Эффективность и лежащие в ее основе механизмы лечения экземы заднего прохода ShiDuGao на основе наборов данных GEO и сетевой фармакологии

Анальная экзема — это аллергическое заболевание кожи, которое поражает перианальную область и слизистую оболочку и проявляется различными клиническими проявлениями¹. Характерные симптомы включают эритему заднего прохода, папулы, волдыри, эрозию, экссудат и образование корочек. Эти симптомы в основном возникают из-за расчесывания, утолщения и шероховатости пораженного участка².

Анальная экзема, характеризующаяся длительным течением заболевания, рецидивирующими приступами и сложным лечением, может оказывать неблагоприятное воздействие на физическое и психическое здоровье пациентов³. Патогенез анальной экземы пока не ясен, и современная медицина предполагает, что он может быть связан с локальными поражениями анального канала, диетой, окружающей средой, генетикой и другими факторами⁴. Помимо избегания контакта с раздражителями и потенциальными аллергенами, лечение анальной экземы в основном сосредоточено на таких методах, как подавление воспаления, противоаллергическое действие и облегчение зуда^.

SDG широко используется для лечения анальной экземы и других анальных заболеваний. SDG регулирует экссудацию анальной кожи, уменьшает влажность, восстанавливает анальную кожу и эффективно борется с зудом ^6,7,8. Кроме того, SDG обладает потенциалом для регуляции микробиоты периануса, тем самым улучшая состояние при экземе заднего прохода ^9,10.

Сетевая фармакология, новый и междисциплинарный, передовой биоинформатический подход в области искусственного интеллекта и больших данных, обеспечивает углубленное изучение традиционной китайской медицины. Эта дисциплина делает акцент на системном изложении правил молекулярной корреляции между лекарствами и болезнями с точки зрения экологической сети. Он был широко принят для различных аспектов, включая идентификацию ключевых активных ингредиентов в экстрактах трав, расшифровку их глобальных механизмов действия, разработку комбинаций лекарств и изучение совместимости рецептурных препаратов. Традиционные китайские рецепты обладают свойствами многокомпонентности и мультитаргетирования, что указывает на их существенную адаптируемость к области сетевой фармакологии. Благодаря этой методологии появились новые перспективы в изучении сложных систем традиционной китайской медицины, обеспечивающие надежную техническую поддержку для рационализации клинического применения и инноваций в области лекарственных средств 11,12,13,14.

Данное исследование направлено на изучение механизма эффективности ЦУР в лечении анальной экземы. Это исследование было направлено на выяснение механизма местного введения лекарственного средства с использованием синергетической интеграции сетевых фармакологических и гео наборов данных. Полученные данные дают ценную информацию об эффективности и механизмах, лежащих в основе ЦУР в лечении экземы заднего прохода, что указывает на ее потенциал в качестве эффективного терапевтического подхода к этому состоянию. Подробная схема рабочего процесса исследования представлена на рисунке 1.

В этом исследовании не говорится об этическом одобрении и согласии на участие. Данные, использованные в данном исследовании, были получены из генетических баз данных.

1. Прогнозирование мишеней заболевания

1. Получите доступ к базе данных GeneCards (https://www.genecards.org) и онлайн-базе данных по менделевскому наследованию у человека (OMIM, https://www.omim.org), используя «анус-экзема» в качестве поискового термина для мишеней заболевания.
2. Загрузите таблицы с указанием целевых показателей заболевания. Удалите повторяющиеся мишени, чтобы получить мишени для экземы ануса.

2. Подбор активных компонентов

1. Выполните поиск по ключевому слову «indigo naturalis, золотой кипарис, кальцинированный гипс, каламин и китайская галль» в базе данных фармакологии системы традиционной китайской медицины (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php), чтобы получить список активных ингредиентов-кандидатов и задач ЦУР.
2. Доверьте компонент швейцарской базе данных ADME (http://www.swissadme.ch/index.php), извлекая подробную информацию о тех, которые демонстрируют «высокое» поглощение ГИ, в сочетании с по крайней мере двумя значениями DL «Да» в качестве активных элементов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, в качестве активных ингредиентов включаются только ингредиенты с лекарственными значениями ≥0,18 в базе данных).

