2.8: Анализ РНК образцов окружающей среды с помощью ОТ-ПЦР

1. Сбор образцов: образец почвы

1. Найдите местоположение образца с помощью GPS, координат или прицела.
2. Для случайной выборки выберите случайные точки в пределах области, чтобы получить общую перепись микробных местообитаний. Отбор проб с помощью трансекты осуществляется в точках, расположенных вдоль прямой линии, например, примыкающих к руслу ручья. Сеточные образцы систематически отбираются из точек через равные промежутки времени и полезны для картирования микробных сообществ в неизвестной или изменчивой области.
3. Отбор проб на глубине 7,5-15 см (3-6 дюймов) обеспечивает доступ к наиболее обильной микробной активности, которая находится рядом, но не внутри ризосферы (узкая область почвы, непосредственно подверженная воздействию корней растений и связанных с ними микроорганизмов).
4. Чтобы собрать образец почвы, протолкните и закрутите ручной шнек в землю на заданную глубину.
5. Поднимите шнек. Почва находится внутри полого стебля шнека.
6. Соскребите почву со дна шнека в мешок для сбора грунта. Следите за тем, чтобы не прикасаться к почве и не загрязнять ее.
7. Правильно наклейте этикетку на сумку, указав местоположение, имя, дату и время.
8. В лаборатории пропустите почву через 2-миллиметровое сито, чтобы удалить гравий и камни.
9. Проанализируйте часть почвы на содержание влаги в почве. Для получения подробной информации об этом шаге, пожалуйста, обратитесь к обучающему видеоролику JoVE о влажности почвы.

2. Сбор образцов: образец воды

1. Найдите местоположение образца с помощью GPS, координат или прицела.
2. Наберите воду в бутылку для хранения. Записывать объем собранной воды; Если микробы в образце количественно оцениваются, то концентрацию микробов можно определить исходя из собранного объема.
3. Немедленно проверьте воду на любые параметры, необходимые для эксперимента (температура, pH, проводимость, соленость, содержание азота и фосфора и т.д.) с помощью соответствующих электронных зондов.
4. Поместите бутылку с пробой воды в холодильник со льдом. Перенесите охладитель в лабораторию.

3. Экстракция РНК

1. Чтобы собрать и сконцентрировать микроорганизмы из образца окружающей среды, обратитесь к обучающему видеоролику JoVE о выделении нуклеиновых кислот в сообществе.
2. Извлекайте РНК из вирусов с помощью коммерческого набора для экстракции в соответствии с инструкциями производителя.
3. Вкратце, сначала смешайте образцы с буфером для лизиса с добавлением этанола, затем добавьте образцы в спиновые колонки.
4. Центрифугируйте колонны при давлении примерно 12 000 x g, отбросьте поток. Добавьте в колонки промывочный буфер и снова центрифугируйте.
5. Добавьте в колонки воду, не содержащую РНКазы, и центрифугируйте в течение 30 с, чтобы элюировать РНК в стерильные 1,5-мл микрофуговые пробирки с низкой адгезией.

