Разгадка тонкостей ксенофагии: уроки легионеллы пневмофилы

Распространенность устойчивых к лекарствам штаммов бактерий обусловила необходимость поиска новых антибактериальных подходов к борьбе с инфекционными заболеваниями. Аутофагия, фундаментальный эукариотический процесс, посредством которого клетки развивают фагоцитарные везикулы, содержащие клеточные белки или органеллы, играет важную роль в регулировании клеточного гомеостаза и различных метаболических^{процессов.} По мере углубления знаний об аутофагии исследователи обнаружили, что аутофагические везикулы могут избирательно нацеливаться на конкретные органеллы, белки или^{патогены.} Ксенофагия относится к процессу, с помощью которого клетки избирательно распознают внутриклеточные патогены посредством аутофагии и доставляют их в лизосомы для^{клиренса.} Этот процесс имеет решающее значение для защитного механизма врожденной иммунной системы у эукариотических организмов⁴. Следовательно, выяснение его механизмов и регуляции является важной областью исследований, имеющей значительные последствия для разработки новых противоинфекционных стратегий.

Legionella pneumophila — грамотрицательный внутриклеточный патоген, который обычно инфицирует водных одноклеточных протистов. Тем не менее, у людей могут развиться оппортунистические инфекции от контакта с загрязненной водой, что приводит к болезни легионеров, тяжелой форме^{пневмонии.} Попадая в клетку-хозяина, Legionella использует систему секреции IV типа (T4SS) для транспортировки примерно 330 эффекторных белков, помогая уклоняться от иммунного ответа хозяина и обеспечивая выживание и пролиферацию бактерий в клетках. Легионелла, как и сальмонелла, препятствует ксенофагии хозяина с помощью эффекторных белков, хотя точный молекулярный механизм еще^{предстоит установить}. Например, Salmonella Typhimurium поставляет эффекторы секреции III типа (например, SopF), которые АДФ-рибозилатируют вакуолярную V-АТФазу и блокируют инициацию аутофагии⁷, в то время как L. pneumophila использует T4SS и эффекторы, такие как RavZ и SidE, для вмешательства в более поздние стадии ксенофагии ^6,8. Несмотря на эти разные тактики, оба патогена в конечном итоге уклоняются от ксенофагического выведения, что подчеркивает сходящиеся стратегии уклонения от аутофагии. Следовательно, изучение этих белков вирулентности не только способствует разработке специфических противоинфекционных методов лечения, но и может пролить свет на молекулярные тонкости ксенофагии.

Механизмы ксенофагии в клиренсе от возбудителей

В 1984 году Рикихиса и др. сделали важное открытие, что инфицированные риккетсиями нейтрофилы продуцируют аутофагосомы, что стало первым случаем участия аутофагии в бактериальных^{инфекциях.} Дальнейшие исследования показали, что индукция аутофагии в макрофагах через рапамицин приводит к совместной локализации связанных с аутофагией белков LC-3 и Beclin-1 с Mycobacterium tuberculosis , содержащими везикулы, предотвращая пролиферацию бактерий в клетках¹⁰. Кроме того, известно, что внутриклеточные патогены, такие как Salmonella typhi, Listeria, Shigella flexneri и Burkholderia mallei , индуцируют аутофагию, которая впоследствии контролирует их рост в клетках-хозяевах¹¹.

