изолировать сухожилие ТА, и сдвиньте его до колена, чтобы оторвать волокна, прикрепленные к большеберцовой кости. Затем разрежьте сухожилие на лодыжке (рисунок 3B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для мышцы ТА есть несколько мышечных сухожилий вокруг лодыжки мыши; потребуется практика, чтобы различить сухожилие ТА, которое является самым большим и близким к большеберцовой кости.
4. Предварительное охлаждение изопентана: Подготовьте две изоляционные бочки; Наполните маленькую бочку изопентаном, а большую бочку жидким азотом. Поместите маленькую бочку внутрь большой бочки за 10 минут до рассечения мышц (Рисунок 3D).
5. Подготовка формы для встраивания: Сделайте цилиндрическую форму из оловянной фольги для каждого образца и заполните их составом с оптимальной температурой резки (OCT).
6. Свежезамороженный: Погрузите мышцу в ОКТ, удерживая ее перпендикулярно соединению ОКТ (Рисунок 3C). С помощью иглодержателя перенесите форму в предварительно охлажденный изопентан. Подождите 40 секунд, чтобы ОКТ стал белым и твердым (Рисунок 3D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что форма расположена не слишком низко. В противном случае изопентан смешается с ОКТ и нарушит процесс замораживания мышц. Уровень ОКТ в пресс-форме должен быть сопоставим с высотой мышечного образца. Избегайте чрезмерного количества ОКТ, чтобы обеспечить быструю и эффективную заморозку.
7. Хранение образцов: Храните свежезамороженные образцы мышц в четко маркированных 24-луночных планшетах. Образцы немедленно разделите или храните при температуре -80 °C для длительного использования.

3. Гистологический анализ

1. С помощью криостата вырежьте из образца мышц срезы толщиной 10 мкм на предметные стекла с обработанной поверхностью.
2. Поместите предметные стекла в ледяной ацетон на 20 минут и высушите на воздухе в вытяжном шкафу в течение 20 минут.
3. Промойте предметные стекла в течение 3 х 5 минут фосфатно-солевым буфером (PBS).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, предметные стекла хранились в камере влажности, чтобы избежать высыхания.
4. Окрашивание Sirius Red
   1. Приготовьте рабочий раствор Sirius Red, растворив 0,5 г порошка Sirius Red в 500 мл насыщенной пикриновой кислоты.
   2. Закрасьте предметные стекла рабочим раствором Sirius Red на 1 ч при комнатной температуре.
   3. Вымойте предметные стекла в течение 2 х 5 минут с 0,5% уксусной кислотой.
   4. После процесса окрашивания образцы следует сначала обезвоживать в 95% этаноле в течение 15 с, а затем дегидратировать в безводном этаноле в течение 1 мин. Заключительный этап включает в себя крепление предметного стекла с нейтральным бальзамом.
5. Иммуногистологическое окрашивание
   1. Пропитайте срезы 0,3% Triton в PBS в течение 20 минут при комнатной температуре, после чего промойте PBS.
   2. Для окрашивания Pax7 заблокируйте срезы реагентом, входящим в комплект поставки указанного набора; для окрашивания ламинином и Pdgfrα блокируют 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) и 5% ослиной сывороткой в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре.
   3. Срезы с первичными антителами к Pax7, ламинину и Pdgfrα инкубировать в течение ночи при 4 °C, после чего следует промывка PBS в течение 3 x 5 минут.
   4. Срезы инкубируют с конъюгированными флуоресцентным красителем вторичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего промывают PBS в течение 3 х 5 мин.
   5. Инкубировать с 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) в течение 3 мин при комнатной температуре, затем промывать PBS в течение 3 х 5 мин.
   6. Поместите монтажный материал на секцию, поместите покровное стекло сверху и используйте лак для ногтей, чтобы запечатать покровное покрытие.

Окрашивание HE и Sirius Red (рис. 4 и дополнительный рисунок S1) выявили полную мышечную регенерацию ТА в этой модели травмы замерзания. Напротив, у MAS наблюдалось нарушение регенерации миоволокон и чрезмерное отложение внеклеточного матрикса. Гистология интактных мышц MAS и TA показана на рисунках 4A, B, где миоволокна выровнены, а фиброзная область появилась только в интерстициальном пространстве и среди различных пучков. В то время как мышца TA оставалась в основном той же мышечной структурой, что и ее неповрежденный контроль, через 14 дней после травмы (рисунок 4G-J), структура мышцы MAS была серьезно нарушена (рисунок 4C-F). Фиброзные участки появились на месте почти всех мышечных волокон в переднем, среднем и заднем сечениях мышцы MAS (рис. 4C-F).