4. Обратная транскрипция - ПЦР

1. Достаньте из морозильной камеры при температуре -20 °C следующие реагенты: dNTP, концентрированный (например, 10-кратный) буфер для обратной транскрипции, праймеры (в данном примере случайные праймеры). Разморозьте их на льду или при комнатной температуре в чистой вытяжке, а после оттаивания держите на льду. Также извлеките обратную транскриптазу и ингибитор РНКазы и держите их на льду.
2. Рассчитайте объемы реагентов, необходимые для создания «мастер-микса», объединяющего все реагенты постоянными в каждой реакции (образец реакции см. в таблице 1). Подготовьте достаточное количество мастер-микса для каждого образца, а также реакции положительного контроля (с использованием известного шаблона транскриптазы) и отрицательного контроля (например, без обратной транскриптазы, с использованием только воды в качестве шаблона и т. д.). Включите дополнительные 10% к объему.
3. Соберите мастер-микс в пробирки объемом 1,5 мл с низким уровнем адгезии. Это сводит к минимуму связывание молекул реагента с пластиковыми стенками пробирок.
4. Когда реагенты разморозятся, добавьте рассчитанные объемы в микрофугальную пробирку. Аккуратно перемешайте и центрифугируйте каждую пробирку перед добавлением. Обязательно меняйте наконечники пипеток между добавлением каждого реагента, чтобы предотвратить загрязнение.
5. После того, как все реагенты были добавлены, вортфугируйте и центрифугируйте мастер-смесь, чтобы обеспечить однородную смесь. Верните реагенты на хранение при температуре -20 °C.
6. Подготовьте и промаркируйте 8-пробирочные ПЦР-полоски, обозначив одну пробирку для каждого образца или контрольной реакции.
7. Распределите по равному объему мастер-микса в каждую трубку. Затем добавьте компоненты, специфичные для реакции, такие как экстракты РНК.
8. Надежно наденьте колпачок полоски на полоску для ПЦР и центрифугируйте в миницентрифуге с адаптером для полосковой пробирки, чтобы убедиться, что вся жидкость собрана на дне каждой пробирки (Рисунок 2).
9. Надежно поместите ПЦР-полоску в термоамплификатор. Надавите, чтобы убедиться, что трубки надежно закреплены.
10. Настройте амплификатор на запуск программы, подходящей для используемого RT (образец протокола см. в Таблице 2). Когда программа будет завершена, пробирки будут содержать продукты кДНК, которые затем можно будет подвергнуть амплификации ПЦР. Для получения подробной информации, пожалуйста, обратитесь к видеороликам JoVE Science Education по ПЦР и количественной ПЦР. Храните кДНК при температуре -20 °C до использования.

Рисунок 2. Закрытая 8-трубочная полоса, содержащая мастер-смесь и экстракт.

Таблица 1. Ингредиенты RT Master Mix.

Таблица 2. Программа реакционного амплификатора RT.

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией, или ОТ-ПЦР, позволяет обнаруживать РНК-вирусы и экспрессию микробных генов в окружающей среде.

В отличие от клеточных организмов от человека до бактерий, которые используют ДНК в качестве генетического материала, некоторые вирусы имеют геномы, состоящие из РНК, в том числе многие патогенные вирусы, такие как грипп, лихорадка Эбола и ВИЧ. В то время как некоторые вирусы могут быть обнаружены путем наблюдения за патогенным фенотипом, который развивается при использовании для инфицирования клеток в клеточной культуре, большинство вирусов не имеют методов характеризации, основанных на культурах. ОТ-ПЦР может быть использована для обнаружения присутствия этих вирусов в окружающей среде с высокой чувствительностью.

В то же время организмы с геномами, основанными на ДНК, «экспрессируют» генетическую информацию, закодированную в их геномах ДНК, «транскрибируя» их в матричную или «м»РНК, которая затем может быть «переведена» в белки для выполнения ферментативной или структурной функции в клетках. Поскольку микробы реагируют и адаптируются к изменениям в окружающей среде, включая или выключая различные генетические пути, ОТ-ПЦР может быть использована для мониторинга таких изменений в экспрессии генов, чтобы служить потенциальными оценщиками экосистемы.

В этом видео будут рассмотрены принципы, лежащие в основе ОТ-ПЦР, описана общая процедура выполнения этого метода и, наконец, рассмотрены некоторые способы применения этого метода в микробиологии окружающей среды в настоящее время.

Эта процедура состоит из двух ключевых частей: извлечения РНК из биологических образцов с последующей ее обратной транскрипцией в ДНК.

Выделение РНК включает в себя лизирование клеток в образце путем добавления детергента, который расщепляет липиды и белки, с последующим механическим разрушением. Извлечение РНК из вирусов обычно требует добавления протеиназ, которые являются ферментами, переваривающими белки, для разрушения капсидов вирусов - жестких белковых оболочек, из которых состоит вирусная частица. С другой стороны, при получении РНК из клеточных организмов лизат может потребоваться обработать ферментами, разрушающими ДНК, или ДНКазами, чтобы избежать искажения последующих результатов присутствием химически сходной ДНК.