3. Построение сети ИПП и скрининг белков ядра

1. В Venny2.1( https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html) введите цели ЦУР и анусной экземы в LIST1 и LIST2 соответственно. Визуальное представление пересечения генерируется мгновенно. Нажмите на общую область, чтобы отобразить общие цели в разделе «Результаты ».
2. Доступ к базе данных STRING (https://string-db.org/). Введите целевые объекты в поле Список имен . Затем выберите Homo sapiens в качестве Организма и перейдите к поиску > продолжению.
3. Когда результаты будут готовы, откройте «Дополнительные настройки » и выберите «Скрыть отключенные узлы в сети». В поле Minimum Required Interaction Score (Минимально требуемая оценка взаимодействия) установите наивысшую достоверность (0,900) и нажмите кнопку Обновить.
4. Нажмите « Экспорт», чтобы загрузить текст сети белок-белкового взаимодействия (PPI) в формате .png и .tsv.

4. Построение сети лекарственный компонент-болезнь-мишень

1. Откройте Cytoscape 3.9.1 и импортируйте TSV-файл, упомянутый в шаге 3.4. Нажмите на панель стилей на панели управления, чтобы оптимизировать цвет, шрифт и сторону узлов сети.
2. Для анализа топологии сети используйте функцию Анализ сети . Чтобы получить гены-концентраторы, используйте CytoHubba в программном обеспечении Cytoscape. Создайте сеть «лекарство-компонент-болезнь-мишень».

5. Анализ обогащения GO и KEGG

1. Перейдите на веб-сайт Metascape (https://metascape.org/). Выберите файл или вставьте список генов в диалоговое окно и нажмите кнопку Отправить . Затем выберите H. sapiens в полях Input as Species и Analysis as Species; после этого включите функцию Пользовательский анализ .
2. В опции обогащения выберите GO Molecular Functions, GO Biological Processes, GO Cellular Components и базу данных KEGG Pathway. Установите флажок Pick Selective GO Clusters, затем нажмите кнопку Enrichment Analysis . После завершения индикатора выполнения нажмите кнопку Analysis Report Page (Страница отчета об анализе ), чтобы получить результаты обогащения.

6. Анализ набора данных генного чипа GEO

1. Поиск и анализ набора данных генного чипа GEO (GDS3806) с помощью инструмента GEO2R (https://ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/) для исследования экспрессии центральных генов в различных группах данных (контрольная группа - неатопический дерматит; экспериментальная группа - атопический дерматит).
2. Зайдите на сайт базы данных ГЕО (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Введите ключевое слово или GEO Accession, и нажмите кнопку Поиск . Выберите наиболее подходящий результат. Найдите справочную серию (GSE26952).
3. Войдите на веб-сайт инструмента GEO2R (https://ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/), введите ссылочную серию в поле GEO Accession и нажмите кнопку Set . Выберите «Атопический дерматит» в качестве экспериментальной группы, выберите «Нетопический контроль » в качестве контрольной группы и нажмите кнопку «Анализировать ». После того, как расчет будет завершен, появится результат.

