Стандартизированная модель ксенотрансплантации гетеротопического сердца от свиньи к макаке

Ксенотрансплантация сердца дает новую надежду пациентам с терминальной стадией сердечной недостаточности, которые нуждаются в трансплантации, но не могут получить подходящий донорский орган из-за нехватки доноров. В доклинических оценочных исследованиях продолжительность выживаемости при ксенотрансплантации сердца для поддержания жизни составила до девяти месяцев, что соответствует критериям эффективности, необходимым для начала клинических испытаний на людях¹. Основываясь на этих выводах, Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило расширенное использование для двух клинических случаев ксенотрансплантации сердца с использованием генетически отредактированных донорских сердец. Несмотря на то, что эти клинические случаи продемонстрировали возможность ксенотрансплантации сердца, возникло несколько нерешенных проблем, включая аномальную гипертрофию сердца и антитело-опосредованное отторжение 2,3,4,5. Таким образом, необходимы дальнейшие доклинические исследования на крупных животных моделях в условиях надлежащей лабораторной практики для получения дополнительных данных и разработки новых иммуносупрессивных схем для обеспечения безопасности будущих клинических испытаний на людях.

Долгосрочная выживаемость ортотопических ксенотрансплантатов сердца ограничена не только отторжением, но и первичной дисфункцией трансплантата. Сообщалось, что общая частота возникновения первичной дисфункции колеблется от 40% до 60% в различных исследовательских группах ^4,6,7. В связи с повышенной восприимчивостью донорских сердец свиней к ишемическому повреждению, некоторые группы разработали устройства для гипотермической перфузии для снижения частоты первичной дисфункции трансплантата. Тем не менее, послеоперационная гипертрофия сердца остается трудно контролируемой. Даже при нокауте рецептора гормона роста (GHR) у донорских свиней сердечная функция может быть нарушена из-за отсутствия GHR, что ограничивает долгосрочную жизнеспособность трансплантата ^2,3. В этом контексте гетеротопическая ксенотрансплантация сердца имеет ряд преимуществ: она позволяет избежать чрезмерной предварительной и последующей нагрузки, упрощает хирургическую процедуру, а также сокращает общее время ишемии ^8,9. Эта модель лучше отражает повреждение трансплантата, вызванное ксеногенным отторжением, и, в отличие от ортотопической трансплантации, гетеротопическая ксенотрансплантация сердца обеспечивает долгосрочную выживаемость трансплантата, повторные лапаротомии для биопсии in vivo и длительное наблюдение за иммунной активацией и динамической функцией иммунных клеток. Он служит ценной моделью для исследования механизмов ксеногенного иммунного отторжения и для оценки эффективности и безопасности новых иммуносупрессивных стратегий^10,11.

Тем не менее, в большинстве моделей ксенотрансплантации абдоминального гетеротопического сердца в качестве реципиентов использовались бабуины, но приобретение павианов в качестве экспериментальных животных остается сложной задачей во многих странах. В отличие от них, макаки являются наиболее широко используемыми нечеловекообразными приматами и имеют высокую филогенетическую гомологию с человеком¹², что делает их практической альтернативой для исследований ксенотрансплантации. Тем не менее, их значительно меньший размер тела по сравнению с павианами требует специальной хирургической адаптации протокола, чтобы приспособиться к их различным анатомическим размерам.

В этом исследовании представлен пошаговый протокол ксенотрансплантации гетеротопического сердца от свиньи ГТКО к макаке. Использование свиней с нокаутом α-Gal (GTKO) в первую очередь направлено на предотвращение сверхострого отторжения, которое в противном случае привело бы к отторжению трансплантата в течение нескольких минут после ксенотрансплантации сердца. Он структурирован следующим образом: (1) принципы сопоставления между свиньями-донорами и макаками-реципиентами; (2) оптимизация хирургической процедуры гетеротопической ксенотрансплантации сердца; и (3) периоперационное управление. Данное исследование направлено на распространение этих методов трансплантации для обеспечения сопоставимости между исследовательскими группами и повышения воспроизводимости и трансляционной значимости исследований ксенотрансплантации сердца.