Затем РНК может быть очищена от лизатов одним из двух способов. В одном из методов, известном как кислотная экстракция гуанидинием тиоцианатом-фенол-хлороформом, лизат смешивают с органо-водной смесью, которая затем центрифугируется для разделения фаз. Белки будут разделены на органическую фазу, лизированные клеточные остатки — на мутную интерфазу, а нуклеиновые кислоты — на водную фазу. Верхняя водная фаза может быть собрана, и РНК осаждается добавлением спирта, такого как изопропанол, который снижает растворимость нуклеиновой кислоты в воде.

При выделении РНК на основе колонок лизат смешивают со спиртом, а затем пропускают через колонку для фильтрации геля с отрицательно заряженной смолой, такой как диоксид кремния. Лизат готовится таким образом, что положительно заряженные ионы в буфере образуют «солевые мостики», которые позволяют отрицательно заряженному фосфатному каркасу нуклеиновых кислот связываться со смолой. Затем смываются все остальные загрязнения. Нуклеиновые кислоты «элюируются» из колонки с помощью буфера с низким содержанием солей или воды. Поскольку одноцепочечная РНК имеет меньше отрицательных зарядов, чем двухцепочечная ДНК, она может быть преимущественно элюирована с использованием буферов определенных концентраций.

После выделения РНК превращается в более химически стабильную ДНК. Ученые использовали фермент, который естественным образом кодируется ретровирусами, такими как ВИЧ. Этот фермент известен как обратная транскриптаза, или «ЛТ».

ОТ синтезирует комплементарную или «с»ДНК из короткого участка нуклеотидов, известного как праймер. Этот праймер может иметь различную последовательность, в зависимости от цели эксперимента. Например, праймер может быть сконструирован таким образом, чтобы иметь определенную последовательность, чтобы обнаруживать определенные гены или организмы. После синтеза эта кДНК «первой нити» может быть амплифицирована с помощью обычной ПЦР.

Теперь, когда у нас есть понимание принципов, лежащих в основе ОТ-ПЦР, давайте рассмотрим протокол выполнения этого метода на образцах РНК, собранных из окружающей среды.

Чтобы начать процедуру, найдите место сбора проб с помощью GPS-координат или прицела. Выбирайте случайные точки в пределах области, чтобы получить общее представление о местах обитания микробов.

Чтобы собрать твердый образец, протолкните и закрутите ручной шнек в грунтовый грунт на заданную глубину. Когда шнек поднят, в полом стебле шнека можно найти почву.

Этот грунт соскребают прямо в мешок для сбора грунта, и на мешок наносится этикетка с указанием места, названия, даты, времени сбора и любой другой необходимой информации.

Перенесите грунт в лабораторию и пропустите грунт через 2-миллиметровое сито, чтобы удалить гравий и камень. Проанализируйте образец почвы на содержание влаги, что может быть информативным о уровне микробной активности в почве. Для этого обратитесь к видео этой подборки "Определение влажности почвы".

Для сбора проб воды выберите интересующее вас место, похожее на сбор почвы, и соберите воду в стерильную толстостенную пластиковую бутылку. Обратите внимание на объем собранной воды. Немедленно проверьте воду на такие параметры, как температура, pH и соленость, которые могут предоставить важную информацию об ожидаемых уровнях микроорганизмов в образце. Затем поместите бутылку в холодильник и перенесите в лабораторию.

Микроорганизмы, такие как вирусы, собираются и концентрируются из образца окружающей среды.

РНК может быть выделена из собранных вирусов методом спиновой колонки с использованием коммерческих наборов для экстракции РНК в соответствии с инструкцией производителя. Буфер для лизиса, дополненный этанолом, сначала смешивают с образцом. Поместите соответствующее количество спиновых колонок в пробирки для сбора, затем нанесите образцы на матрицу колонок. Центрифугируйте колонки при температуре приблизительно 12 000 x g в течение 1-2 минут, чтобы нуклеиновые кислоты соединились с колонкой, и отбросьте протекающую жидкость.

Добавьте в колонки промывочный буфер и снова центрифугируйте. Поместите колонки в новые, стерильные пробирки с низкой адгезией объемом 1,5 мл. Затем добавьте воду, свободную от РНКаз, которые являются ферментами, разрушающими РНК, в колонки и центрифугируйте в течение 30 секунд, чтобы разбавить РНК. Элюированная РНК может храниться при -80 ? C до использования.