7. Молекулярный стыковка

1. Откройте базу данных TCMSP и загрузите 3D-структуру выбранных ингредиентов. Используйте поле поиска «Химическое название» и выполните поиск по выбранным названиям ингредиентов, чтобы загрузить соответствующие файлы 3D-структуры в формате mol2.
2. Откройте базу данных белков RCSB (http://www.pdb.org/) и загрузите кристаллические структуры ключевых мишеней. В поле поиска найдите целевые имена и загрузите соответствующие файлы кристаллической структуры в формате pdb.
3. Импортируйте ингредиенты и файлы целевой структуры в аналитическое программное обеспечение. Удалите молекулы воды, нажав « Редактировать» > «Удалить воду». Добавьте водород, нажав на Edit > Hydrogen > Add. Установите ингредиенты в качестве лиганда, выберите целые мишени в качестве рецептора и выполните слепую стыковку.
4. Определите дальность молекулярного докинга.
   1. Выберите рецептор и лиганд последовательно. Щёлкните по кнопке Сетка > Сетка (Grid Box ), чтобы настроить сетку так, чтобы она включала в себя всю модель. Нажмите « Файл» > «Закрыть », сохраняя текущее, чтобы сохранить статус сетки. Сохраняйте файлы в формате gpf.
   2. Нажмите Run > Run Autogrid4 > Parameter Filename > Browse, выберите файл gpf и нажмите кнопку Launch.
5. Используйте AutoDock 4 для выполнения молекулярной стыковки.
   1. Нажмите на Docking > Macromolecule > Set Rigid Filename , чтобы выбрать рецептор. Нажмите на Docking > Ligand > Open/ Выбрать, чтобы выбрать лиганд.
   2. Нажмите на Docking > Search Parameters , чтобы задать алгоритмы работы, и Docking > Docking Parameters , чтобы задать параметры стыковки. Выберите файл dpf и нажмите кнопку «Запустить». Сохраняйте файлы в формате dpf.
   3. Нажмите « Analyze > Docking > Open», выберите файл dlg, нажмите «Analyze > Macromolecule », чтобы открыть рецептор, нажмите « Analyze > Conformations > Play, Rank by Energy », чтобы проанализировать результаты. Нажмите кнопку Set Play > Write Complex , чтобы сохранить результаты в формате pdbqt.
6. Импортируйте файлы стыковки в программное обеспечение PyMOL для создания дальнейшей визуализации.
   1. Выберите лиганд и нажмите Action > Find > Polar Contacts > To Other Atoms in Object, чтобы отобразить водородные связи между лигандами и внешней средой. Нажмите на c, чтобы изменить цвет.
   2. Нажмите « Действие» > «Извлечь объект». Нажмите на Show > Sticks , чтобы показать структуру палочки рецептора. Определите остатки, связанные с лигандами, и покажите структуру палочки.
   3. Нажмите на Hide > Sticks , чтобы скрыть структуру палочки рецептора. Нажмите на Wizard > Measurement и нажмите на два атома последовательно. Нажмите на Label > Remains, чтобы отобразить метку остатков. При необходимости отрегулируйте цвет фона и прозрачность. Нажмите « Файл» > «Экспортировать изображение как », чтобы сохранить изображение.

Гены, связанные с анусовой экземой, гены-мишени ЦУР и общие мишени
В общей сложности 958 потенциальных кандидатов в гены были проверены в Genecards и 634 в базах данных OIM, в то время как дубликаты были исключены. Чтобы получить всестороннее представление о генах, связанных с анальной экземой, результаты из нескольких баз данных были объединены, в результате чего было получено в общей сложности 958 различных генов. Следовательно, была тщательно разработана сеть белок-белковых взаимодействий (ИПП), специфичная для анальной экземы. SDG состоит из пяти традиционных китайских лекарств, а именно indigo naturalis, золотого кипариса, кальцинированного гипса, каламина и китайского галла15,16. Основным компонентом кальцинированного гипса является безводный сульфат кальция (CaSO4), а основным компонентом каламина — карбонат цинка (ZnCO3). Индиго натуралис, золотой кипарис и китайский галл имеют сложные ингредиенты. Из базы данных ТКМСП препараты содержат 92 компонента соединения, что позволяет получить в общей сложности 867 надежных мишеней для лекарственных средств (табл. 1).

Путем наложения обоих наборов данных генов-мишеней было выявлено в общей сложности 149 часто встречающихся генов-мишеней (рис. 2A) с последующим построением сети взаимодействия белок-белок (ИПП) (рис. 2B). С помощью метода скрининга, основанного на медиане, на степень, близость и промежуточность, 59 ключевых мишеней были выбраны в качестве потенциальных мишеней для лекарств от анальной экземы. Медианные баллы степени, близости и междугородности для ключевых целей составили 49, 40,31947 и 0,522 соответственно. В топ-10 генов с высокой степенью оценки вошли AKT1, TNF, TP53, EGFR, STAT3, SRC, JUN, CASP3, HRAS и PTGS2 (табл. 2). Эти гены очень важны для анальной экземы.

Пути и сети с общими целями
Методы обогащения KEGG и GO были использованы для анализа 59 ключевых мишеней, выявив 218 ассоциированных путей и более 3000 ассоциированных биологических процессов. Анализ выявил пути, которые сильно коррелируют с ЦУР и белками анальной экземы, включая инфекцию вируса простого вишни 1, шигеллез, сигнальный путь TNF, резистентность к ингибитору тирозинкиназы EGFR, цитомегаловирусную инфекцию человека и сигнальный путь Т-клеточного рецептора (рис. 3A). Эти пути в первую очередь связаны с такими генами, как AKT1, TNF, TP53, STAT3, SRC, EGFR и CASP3. На рисунке 3B представлено подробное описание генов-мишеней и путей. Анализ ГО проводили по биологическим процессам (АД), составу клеток (КК) и молекулярной функции (МФ) (рис. 4А). Результаты показывают, что это исследование в первую очередь сосредоточено на общих мишенях для ЦУР и анальной экземы в биологических процессах, причем некоторые из них имеют отношение к КК и МФ. Биологические функции, которые были особенно важны, включают фосфорилирование пептидилтирозина, модификацию пептидилтирозина, регуляцию адгезии между клетками, положительную регуляцию клеточной адгезии, активацию Т-клеток, регуляцию клеточной адгезии лейкоцитов (рис. 4B-D).