Это исследование было одобрено Комитетом по этике животных больницы Фувай (FWAEC-JL-010-1/0-2020). Для минимизации компрессии живота использовали самцов макак весом >9 кг и возрастом 10-15 лет, а также самцов миниатюрных поросят Бама весом 5-6 кг (~60 дней). Макаки с более крупным телом были в приоритете, чтобы предотвратить компрессию брюшной полости донорским сердцем и приспособиться к росту после трансплантации. Используемые реагенты и оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Критерии выбора донора и реципиента

1. Выбор реципиента макаки
   1. Скрининг ранее существовавших антител: используйте проточную цитометрию для оценки уровня предварительно сформированных ксеногенных антител, что позволяет отобрать реципиентов с низким иммунологическим риском.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом анализе эндотелиальные клетки свиньи GTKO из аорты свиньи GTKO выделяют путем ферментативного пищеварения, как описано ранее¹³.
      1. Инкубируйте эндотелиальные клетки свиньи GTKO с плазмой реципиента.
      2. Количественно оцените связывание IgM и IgG макаки с клетками свиньи с использованием флуоресцентно меченных вторичных антител против макак IgM и IgG. Выбирайте реципиентов с низким уровнем предварительно сформированных антител.
   2. Исходная оценка состояния здоровья: Проведите биохимию сыворотки, общий анализ крови и тесты на коагулограмму для подтверждения адекватной исходной функции органа.
2. Критерии выбора свиньи-донора
   1. Эхокардиографический скрининг: Выберите донорских свиней с нормальной функцией левого и правого желудочков, без структурных или функциональных аномалий сердечных клапанов, фракцией выброса более 65% и без признаков легочной гипертензии.
   2. Подбор пола: Выберите донорских свиней того же пола, что и реципиент.
   3. Группа крови: Выберите донорских свиней с группой крови О.

2. Предоперационная подготовка

1. Анестезия и седация
   1. Анестезия: Индуцировать макак с помощью кетамина (10 мг/кг) и мидазолама (1 мг/кг) (в соответствии с протоколом, утвержденным учреждением). После индукции следует поддерживать анестезию изофлураном (2%-3%) в сочетании с дексмедетомидином (1 мкг/кг/ч) и пропофолом (1-2 мг/кг/ч).
   2. Интубация: Интубируйте донорскую свинью с помощью эндотрахеальной трубки диаметром 5,0 мм. Интубируйте макаку реципиента с помощью эндотрахеальной трубки диаметром 5,5 мм.
   3. Установка мочеточникового катетера: Вставьте двухпросветный мочевой катетер 6-F в макаку; Исключить у донорской свиньи.
2. Подготовка и дезинфекция операционных полей
   1. Подготовка кожи: Подстригите волосы на груди, шее, животе, спине и конечностях.
   2. Дезинфекция: Очистите повидон-йодом выбритые участки, в том числе копыта (свиньи) или руки и ноги (обезьяны).
3. Установка центрального венозного катетера у реципиента
   1. Позиционирование: Расположите макаку реципиента в частичном левом боковом пролежне с поднятием плеча для оптимизации воздействия на правый шейный отдел. Выберите правую внутреннюю яремную вену в качестве предпочтительного места для центрального венозного доступа.
   2. Стерилизация и драпировка: Продезинфицируйте и задрапируйте операционное поле повидон-йодом в соответствии со стандартными асептическими процедурами.
   3. Разрез и обнажение сосуда: Сделайте 5-сантиметровый разрез примерно на 1 см медиально к грудино-ключично-сосцевидной мышце, параллельно ее внутренней границе. Выполните тупое рассечение фасции и втяните мышцу в сторону.
      1. Определите наружную яремную вену, которая залегает поверхностно и за пределами сонной артерии. Тщательно перевязывайте мелкие сообщающиеся ветви внутренней яремной вены. Откройте оболочку сонной артерии, чтобы обнажить внутреннюю яремную вену, блуждающий нерв и сонную артерию.
   4. Введение катетера: Введите трехпросветный центральный венозный катетер 8-F с использованием техники ретроградного туннелирования. В стерильных условиях подсоедините проксимальный конец катетера к туннельной игле и протяните его через туннель в разрез на шее.
      1. Обнесите наружу дистальный конец в средней точке лопатки. Обрежьте катетер до нужной длины, чтобы его кончик достиг места соединения верхней полой вены и правого предсердия.
   5. Закрытие разреза: Закройте рану слоями. Закройте фасцию и подкожную клетчатку рассасывающимися нитями 3-0, а кожу закройте шелковыми швами 1-0. Обеспечьте полное покрытие и надежную фиксацию катетера под фасциальным слоем, чтобы свести к минимуму риск инфекции.
      1. Используйте центральный венозный катетер в качестве критического пути доступа к жидкости для послеоперационного введения лекарств и объемной реанимации у макак. Ежедневно проводите повидон-йодную антисептическую терапию и стерильную марлевую повязку для сохранения целостности катетера и предотвращения инфицирования.
      2. Поддерживайте центральный венозный катетер на месте до окончательной процедуры жертвоприношения, чтобы обеспечить надежный сосудистый доступ.