Ксенофагия, форма селективной аутофагии, включает в себя три различных процесса: распознавание груза, рекрутирование рецепторов аутофагии и лизосом-опосредованную деградацию (как показано на рисунке 1). Тем не менее, механизм, с помощью которого клетки распознают вторгшиеся патогены (распознавание груза) и инициируют аутофагию, остается неясным. Исследования показывают, что когда бактерии проникают в цитоплазму, убиквитинлигаза присоединяется к инфицированным патогенами вакуолям или белкам, присутствующим на поверхности патогенов 12,13,14. Эти меченые белки затем собираются в убиквитиновую оболочку, заключающую патоген в оболочку и действующую как сигнальная платформа для привлечения адаптеров аутофагии, в основном включая p62/SQSTM1, NDP52, NBR1 и оптинеррин. Адаптеры аутофагии облегчают ксенофагию, взаимодействуя с белками через LC3-взаимодействующий домен (LIR), за исключением убиквитин-связывающего домена (UBD), который опосредует связывание убиквитинированных белков¹⁵. Например, Е3-лигазы хозяина, такие как LRSAM1 и Parkin, присоединяют убиквитин к вторгшимся бактериям, тем самым генерируя сигнал убиквитиновой оболочки, который помечает их для ксенофагического клиренса^16,17. Кроме того, рецепторы ксенофагии могут также инициировать ксенофагию путем связывания с галектином на поверхности бактериальной фагосомы или путем непосредственного взаимодействия с бактериальными поверхностными белками^18,19. Другая точка зрения предполагает, что бактерии в фагосоме могут изменять ионные градиенты везикулы путем повреждения мембраны, что приводит к конформационным изменениям V-АТФаз на фагосомной мембране, которые рекрутируют комплекс Atg5-Atg12-Atg16L1 путем связывания с доменом WD40 ATG16L1 ^7,20. ATG16L1 также может связываться с комплементом C3, который покрывает поглощенные бактерии через свой домен WD40, рекрутируя комплекс Atg5-Atg12-Atg16L1 в бактериальную фагосому²¹. Остается неясным, нацелены ли эти различные механизмы распознавания на разные виды бактерий или они возникают на разных стадиях инфекции. Для полного понимания этих механизмов необходимы дальнейшие исследования и изыскания.

Стратегии патогенов для уклонения от ксенофагии

В ходе совместной эволюции со своим хозяином внутриклеточные патогены развили различные механизмы ингибирования ксенофагии 22,23,24. Это приводит к слабому ксенофагическому ответу во время инфекций, что затрудняет наблюдение^{за 25}. Например, бета-гемолитический стрептококк выделяет цистеиновую протеазу под названием SpeB, которая нацелена на p62, NDP52 и NBR1 для деградации. Мутанты с делецией SpeB не смогли сопротивляться аутофагии, и их рост внутри клеток был подавлен. Эти результаты подтверждают важную роль этих адаптеров аутофагии в ксенофагии. Было обнаружено, что белок вирулентности VirG Shigella flexneri индуцирует ксенофагию путем рекрутирования Atg5 на бактериальную поверхность¹⁹. Тем не менее, бактерия также использует систему секреции типа III для транспортировки эффекторного белка IcsB, который ингибирует связывание ATG5 с VirG¹⁹. Следовательно, аутофагия предотвращается¹⁹. Эта конкуренция между бактериальными белками и механизмами аутофагии предполагает, что белки Atg могут непосредственно распознавать поверхностные белки бактерий для инициации ксенофагии. Аналогичным образом, вирулентный белок CpbC Streptococcus pneumoniae индуцирует аутофагическую деградацию Atg14 путем образования комплекса p62-CpbC-Atg14, который, в свою очередь, снижает уровень Atg14. Это влияет на комплекс Atg14-STX17, который опосредует лизосомное взаимодействие, тем самым ингибируя ксенофагию²⁶.

В исследовании, в котором сальмонелла использовалась в качестве модельной бактерии, Xu et al. обнаружили, что повреждение мембранных везикул, вызванное инфекцией, обнаруживается V-АТФазой, что приводит к активации ксенофагии через связывание с доменом WD40 ATG16L1⁷. Эта активация не является частью типичного пути аутофагии. Кроме того, вирулентный белок SopF обладает способностью опосредуть АДФ-рибозилирование (ADPRylation) V-АТФаз и ингибировать их способность инициировать ксенофагию⁷. Это иллюстрирует, как бактерии и секретируемые ими белки вирулентности могут быть использованы в качестве ценных инструментов для исследования и понимания сложного явления и механизмов аутофагии, которые часто трудно исследовать в нормальных физиологических условиях.