Прогнозирование связывания активных компонентов ЦУР с мишенями для экземы заднего прохода
На основе медианных значений степени, близости и промежуточности было проведено скрининг 59 ключевых мишеней, включая AKT1, TNF, TP53, EGFR, STAT3, SRC, JUN, CASP3, HRAS и PTGS2. Дальнейший анализ базы данных GEO выявил повышение регуляции PPARG, EGFR и TNF, в то время как PTPRC, MMP9, MAPK14 и CASP3 были понижены в экспериментальной группе (атопический дерматит) (рис. 5). Путем анализа обогащения общих генных путей было определено, что эти гены преимущественно участвуют в сигнальном каскаде TNF и сигнальном пути MAPC. В сигнальном пути TNF экспрессия TNF была повышена, в то время как экспрессия MMP9, MAPK14 и CASP3 была снижена. В сигнальном пути MAPK экспрессия EGFR и TNF была повышена, в то время как MAPK14 и CASP3 были понижены (рис. 6). Основываясь на этих результатах, TNF, MAPK14 и CASP3 рассматривались в качестве потенциальных мишеней в терапии ЦУР.

Для валидации мишеней-кандидатов в активных компонентах ЦУР был использован анализ стыковки для проверки точности между структурой активного компонента и потенциальными белками-мишенями. Эти белки-мишени участвуют в различных функциональных связях и являются высокими узлами в сети, что позволяет предположить, что они играют решающую роль в ответе ЦУР на анальную экзему. Отрицательное значение энергии связывания стыковки указывает на способность ЦУР стыковаться с мишенями заболевания in vivo, а более отрицательное значение указывает на более легкую стыковку. В данном исследовании был достигнут успешный молекулярный стыковка основных активных компонентов с ключевой мишенью, а энергия связи стыковки была отрицательной, со значениями менее -1 ккал/моль. Индиго и берберрубин обладают хорошей связывающей активностью, с энергией связывания менее -5 ккал/моль (табл. 3, рис. 7). Взятые вместе, эти результаты являются еще одним доказательством того, что эти белки, соответствующие локусам генов, могут выступать в качестве мишеней SDG при экземе заднего прохода.

Рисунок 1: Рабочий процесс сетевого фармакологического анализа. GO, Генная онтология; KEGG, Киотская энциклопедия генов и геномов; TCMSP, База данных и аналитическая платформа фармакологии систем традиционной китайской медицины; GEO, Омнибус экспрессии генов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Диаграмма Венна и сеть ИПП общих мишеней. (А) Диаграмма Венна, показывающая пересечение мишени лекарственного препарата и мишени заболевания. (B) Общая целевая сеть PPI по STRING. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Анализ обогащения путей KEGG. (A) Анализ обогащения путей KEGG. Первые 10 путей KEGG ранжируются в соответствии с P-значениями в порядке возрастания. (Б) Связь между путем и мишенью: путь (желтый), мишени (красный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Анализ обогащения GO. (A) Результаты GO трех онтологий. (B) Пузырьковая диаграмма биологического процесса (БП). (C) Пузырьковая диаграмма компонента ячейки (CC). (D) Пузырьковая диаграмма молекулярной функции (MF). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Прогнозирование результата потенциальных целей. (А) Тепловая карта экспрессии генов-концентраторов в базе данных GEO, группа А – экспериментальная группа (атопический дерматит), группа В – контрольная группа (неатопический дерматит); (Б) Узлы сети PPI представляют белки, ребра представляют отношения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Сигнальный путь. (A) Сигнальный путь MAPK. (B) Сигнальный путь TNF. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Молекулярный докинг основных генов и ингредиентов. Пурпурным цветом обозначены основные компоненты ЦУР, а синим — остатки основных генов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Активные ингредиенты в ЦУР.

Таблица 2: Характеристики 10 основных генов-концентраторов.

Таблица 3: Энергия связывания молекулярного докинга ингредиентов и основных генов.

Авторам нечего раскрывать.