3. Операция реципиента (преимплантационная фаза)

1. Срединный разрез брюшной полости
   1. Выбор разреза: Сделайте разрез на животе по средней линии длиной примерно 12-15 см (рисунок 1А).
   2. Детали разреза: Разрежьте последовательно через кожу, поверхностную фасцию, белую линию, поперечную фасцию и субперитонеальную фасцию (включая внебрюшинный жир), затем разрежьте теменную брюшину, чтобы получить доступ к брюшной полости. Используйте хирургическое лезвие #23 для разреза кожи и электрокоагуляцию для более глубокого рассечения тканей для одновременного разреза и гемостаза.
2. Исследование брюшной полости и контроль кишечника
   1. Адгезиолиз: Исследуйте брюшную полость для оценки спаек, уделяя особое внимание наличию спаек между кишечником и брюшной стенкой. Если они присутствуют, тщательно рассеките спайки с помощью электрокоагуляции, чтобы свести к минимуму повреждение тканей и снизить риск послеоперационной механической кишечной непроходимости.
   2. Защита кишечника: Аккуратно выведите тонкую кишку наружу и поместите ее на стерильную влажную марлю для защиты, чтобы обнажить брюшную аорту и нижнюю полую вену.
3. Обнажение брюшной аорты и нижней полой вены
   1. Мобилизуйте брюшную аорту и нижнюю полую вену: Тщательно рассеките окружающие ткани из брюшной аорты и нижней полой вены, сводя к минимуму риск повреждения сосудов и кровотечения. Как можно полнее обнажите брюшную аорту и нижнюю полую вену между истоками почечных артерий и разветвлением подвздошных артерий.
   2. Работа с сосудистыми ветвями: Сохраните нижнюю брыжеечную артерию и сопровождающую ее вену во время рассечения. Скрупулезно сохраняют все ветви поясницы.