Легионелла и ксенофагия

L. pneumophila создает репликативную нишу, называемую легионелл-содержащей вакуолью (LCV), манипулируя основными биологическими активностями, такими как убиквитинация хозяина²⁷, транспорт везикул²⁸, энергетический метаболизм²⁹ и подвижность клеток³⁰. Несмотря на наличие во внутриклеточных бактериях многочисленных убиквитинированных белков, у³¹легионеллы развились различные механизмы противодействия аутофагии, препятствующие слиянию LCV с лизосомами ^6,8.

RavZ ингибирует аутофагию путем расщепления LC3-II

Первым эффекторным белком легионеллы, который регулирует аутофагию, является RavZ (Lpg1683). Являясь цистеиновой протеазой, RavZ разрывает амидную связь между углерод-концевым глицином и предыдущим аминокислотным остатком LC3, что приводит к необратимому нарушению липидации LC3⁸. По сравнению с Legionella дикого типа, мутантный штамм с делецией RavZ (ΔravZ) показал значительное повышение уровня LC3-II и количества LC3 puncta в клетках хозяина^{после инфицирования8}. Генетически модифицированный штамм Listeria (ΔhlyΔprfAcLLO) может вызывать сильный ксенофагический ответ при попадании в клетки. При коинфицирующих клетках легионеллы дикого типа могут подавлять накопление LC3 вокруг штамма ΔhlyΔprfAcLLO, но ΔravZ теряет свою способность ингибировать индукцию штаммом ксенофагии⁶. Кроме того, транзиторная экспрессия RavZ в клетках хозяина ингибирует аутофагию, вызванную голоданием⁸. Эти результаты свидетельствуют о том, что RavZ оказывает широкий трансакционный эффект (т.е. действует диффузно в цитозоле) для противодействия аутофагии. Удивительно, но репликация мутанта ΔravZ не была затронута в клетках-хозяевах, и не было обнаружено явного рекрутирования LC3 на мембране LCV, содержащей мутант ΔravZ ^6,8. Эти результаты свидетельствуют о том, что легионелла может использовать другие эффекторные белки, в дополнение к RavZ, чтобы уклоняться от ксенофагии хозяина.

Семейство SidE и ксенофагия

Семейство SidE состоит из четырех гомологичных белков размером более 170 кДа, названных SdeA, SdeB, SdeC и SidE³². Эти белки вирулентности структурно сходны с функциональной избыточностью, все они содержат домен моно-АДФ-рибозилтрансферазы (мАРТ) и домен фосфодиэстеразы (ФДЭ). Исследования показали, что в отсутствие убиквитин-активирующего фермента (Е1) и убиквитин-конъюгирующего фермента (Е2) семейство SidE функционирует как независимая убиквитин-лигазаза (Е3), катализируя уникальную модификацию субстратов фосфорибозилубиквитинацией (PR-Ub) 33,34,35. Этот процесс происходит в два этапа. Взяв в качестве примера SdeA, во-первых, SdeA модифицирует остаток Arg42 убиквитина (Ub) с группой аденозиндифосфатрибозы (ADPR), полученной из NAD+, используя свой домен mART, генерируя промежуточный продукт ADPR-Ub^33,36. Затем фосфодиэфирная связь ADPR-Ub расщепляется функциональным доменом PDE SdeA, что приводит к высвобождению АМФ и соединению PR-Ub с сериновым остатком белка субстрата³⁶.

