Why is RT-PCR used to detect RNA viruses in environmental samples?

RT-PCR detects RNA viruses with high sensitivity because many pathogenic viruses like flu, Ebola, and HIV have RNA-based genomes instead of DNA. Most RNA viruses lack culture-based detection methods, making RT-PCR essential for identifying their presence in environmental samples. This technique converts RNA into complementary DNA (cDNA), enabling analysis using standard DNA detection technologies.

What are the two main steps in the RT-PCR procedure?

RT-PCR involves RNA extraction from biological samples, followed by reverse transcription into DNA. RNA extraction uses detergents to lyse cells and mechanical disruption, with proteinases breaking down viral capsids. The isolated RNA is then converted to cDNA using reverse transcriptase enzyme, which synthesizes complementary DNA from a primer sequence designed for specific genes or organisms.

How does RT-PCR help assess microbial gene expression in the environment?

RT-PCR measures messenger RNA (mRNA) levels to indicate which genes microbes are expressing in response to environmental changes. By monitoring alterations in gene expression, researchers can identify which biological pathways organisms use to survive harsh conditions and potentially perform bioremediation. This serves as an ecosystem assessor, revealing microbial activity and adaptation strategies in environmental samples.

What methods are used to purify RNA from environmental samples?

Two main RNA purification methods exist: acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction separates RNA into an aqueous phase through centrifugation, then precipitates it with alcohol. Column-based isolation passes lysate through a negatively charged silica resin where nucleic acids bind via salt bridges, then elutes using low-salt buffers. Single-stranded RNA can be preferentially eluted using specific buffer concentrations.

How are environmental samples collected for RT-PCR analysis?

Soil samples are collected using a hand auger pushed to predetermined depths, then sieved through 2-mm mesh to remove gravel. Water samples are collected in sterile bottles with volume noted and parameters like temperature, pH, and salinity tested immediately. Both sample types are labeled with location, date, time, and collection details, then transferred to the laboratory for microorganism concentration and RNA extraction.

What is reverse transcriptase and why is it essential for RT-PCR?

Reverse transcriptase is an enzyme naturally encoded by retroviruses like HIV that synthesizes complementary DNA (cDNA) from RNA templates using short primer sequences. This enzyme is essential because it converts chemically unstable RNA into stable DNA, enabling standard PCR amplification. The primer can be designed with specific sequences to detect particular genes or organisms of interest in environmental samples.

What are practical applications of RT-PCR in environmental microbiology?

RT-PCR enables ecological health assessment, environmental risk evaluation, and biodiversity conservation by identifying RNA-based microorganisms. It monitors native microbial gene expression in bioremediation projects to understand contaminant breakdown pathways. RT-PCR also supports public health surveillance of viral threats like Avian Influenza in wild birds and characterizes biopesticides targeting agricultural pests through viral load confirmation.

Анализ РНК образцов окружающей среды с помощью ОТ-ПЦР

0 просмотров12:04 мин.

1. Сбор образцов: образец почвы

Найдите местоположение образца с помощью GPS, координат или прицела.
Для случайной выборки выберите случайные точки в пределах области, чтобы получить общую перепись микробных местообитаний. Отбор проб с помощью трансекты осуществляется в точках, расположенных вдоль прямой линии, например, примыкающих к руслу ручья. Сеточные образцы систематически отбираются из точек через равные промежутки времени и полезны для картирования микробных сообществ в неизвестной или изменчивой области.
Отбор проб на глубине 7,5-15 см (3-6 дюймов) обеспечивает доступ к наиболее обильной микробной активности, которая находится рядом, но не внутри ризосферы (узкая область почвы, непосредственно подверженная воздействию корней растений и связанных с ними микроорганизмов).
Чтобы собрать образец почвы, протолкните и закрутите ручной шнек в землю на заданную глубину.
Поднимите шнек. Почва находится внутри полого стебля шнека.
Соскребите почву со дна шнека в мешок для сбора грунта. Следите за тем, чтобы не прикасаться к почве и не загрязнять ее.
Правильно наклейте этикетку на сумку, указав местоположение, имя, дату и время.
В лаборатории пропустите почву через 2-миллиметровое сито, чтобы удалить гравий и камни.
Проанализируйте часть почвы на содержание влаги в почве. Для получения подробной информации об этом шаге, пожалуйста, обратитесь к обучающему видеоролику JoVE о влажности почвы.