4. Забор донорского сердца

1. Срединная стернотомия и мобилизация сосудов
   1. Срединная стернотомия: Выполнение срединной стернотомии для доступа к грудной полости (Рисунок 1B). Аккуратно разделите донорскую грудину с помощью ножа для грудины Лебше.
   2. Мобилизация сосудов: После обнажения грудной полости разрежьте перикард и тщательно рассеките, чтобы отделить восходящую аорту и главную легочную артерию.
2. Пережатие сосудов и охлаждение сердца
   1. Зажим сосуда: Наложите кисетной шов 4-0 на корень аорты, затем вставьте одноразовую антеградную канюлю для кардиоплегии для кардиоплегии (Рисунок 1C). Последовательно зажимают верхнюю и нижнюю полую вену с последующим пережатием восходящей аорты.
      1. Сразу после пережатия аорты сделайте надрез легочных вен и нижней полой вены для декомпрессии, убедившись, что разрезы достаточно велики для достаточного дренажа.
   2. Охлаждение сердца: Отсасывайте полость перикарда для эвакуации остатков крови, затем немедленно погружайте сердце в стерильный ледяной раствор для достижения гипотермической среды (0-4 °C).
3. Мониторинг кардиоплегии и перфузии
   1. Кардиоплегия: поддерживайте перфузионное давление на уровне 150 мм рт.ст. с помощью мешка под давлением. Перфузируют донорское сердце 30 мл/кг массы тела раствором HTK (например, 150 мл для свиньи весом 5 кг).
   2. Мониторинг перфузии: Одновременно пальпируйте корень аорты и левый желудочек для проверки надлежащего давления доставки кардиоплегии и предотвращения растяжения желудочков. После завершения инфузии кардиоплегии подтвердите остановку сердца пальпацией и визуальным осмотром. Убедитесь в отсутствии какой-либо фибрилляции миокарда, после чего приступайте к удалению донорского сердца.
4. Резекция и сохранение сердца
   1. Резекция сердца: После кардиоплегии наложите дополнительный лед на полость перикарда (Рисунок 1D). Аккуратно поднимите сердце и последовательно пересеките нижнюю полую вену и легочные вены с помощью хирургических ножниц. Соблюдайте особую осторожность, чтобы избежать травмирования верхней полой вены и правого предсердия при разделении правой верхней легочной вены.
      1. Защищайте трахею во время диссоциации задней стенки левого предсердия. Как только расслоение достигнет уровня левого предсердного крыши и легочных артерий, временно поместите сердце обратно в полость перикарда.
      2. Диссоциируйте и пересекте проксимальную дугу аорты и верхнюю полую вену, чтобы обнажить легочный ствол. Продолжайте диссекцию вдоль тканевых плоскостей по направлению к левому крыше предсердий, позволяя удалить сердце и его магистральные сосуды.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Надежно перевязайте культю азиготной вены после резекции сердца для предотвращения кровотечения.
   2. Сохранение сердца: Немедленно погрузите эксплантированное сердце в ледяной солевой раствор для сохранения. Кроме того, перфузируйте донорское сердце другим раствором Висконсинского университета (UW) в объеме 30 мл/кг, так как раствор UW обеспечивает превосходную защиту миокарда (рис. 1E).
5. Основные отличия от закупки донорского сердца
   1. Настройки давления инфузии: Установите давление перфузии в мешке под давлением на 150 мм рт.ст., что считается оптимальным для перфузии миокарда.
   2. Положение поперечного зажима аорты: Поскольку у свиней есть только две основные ветви от дуги аорты, левый и правый брахиоцефальные стволы, поместите поперечный зажим между этими ветвями. Перед наложением перекрестного зажима на правый брахиоцефальный ствол накладывают шелковые швы, чтобы сохранить большую длину донорской аорты.
   3. Стратегия декомпрессии желудочков: Чтобы свести к минимуму избыточное растяжение желудочков и ограничить время ишемии, регулярно декомпрессируйте только левый желудочек. Если правый желудочек начинает опухать, откройте верхнюю полую вену над азиготной веной. Если левый желудочек опух, разрежьте правую легочную вену и продлите разрез по направлению к правой легочной кости.