Семейство SidE содержит множество эукариотических белковых субстратов. В дополнение к опосредованию фосфорибозилубиквитинирования ГТФаз, таких как Rab1A, Rab6A и Rab33B, для вмешательства в везикулярный транспорт^33,37, недавние исследования показали, что семейство SidE также обладает антагонистическими функциями в отношении ксенофагии ^6,38,39,40. По сравнению с Legionella дикого типа, мутантные штаммы, лишенные кодирующих генов семейства SidE (ΔsidEs), демонстрируют значительное увеличение рекрутирования p62 на LCV⁶. В отличие от RavZ, который действует в трансгендерном режиме, семейство SidE работает в цис-образном пространстве (действуя локально в LCV), чтобы защитить собственную вакуоль легионеллы от ксенофагии. Легионеллы, транспортирующие белки семейства SidE, не могут подавлять рекрутирование p62 вокруг коинфицированных штаммов ΔhlyΔprfAcLLO Listeria ⁶. Подобно штамму ΔravZ, мутант ΔsidEs также может уклоняться от ксенофагии хозяина. Механизм, с помощью которого SidE антагонизирует ксенофагию, неясен, и может быть связан с его вмешательством в систему убиквитинирования хозяина, опосредованным фосфорибозилубиквитинацией. Например, фосфорибозилирование убиквитина SidE может предотвратить распознавание LCV убиквитин-связывающими рецепторами, тем самым блокируя рекрутирование адапторов, таких как NDP52 или оптиневрин, в вакуоль.

Другие эффекторы, участвующие в ксенофагии

В дополнение к RavZ и SidE, L. pneumophila кодирует другие эффекторы, включая LpSpl, Lpg1137 и Lpg2936, которые нацелены на различные стадии пути аутофагии. LpSpl представляет собой секретируемый фермент, который имитирует сфингозин-1-фосфат лиазу, расщепляя сфингозин-1-фосфат (S1P) на метаболиты⁴¹. Это истощение S1P LpSpl предотвращает накопление сфингозина и приводит к активации mTORC1, тем самым ингибируя инициацию аутофагии⁴¹. Lpg1137 представляет собой протеазу, которая расщепляет белок SNARE синтаксин 17 (Stx17), который необходим для слияния аутофагосом и лизосомой⁴². Разрушая Stx17, Lpg1137 препятствует созреванию аутофагосом и блокирует последнюю стадию слияния ксенофагии⁴². Lpg2936 является ядерным эффектором, который вызывает эпигенетические модификации генов, связанных с аутофагией (таких как ATG7 и LC3B), что приводит к их сниженной^{экспрессии}. Эта подавление основных компонентов аутофагии ингибирует биогенез аутофагосом на транскрипционном уровне⁴³. Тем не менее, мало что известно о роли LpSpl, Lpg1137 и Lpg2936 в инфекции легионеллы ; Их вклад в уклонение от ксенофагии in vivo еще предстоит полностью выяснить.

В таблице 1 обобщены ключевые эффекторы L. pneumophila , участвующие в подавлении ксенофагии, их мишени и функции, а также стадии ксенофагии, на которые они влияют.