2. Сбор образцов: образец воды

Найдите местоположение образца с помощью GPS, координат или прицела.
Наберите воду в бутылку для хранения. Записывать объем собранной воды; Если микробы в образце количественно оцениваются, то концентрацию микробов можно определить исходя из собранного объема.
Немедленно проверьте воду на любые параметры, необходимые для эксперимента (температура, pH, проводимость, соленость, содержание азота и фосфора и т.д.) с помощью соответствующих электронных зондов.
Поместите бутылку с пробой воды в холодильник со льдом. Перенесите охладитель в лабораторию.

3. Экстракция РНК

Чтобы собрать и сконцентрировать микроорганизмы из образца окружающей среды, обратитесь к обучающему видеоролику JoVE о выделении нуклеиновых кислот в сообществе.
Извлекайте РНК из вирусов с помощью коммерческого набора для экстракции в соответствии с инструкциями производителя.
Вкратце, сначала смешайте образцы с буфером для лизиса с добавлением этанола, затем добавьте образцы в спиновые колонки.
Центрифугируйте колонны при давлении примерно 12 000 x g, отбросьте поток. Добавьте в колонки промывочный буфер и снова центрифугируйте.
Добавьте в колонки воду, не содержащую РНКазы, и центрифугируйте в течение 30 с, чтобы элюировать РНК в стерильные 1,5-мл микрофуговые пробирки с низкой адгезией.

4. Обратная транскрипция - ПЦР

Достаньте из морозильной камеры при температуре -20 °C следующие реагенты: dNTP, концентрированный (например, 10-кратный) буфер для обратной транскрипции, праймеры (в данном примере случайные праймеры). Разморозьте их на льду или при комнатной температуре в чистой вытяжке, а после оттаивания держите на льду. Также извлеките обратную транскриптазу и ингибитор РНКазы и держите их на льду.
Рассчитайте объемы реагентов, необходимые для создания «мастер-микса», объединяющего все реагенты постоянными в каждой реакции (образец реакции см. в таблице 1). Подготовьте достаточное количество мастер-микса для каждого образца, а также реакции положительного контроля (с использованием известного шаблона транскриптазы) и отрицательного контроля (например, без обратной транскриптазы, с использованием только воды в качестве шаблона и т. д.). Включите дополнительные 10% к объему.
Соберите мастер-микс в пробирки объемом 1,5 мл с низким уровнем адгезии. Это сводит к минимуму связывание молекул реагента с пластиковыми стенками пробирок.
Когда реагенты разморозятся, добавьте рассчитанные объемы в микрофугальную пробирку. Аккуратно перемешайте и центрифугируйте каждую пробирку перед добавлением. Обязательно меняйте наконечники пипеток между добавлением каждого реагента, чтобы предотвратить загрязнение.
После того, как все реагенты были добавлены, вортфугируйте и центрифугируйте мастер-смесь, чтобы обеспечить однородную смесь. Верните реагенты на хранение при температуре -20 °C.
Подготовьте и промаркируйте 8-пробирочные ПЦР-полоски, обозначив одну пробирку для каждого образца или контрольной реакции.
Распределите по равному объему мастер-микса в каждую трубку. Затем добавьте компоненты, специфичные для реакции, такие как экстракты РНК.
Надежно наденьте колпачок полоски на полоску для ПЦР и центрифугируйте в миницентрифуге с адаптером для полосковой пробирки, чтобы убедиться, что вся жидкость собрана на дне каждой пробирки (Рисунок 2).
Надежно поместите ПЦР-полоску в термоамплификатор. Надавите, чтобы убедиться, что трубки надежно закреплены.
Настройте амплификатор на запуск программы, подходящей для используемого RT (образец протокола см. в Таблице 2). Когда программа будет завершена, пробирки будут содержать продукты кДНК, которые затем можно будет подвергнуть амплификации ПЦР. Для получения подробной информации, пожалуйста, обратитесь к видеороликам JoVE Science Education по ПЦР и количественной ПЦР. Храните кДНК при температуре -20 °C до использования.

Рисунок 2. Закрытая 8-трубочная полоса, содержащая мастер-смесь и экстракт.

См.

реагент	Объем на 1 реакцию (μл)
10x RT буфер	2.0
25x dNTP	0,8
10x Случайный праймер	2.0
Мультискрипт	1.0
Ингибитор РНКАЗ	1.0
Молекулярный класс H₂O	3.2
Общий объем	10