5. Имплантация донорского сердца

1. Подготовка донорского сердца
   1. Подготовка донорского сердца: Надежно закройте верхнюю полую вену, нижнюю полую вену и отверстия легочной вены левого предсердия с помощью проленовых швов 4-0.
   2. Сохранение синоатриального узла: Сохраните донорскую верхнюю полую вену и синоатриальный узел, расположенный рядом с правым придатком предсердия.
2. Анастомоз легочной артерии «конец в бок» до нижней полой вены
   1. Гепаринизация: Введите 5000 единиц гепарина натрия внутривенно макаке реципиента перед анастомозом сердца донора для предотвращения образования тромбов.
   2. Анастомоз легочной артерии: Поместите атравматический тангенциальный зажим Дебейки на нижнюю полую вену реципиента. Сделайте продольный разрез немного больше донорской легочной артерии, чтобы свести к минимуму послеоперационный стеноз.
      1. Используя двусторонний проленовый шов 5-0, начните анастомоз в положении «12 часов», вводя одну иглу изнутри (со стороны просвета) сосуда-реципиента наружу. Введите другую иглу со стороны донорской легочной артерии, проходя от просвета наружу в соответствующем положении «12 часов».
      2. Завяжите первоначальный узел на внешней стенке сосуда. Измените направление иглы, проходя снаружи обратно в просвет донорской легочной артерии. Продолжайте непрерывное наложение швов по часовой стрелке в направлении положения «6 часов», используя нервный крючок для поддержания натяжения шва.
      3. Поверните сердце, чтобы обнажить противоположную сторону, переключитесь на другую иглу, и зашите контралатеральную стенку с 12 до 6 часов по схеме ввода иглы «снаружи-внутрь» на сосуде-реципиенте и «изнутри-наружу» на сосуде-доноре, завершив анастомоз «конец в бок».
   3. Откачка воздуха: Перед тем, как закрепить последний узел, введите физиологический раствор в участок анастомоза, чтобы обеспечить полную эвакуацию воздуха. Окклюзируйте донорскую легочную артерию с помощью атравматического сосудистого зажима, затем последовательно освободите сосудистый зажим нижней полой вены (рис. 1F).
3. Анастомоз донорской аорты «конец в бок» до брюшной аорты реципиента
   1. Аортальный анастомоз: Частично зажмите брюшную аорту реципиента с помощью атравматичного тангенциального зажима Дебейки. Сделайте продольный разрез немного больше диаметра донорской аорты, чтобы предотвратить послеоперационный стеноз.
      1. Используя двусторонний проленовый шов 5-0, начните анастомоз, введя иглу в положении «12 часов» изнутри (с люминальной стороны) аорты реципиента наружу. Другую иглу из донорской аорты введите в положение «12 часов», также изнутри наружу, и завяжите первый стежок на наружной стенке сосуда.
      2. Измените направление иглы, проходя снаружи внутрь по донорскому сосуду, и непрерывно сшивайте по часовой стрелке до положения «6 часов», сохраняя натяжение шва нервным крючком. Переверните сердце, чтобы обнажить противоположную сторону, измените направление иглы соответственно (снаружи внутрь на донорском сосуде, изнутри наружу на сосуде-реципиенте) и наложите шов непрерывно с 12 до 6 часов, завершая анастомоз конец в сторону.
   2. Вакуумирование воздуха: Перед тем, как завязать последний узел, введите в анастомоз физиологический раствор для удаления воздуха. Последовательно освободите сосудистый зажим брюшной аорты для восстановления кровообращения (рис. 1G).
4. Реперфузия и дефибрилляция
   1. Профилактика фибрилляции желудочков: Введите 3 мг/кг лидокаина внутривенно перед реперфузией для предотвращения фибрилляции желудочков. Наблюдайте за донорским сердцем на предмет спонтанных сокращений в течение 2 минут.
   2. Дефибрилляция: Если возникает фибрилляция желудочков, примените прямую дефибрилляцию, поместив лопатки в прямой контакт с обеими поверхностями желудочков (левой и правой) и нанесите двухфазный удар силой 5 джоулей. Общее время ишемии донорского сердца составило примерно 57,5 мин ± 6,1 мин (табл. 1).
5. Установка дренажа
   1. Дренаж с отрицательным давлением: Поместите дренажную трубку с отрицательным давлением в брюшную полость, чтобы предотвратить накопление послеоперационной жидкости и следить за активным кровотечением.
   2. Показания к удалению дренажа: Контролируйте послеоперационный объем дренажа и удалите брюшной дренаж, когда 24-часовой выход упадет ниже 25 мл.
6. Ушивание живота
   1. Закрытие брюшной полости и ультразвуковое исследование: Закройте брюшную стенку слоями, аппроксимируя фасцию и подкожную клетчатку 3-0 рассасывающимися швами, и закройте кожу 1-0 шелковыми швами. Проведите послеоперационное ультразвуковое исследование брюшной полости для оценки сердечной деятельности (Рисунок 1H).