Перспективы на будущее

Ключевые факторы неопределенности сохраняются и предполагают конкретные дальнейшие шаги. Во-первых, временная иерархия эффекторов легионеллы, действующих на ксенофагию, не решена (ранний LpSpl/mTORC1 против среднего/позднего RavZ, SidE); во-вторых, некоторые эффекторы, модулирующие аутофагию (например, LpSpl, Lpg2936), не имеют валидации in vivo ; В-третьих, гетерогенность ксенофагических реакций по типам клеток в подмножествах макрофагов, эпителии и нейтрофилах плохо картирована. Мы предлагаем атласы инфекций с временным разрешением (пульс-чейз, липидомика LC3, протеомика PR-убиквитина, живые репортеры) для упорядочивания эффекторных действий; парные эффекторно-делеционные штаммы (ΔravZ/ΔsidE/ΔlpSpl/Δlpg2936) в мышиных моделях, специфичных для типа клеток, для установления причинно-следственной связи; и одноклеточные/пространственные мультиомики плюс CRISPR/perturb-seq с акцентом на ось V-ATPase-ATG16L1, тегирование LRSAM1/Parkin и адаптерные модули (OPTN/NDP52/p62). С точки зрения трансляции, мы представляем себе эффекторно-направленные ингибиторы, которые блокируют RavZ (активный центр цистеиновой протеазы) или SidE (mART/PDE PR-ubiquitination) для восстановления пулов LC3-II и рекрутирования адаптеров на LCV, наряду с управляемыми хозяином бустерами, которые улучшают маркировку груза (активируют LRSAM1/Parkin), стабилизируют взаимодействие адаптера-LC3 и временно настраивают поток (активация TFEB, модерируемый mTORC1). Доставка в легкие (например, ингаляционные наночастицы, сочетающие анти-RavZ/SidE агент с агонистом TFEB) должна оцениваться с помощью показаний с временными метками и разрешением по типу клеток (поток LC3, занятость PR-Ub, набор адаптеров, показатели слияния) и эффективности in vivo (бактериальная нагрузка, патология, выживаемость).

L. pneumophila развила впечатляющий набор стратегий уклонения от ксенофагии, в первую очередь благодаря своим разнообразным эффекторным белкам, которые препятствуют распознаванию груза, убиквитинации, созреванию аутофагосом и слиянию лизосом. Эти механизмы не только позволяют патогену выживать и размножаться в клетках-хозяевах, но и раскрывают новые аспекты регуляции аутофагии. Понимание этой тактики уклонения дает ценную информацию о сложном взаимодействии между защитой хозяина и адаптацией микроорганизмов. Будущие исследования должны быть сосредоточены на идентификации дополнительных эффекторов, выяснении их молекулярных мишеней и уточнении их временной регуляции во время инфекции. Более того, использование этих механистических знаний может помочь в разработке терапии, направленной на хозяина, или новых противомикробных агентов, восстанавливающих функцию ксенофагии. Дальнейшая интеграция передовых подходов к визуализации, структурной биологии и омиксе будет иметь решающее значение для анализа динамических взаимодействий между L. pneumophila и механизмом аутофагии, что потенциально может привести к инновационным стратегиям борьбы с внутриклеточными патогенами.

Наконец, многие эффекторы легионеллы являются многофункциональными, воздействуя на процессы нескольких хозяев, выходящие за рамки аутофагии. Те же эффекторы, которые помогают L. pneumophila уклоняться от ксенофагии, могут также модулировать гибель клеток хозяина (апоптоз) и иммунные сигнальные пути, способствуя дальнейшему выживанию бактерий 23,30,35,44,45. Это перекрестное взаимодействие между уклонением от аутофагии и другими защитными механизмами хозяина подчеркивает необходимость изучения тактики вирулентности легионеллы в целом. Изучение того, как эффекторы, нацеленные на аутофагию, одновременно влияют на апоптоз и воспаление, обеспечит более полное понимание взаимодействий хозяина и патогена и может выявить новые мишени для терапевтического вмешательства.

Рисунок 1: Схематическое изображение механизма ксенофагии. Когда бактерии проникают в цитоплазму, убиквитин конъюгируется убиквитинлигазой с белками, присутствующими на поверхности патогена или инфицированных патогеном вакуолях, с последующим образованием убиквитиновой оболочки, которая покрывает патоген. Эта убиквитиновая оболочка действует как сигнальная платформа для привлечения адаптеров аутофагии. Кроме того, рецепторы аутофагии могут инициировать ксенофагию, связываясь с бактериальным фагосомным поверхностным галектином или напрямую взаимодействуя с бактериальными поверхностными белками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Стратегии уклонения от ксенофагии эффекторов L. pneumophila. В этой таблице перечислены выбранные эффекторные белки L. pneumophila, их молекулярные мишени или активность, а также стадия пути ксенофагии, который они нарушают.