Перед началом эксперимента должны быть разработаны соответствующие праймеры для того, чтобы обнаружить интересующие последовательности, которые могут служить маркерами присутствия конкретных микроорганизмов.

Исключите реактивы RT, хранящиеся при -20 ? C, и разморозьте замороженные реагенты на льду (или при комнатной температуре). К ним относятся нуклеотиды, буфер для обратной транскрипции и праймеры. После размораживания держите реагенты на льду; фермент обратной транскриптазы и ингибитор РНКазы всегда следует держать на льду.

Пока реагенты оттаивают, рассчитайте объемы и концентрации компонентов реакции. После того, как реагенты разморозятся, аккуратно сделайте вихрь и вращайте каждую пробирку, чтобы убедиться, что содержимое хорошо перемешано.

Работая в ламинарном проточном колпаке, чтобы избежать загрязнения, соберите компоненты в мастер-смесь для добавления в каждую ПЦР-пробирку. При сборке основной смеси в пробирке Eppendorf обязательно меняйте наконечники пипеток между каждым реагентом, чтобы предотвратить загрязнение. После того как все реагенты будут добавлены в пробирку Eppendorf, аккуратно закрутите и раскрутите основную пробирку для смешивания, чтобы получить однородную смесь.

Промаркируйте набор пробирок для ПЦР, обязательно включив в них контрольные пробирки. Равномерно распределите по объему мастер-микса в каждую трубку. Затем добавьте компоненты, специфичные для реакции, такие как экстракты РНК или вода для отрицательного контроля.

После добавления всех компонентов поместите пробирки в амплификатор и запустите программу обратной транскрипции. Затем кДНК может быть подвергнута амплификации ПЦР. Подробное описание этого шага см. в видео этой коллекции по ПЦР.

Когда ПЦР завершена, часть продукта ПЦР может быть отделена и визуализирована на агарозном геле. Например, здесь был использован ген-специфический праймер для обнаружения наличия РНК-вируса. Полосы ожидаемого размера получаются в результате реакции ОТ-ПЦР, а не в результате отрицательного контроля, что указывает на присутствие этого вируса в исследуемой пробе воды.

Идентификация микроорганизмов на основе РНК с помощью ОТ-ПЦР позволяет анализировать экологическое здоровье, экологические риски и сохранение биоразнообразия.

Использование микроорганизмов для очистки загрязненной почвы и воды от углеводородов и растворителей представляет собой экологически устойчивую альтернативу восстановлению. Понимание экспрессии нативных микробных генов может выявить конкретные микробные пути, которые расщепляют загрязняющие вещества в этих условиях. ОТ-ПЦР часто используется для амплификации мРНК из таких образцов окружающей среды.

Меры общественного здравоохранения часто требуют оперативного эпиднадзора за вирусными источниками инфекции в окружающей среде. Птичий грипп, например, очень заразен и может быстро распространяться на домашнюю птицу, домашний скот и даже человека. В этом конкретном примере исследователи искали угрозу птичьего гриппа, распространяемого дикими птицами.

Используя портативную установку и аппарат для ОТ-ПЦР, они проверили ряд диких птиц, даже в отдаленных районах, чтобы выявить инфекции на ранней стадии и предотвратить передачу.

Наконец, ОТ-ПЦР может быть использована для характеристики «биопестицидов», разрабатываемых для борьбы с вредителями, такими как стрелок со стеклянными крыльями, Homalodisca vitripennis, хозяин болезни, которая серьезно повреждает виноградную лозу в Северной Америке. В настоящее время разрабатывается новый одноцепочечный РНК-вирус в качестве агента для заражения этого насекомого. Используя комбинацию клеточной культуры Homalodisca и подтверждения вирусной нагрузки методом ОТ-ПЦР, авторы смогли размножить вирус в высокой концентрации для использования в качестве агента биологического контроля.

Вы только что посмотрели введение JoVE в «Анализ микроорганизмов на основе РНК окружающей среды методом ОТ-ПЦР». Теперь вы должны понять теорию, лежащую в основе протокола, как применять эту технику в своих исследованиях и некоторые способы, которыми она используется в этой области сегодня. Спасибо за просмотр!