Иммуногистологическое окрашивание Pax7 (дополнительный рисунок S2) и Pdgfrα способствовало дальнейшему исследованию мышечных сателлитных клеток (MuSCs) и фиброадипогенных предшественников (FAPs) соответственно. В мышце MAS при 14 dpi появились густонаселенные ядра, но без пропорционально увеличенных MuSC (рис. 5A, B). Большое количество миоволокон с центральным ядром (показано синей стрелкой) было обнаружено в ТА при 14 dpi (рисунок 5H), в то время как контур миоволокон был едва заметен при MAS в поврежденной области (рисунок 5E, F). Вместо этого наблюдалась инфильтрация Pdgfrα-положительных FAP и вновь образованных миоволокон малого диаметра (обозначенных белыми стрелками) (рис. 5F).

Рисунок 1: Обзор хирургической установки. (A) Мышь была обезболена и зафиксирована на операционном столе. Волосы были удалены с лица и ноги с левой стороны. Таймер использовался для контроля замирания мышц и времени восстановления. (В) Сухой лед диаметром 3,5 мм и высотой 6-12 мм был подготовлен в стеклянном стакане для замораживания. Щипцы были предварительно охлаждены в сухом льду для последующего использования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Интраоперационная запись травмы при замораживании MAS и TA. (A) Удаление волос при замораживании MAS. (B) Откройте кожу, чтобы обнажить мышцу MAS. (В) Замораживание сухим льдом по длинной оси MAS. (D) Появление MAS сразу после 5 с замораживания. (Д) Появление MAS через 22-25 с восстановления. (F) Закрытие раны на лице. (G) Эпиляция при замораживании ТА. (H) Откройте кожу, чтобы обнажить мышцу ТА. (I) Замораживание с использованием сухого льда вдоль длинной оси ТА. (J) Появление ТА сразу после 5 с замораживания. (К) Появление ТА через 22-25 с после выздоровления. (L) Закрытие раны на ноге. Сокращения: MAS = массажист; TA = передняя большеберцовая кость. Пунктирные линии на рисунках 2B и 2H указывают на расположение разрезов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Мышечный сбор MAS и TA. (A) Появление мышц MAS через 14 дней после травмы от обморожения. Красным пунктирным овалом обозначен MAS; белый пунктирный треугольник показывает обнажение мышцы MAS. (В) Появление мышцы ТА через 14 дней после обморожения. Красным пунктирным овалом обозначен ТА. (В) Погрузите мышечный образец в соединение ОКТ перпендикулярно. (D) Перенесите мышечный образец в изопентан, охлаждаемый азотом. Сокращения: MAS = массажист; TA = передняя большеберцовая кость; OCT = оптимальная температура резки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Гистологический анализ мышц MAS и TA. Окрашивание в красный цвет интактного (A-E) интактного мышечного участка MAS и переднего, среднего и заднего отделов MAS при давлении 14 dpi. (Ф-Дж) Интактный мышечный отдел ТА и передний, средний и задний отдел ТА с разрешением 14 dpi. Масштабная линейка = 100 мкм. Сокращения: MAS = массажист; TA = передняя большеберцовая кость; dpi = дни после травмы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Иммунофлуоресцентный анализ мышц MAS и TA. Иммуноокрашивание Pax7 и DAPI (синий) в (A) интактном MAS, (B) 14 dpi MAS, (C) интактном TA и (D) 14 dpi TA. Иммуноокрашивание ламинина, Pax7 и DAPI (синий) в (E) интактном MAS, (F) 14 dpi MAS, (G) интактном TA и (H) 14 dpi TA. Масштабная линейка = 20 мкм. Сокращения: MAS = массажист; TA = передняя большеберцовая кость; dpi = дни после травмы; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Белые стрелки указывают на типичное волокно малого диаметра MAS. Синяя пунктирная область и стрелки указывают на репрезентативные регенерирующие миоволокна и центральные ядра ТА. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный рисунок S1: Стойкий фиброз во время регенерации мышц. (A) Схематическое изображение регенерации мышц TA и MAS, вызванной обморожением. (Б-Г) Репрезентативные изображения окрашивания гематоксилина и эозина в поперечных срезах мышц TA и MAS в разные моменты времени после травмы. Масштабные линейки = 100 μм. Этот рисунок воспроизведен из Cheng et al.8. Сокращения: MAS = массажист; TA = передняя большеберцовая кость; dpi = дни после травмы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: Нарушение процесса миогенеза. (A) Иммунофлуоресцентные изображения Pax7 (зеленый) и DAPI (синий) в мышцах TA и MAS. (B) Количественная оценка процентного соотношения ядра Pax7/DAPI. Масштабная линейка = 100 μм * Указывает на значительное отличие от интактного мышечного контроля. # Указывает на значительное отличие от другой мышцы в тот же момент времени. **p < 0,01, ##p < 0,01. Этот рисунок воспроизведен из Cheng et al.8. Сокращения: MAS = массажист; TA = передняя большеберцовая кость; dpi = дни после травмы; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.