Подготовка одноклеточных суспензий из селезенки мыши с gentleMACS диссоциатор

В этом видеопротоколе вы увидите, как диссоциировать селезенку мыши с помощью Gentle Max, автоматизированного настольного устройства, которое может механически разрушать ткани с помощью специальных трубок для производства жизнеспособных клеточных суспензий. После диссоциации селезенка фильтруется с помощью разделительных фильтров Max Pres, центрифуги и суспензируется для дальнейшего применения. Здравствуйте, меня зовут Мелани млу.

Я работаю ученым в Milton Biotech здесь, в BE Lab Park, Германия. Сегодня я покажу вам приготовление суспензии одиночных клеток из селезенки мыши с помощью этой диссоциации GenX. Диссоциация GenX позволяет очень легко и быстро получить суспензию для одной клетки.

Итак, приступим. Чтобы избежать утомительных и часто болезненных мануальных диссоциаций, щадящий ассоциатор max di позволяет очень эффективно диссоциировать ткань в контролируемых и воспроизводимых условиях. Ткань мягко диссоциируется с помощью фиолетовых С-трубок в жизнеспособные одиночные клеточные суспензии.

С-образная трубка имеет герметичное отверстие для перегородки в центре колпачка, что позволяет проводить пипетирование из пробирки, всегда сохраняя стерильность. Чтобы приостановить диссоциированные клетки, вам нужно будет использовать правильный буфер P-B-S-B-S-A-E-D-T-A. Буфер готовят путем добавления одной части стокового раствора BSA к 20 частям раствора для ограждения AutoMax, содержащего ЭДТА.

С помощью разделительных фильтров Max Pres диссоциативные образцы тканей освобождаются от всех клеточных сгустков, что способствует успешному максимальному разделению и последующему анализу. Чтобы начать процедуру, мы загружаем С-трубку объемом буфера. Согласно массе селезенки, здоровая селезенка шести-семинедельной самки мыши с биопсией весит от 80 до 120 миллиграммов.

На одну-две селезенки этой массы требуется три миллилитра буфера. Не должны превышать общий объем в 10 миллилитров. Теперь мы можем добавить нашу рассеченную селезенку в С-трубку, содержащую три миллилитра буферной селезенки от старых животных или животных с инфекциями, которые часто больше и должны быть взвешены в буфере.

Затем буферные объемы должны быть соответствующим образом масштабированы, но опять же не должны превышать общий объем в 10 миллилитров. Теперь убедитесь, что колпачок С-образной трубки плотно затянут, и прикрепите С-образную трубку к диссоциации Опустив колпачок, включите диссоциацию для одного-двух селезенок выберите Программа М селезенка о-о-о-о. На выполнение программы уйдет 56 секунд, если количество селезенок больше.

Эта программа может быть использована для получения до 720 миллиграммов ткани селезенки. После завершения программы нативная ткань селезенки диссоциируется в суспензию цитов PLE, которая выглядит как эта центрифуга на короткое время для сбора образца на дне пробирки. Это гарантирует, что ротор и статор будут освобождены от всех ячеек, которые собираются в нижней части С-трубки.

Извлекаем образец через герметизированное отверстие перегородки в крышке С-пробирки с помощью дозатора в тысячу микролитров. Чтобы начать этап фильтрации, мы прикладываем диссоциированную ткань к фильтру предварительного разделения или сетчатому фильтру с размером пор 30 микрон. В ситечко должна помещаться 15-миллилитровая трубка для одной-двух селезенок или 50-миллилитровая трубка для более чем двух селезенок.

Дайте клеточной суспензии пройти, после чего промойте фильтр, нанеся пять миллилитров буфера. Теперь центрифугируйте пробирку с клеточной суспензией при давлении 300 G при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы собрать все циты в гранулу селезенки. Теперь, когда у нас есть гранула диссоциированных цитов, мы должны аспирировать супернатин и ресуспендировать клеточную гранулу в соответствующем количестве буферной диссоциации селезенки.

Использование мягкого max дает высокий процент жизнеспособных PLE-цитов, что демонстрируется проточной цитометрией с использованием максимального количества. Мертвые клетки окрашиваются йодидом пропидия и приведенным примером. На графике с рассеянными точками на передней стороне показаны подготовленные СП циты. Хорошо.

Я показал вам, как диссоциировать ткань селезенки с помощью этой мягкой X-диссоциации. Когда вы выполняете эту процедуру, важно отрегулировать количество буфера в соответствии с размером выборки и выбрать правильную программу Gentle X. Ладно, вот и все.

Удачи в вашем эксперименте.