6. Послеоперационное ведение и мониторинг трансплантата

1. Наблюдение и общие рекомендации по уходу
   1. Мониторинг поведения и симптомов: Непрерывно контролируйте состояние пациента в течение первых двух послеоперационных недель с помощью видеонаблюдения. Выполняйте ежедневную оценку поведения, аппетита, вздутия живота, одышки, отеков, а также нормальной дефекации и мочеиспускания.
      1. Контролируйте массу тела, общее физическое состояние, заживление хирургического разреза, потенциальную инфекцию центрального венозного катетера, внешний вид слизистой оболочки и накопление внутрибрюшной жидкости.
   2. Ультразвуковая оценка: Используйте ультразвук для оценки функции гетеротопически трансплантированного сердца и обнаружения любого окружающего выпота при наличии аномалий. На рисунке 2 представлены эхокардиографические изображения ксенотрансплантата во время диастолы и систолы в послеоперационный день (POD) 1, наряду с отторжением трансплантата, наблюдаемым в эксперименте M3. Красная линия указывает на выраженную гипертрофию стенки левого желудочка при отторгнувшем ксенотрансплантате.

На основе процедурных этапов, показанных на рисунке 1, была успешно создана воспроизводимая модель ксенотрансплантации сердца от свиньи к макаке. Хирургический процесс включал лапаротомию по средней линии у макаки реципиента для доступа к брюшной полости и срединную стернотомию у свиньи-донора для забора сердца. После перикардиотомии донорское сердце было остановлено с помощью раствора HTK и дополнительно сохранено раствором UW в условиях местной гипотермии. Сосудистые анастомозы выполняли в конце-бок между донорской легочной артерией и нижней полой веной реципиента, а также между донорской аортой и брюшной аортой реципиента. Послеоперационная эхокардиографическая оценка подтвердила, что у донорского сердца возобновилась сократительная активность с сохранением систолической и диастолической функции, что свидетельствует об успешной реперфузии и жизнеспособности трансплантата. Эти результаты демонстрируют техническую осуществимость модели и ее потенциал для долгосрочного функционального мониторинга ксенотрансплантатов у приматов.

Рисунок 1: Гетеротопическая трансплантация сердца от свиньи к макаке: хирургические этапы и послеоперационное ультразвуковое исследование. (A) В брюшную полость макаки входили с помощью лапаротомии по средней линии с послойной диссекцией. (B) Была выполнена срединная стернотомия для доступа к грудной полости донора свиньи с последующей перикардиотомией. (C) Перфузионная канюля была вставлена в корень аорты донорского сердца. (D) После остановки сердца, вызванной перфузией раствора HTK, донорское сердце было местно охлаждено солевой ледяной слякотью. (E) Была проведена последующая перфузия с консервационным раствором Университета Висконсина (UW). (F) Был создан анастомоз «конец в бок» между легочной артерией свиньи и нижней полой веной реципиента. (G) Между аортой свиньи и брюшной аортой реципиента был построен анастомоз «конец в бок». (З) Проведена послеоперационная эхокардиография для оценки систолической и диастолической функции сердца донора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Эхокардиографические изображения M3 с временными рядами. (A) Эхокардиографические изображения ксенотрансплантата во время диастолы и систолы в послеоперационные сутки (POD) 1. (B) Эхокардиографические изображения ксенотрансплантата во время диастолы и систолы в POD 3. (C) Эхокардиографические изображения ксенотрансплантата во время диастолы и систолы в POD 10. (D) Эхокардиографические изображения ксенотрансплантата во время диастолы и систолы при отторжении трансплантата. Красная линия указывает на значительное увеличение толщины стенки левого желудочка во время диастолы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Общее время ишемии донорского сердца.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.