5.3: Основы разведения и отъема

1. Информация, необходимая при спаривании животных, включает в себя породу/поголовье животного с использованием соответствующей номенклатуры, даты рождения самца и самки заводчика, а также дату спаривания животных. Точное ведение учета является обязательным условием для гнездовых колоний.

2. Определение пола мышей и крыс проводится путем сравнения аногенитальных расстояний. У самок расстояние между анальным отверстием и наружными половыми органами короче, чем у самцов. Наличие мошоночного мешка у самцов животных является еще одним половым индикатором.

3. Выбор и настройка схемы сопряжения

ПРИМЕЧАНИЕ: Существует две схемы сопряжения, которые можно использовать.

1. Спаривание по времени проэструса/течки: Этот метод основан на скрещивании самок с самцами в момент максимальной восприимчивости и фертильности.
   1. Эстральный цикл у самок должен контролироваться либо путем визуального осмотра наружных половых органов на предмет изменений, указывающих на проэструс и эструс, либо с помощью цитологии вагинального секрета (см. ниже).
   2. Когда самка определяется как находящаяся в проэструсе или течке, она объединяется с самцом в конце дня, так как животные обычно спариваются ночью.
   3. На следующее утро самку осматривают на предмет копулятивной пробки (см. ниже). Если пробки нет, самка может оставаться с самцом в течение дня и проверяться на наличие копулятивной пробки в конце дня. В качестве альтернативы, если установлено, что она больше не находится в проэструсе или течке, ее удаляют из клетки для разведения.
2. Случайное спаривание по времени: Этот метод основан на том, что эстральный цикл грызунов очень короткий, 4-5 дней.
   1. Для этого метода спаривание может быть организовано в любое время, а затем самок проверяют на наличие копулятивных пробок каждое утро и вечер до тех пор, пока не будет замечена пробка.
   2. Самка объединяется в пару с самцом в вечернее время.
   3. Ее проверяют на наличие копулятивной пробки в начале и в конце каждого дня до тех пор, пока не будет замечена пробка. Обычно при использовании этого метода требуется 3 или более дней, чтобы увидеть вилку.

4. Прогнозирование беременности

Поскольку пальпация щенков затруднена до более поздних сроков беременности, примерно на 10-12 день, были разработаны коммерческие ультразвуковые системы для грызунов; Тем не менее, немногие исследовательские центры на животных обладают этой технологией. Таким образом, визуализация копулятивных пробок, наблюдение за вагинальными изменениями или вагинальная цитология обычно используются для прогнозирования того, когда самка зачала помет (см. ниже). Однако ни один из этих методов не способен подтвердить беременность. Как только наблюдается копулятивная пробка, самку следует наблюдать на наличие признаков беременности, таких как увеличение веса.

5. Определение стадии эстрального цикла

1. Визуальный осмотр
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для своевременного спаривания мышей и крыс визуальное наблюдение за влагалищем на предмет изменений, которые указывают на проэструс и течку, является самым быстрым методом определения стадии эстрального цикла, и оно не требует специального оборудования.
   1. При оценке эстрального цикла с помощью визуального метода важно проводить визуальный осмотр в одной и той же зоне по отношению к освещению помещения, так как источник света может изменить воспринимаемый цвет тканей влагалища и затруднить оценку. Например, фиолетовый оттенок, отбрасываемый светодиодными лампами, затрудняет визуальное обнаружение.
   2. Чтобы оценить стадию эстрального цикла по визуальному наблюдению, каждую мышь необходимо вручную удерживать за хвост, при этом передние лапы упираются в крышку клетки.
   3. Вход во влагалище каждой женщины оценивается на основе состояния тканей, окружающих область влагалища, и размера входа во влагалище. ²
      1. Во время протечки вход во влагалище широкий и характеризуется набуханием окружающих тканей. Ткань розового цвета и очень влажная. Часто наблюдаются морщины или бороздки вдоль дорсального и вентрального краев отверстия.
      2. Во время течки отек тканей, окружающих вход во влагалище, уменьшается, и ткани становятся не такими влажными и розовыми.
      3. Во время метеструса вход во влагалище минимальный, а отек незначителен.
      4. Во время диэструса не наблюдается отека тканей вокруг области влагалища, а вход во влагалище небольшой и закрытый.
2. Цитология влагалища
   Поскольку и мыши, и крысы являются полиэстральными, продолжительность цикла течки очень короткая, колеблется от 4 до 5 дней. Иногда необходимо выделить все четыре стадии течки: проэструс, течку, метеструс и диэструс. Вагинальная цитология является очень точным методом определения этих стадий. Существует также два метода сбора образцов: неинвазивный метод промывания влагалища и инвазивный метод взятия мазка из вагинального канала.
   1. Промывание влагалища
      1. Необходимые материалы: стерильные наконечники для пипеток объемом 200 μл, латексные лампы, стерильная двойная дистиллированная вода (ddH₂0) и чистые стеклянные предметные стекла.
      2. Поместите латексную колбу на конец стерильного наконечника объемом 200 мкл. Наберите в пипетку примерно 100 мкл стерильного ddH₂O.
      3. Поднимите мышь из клетки и поместите ее на верхнюю часть клетки из проволочной решетки хвостом к себе.
      4. Крепко возьмитесь за хвост и поднимите заднюю часть тела мыши. Теперь у мыши будут только передние лапы, цепляющиеся за крышку.
      5. Если мышь мочится, подождите, пока мочеиспускание прекратится. Если у входа во влагалищный канал осталась моча, отверстие можно промыть небольшим количеством ddH₂O. Поменяйте наконечник, который использовался для полоскания.
      6. Поместите конец наконечника, заполненного ddH₂O, к отверстию вагинального канала, не проникая в отверстие.
      7. Осторожно надавите на грушу, чтобы вытолкнуть от четверти до половины объема воды (~25-50 мкл) в месте входа во влагалищный канал. Жидкость будет самопроизвольно аспирироваться в канал без введения наконечника. Медленно ослабьте давление, оказываемое на колбу. Жидкость будет отходить обратно в наконечник.
      8. Избегайте слишком быстрого сброса давления, чтобы предотвратить аспирацию жидкости в колбу. Для этой цели может пригодиться отфильтрованный наконечник.
      9. Повторите предыдущий шаг 4-5 раз, используя один и тот же наконечник, луковицу и жидкость, чтобы получить достаточное количество клеток в одном образце.
      10. Поместите жидкость на предметное стекло и дайте мазку полностью высохнуть при комнатной температуре.
      11. Используйте новую пипетку для каждой мыши.
      12. После высыхания эти течные мазки можно сразу же окрашивать или хранить и окрашивать позже. Окрашивание по методу Райта-Гимзы чаще всего используется для окрашивания предметных стекол. Это морилка доступно в продаже в виде одноэтапного морилки, не требующей фиксации предметного стекла для предотвращения смывания клеток в процессе окрашивания. Предметное стекло помещается в пятно на 45-60 секунд, в соответствии с инструкциями производителя.
      13. Затем слайды исследуются под микроскопом, и видимые клетки соответствуют стадии цикла: 1) если самка находится в проэструсе, клетки видны как скопления круглых, хорошо сформированных эпителиальных клеток с ядром и ядром, которое окрашивается темнее, чем цитоплазма; 2) если самка находится в период течки, то большинство клеток представляют собой ороговевшие клетки плоского эпителия, которые не имеют ядра, имеют угловатый вид и встречаются в плотно упакованных кластерах; 3) если самка находится в состоянии metestrus, то клетки, как правило, представляют собой белые кровяные тельца (в частности, нейтрофилы с присутствием некоторых ороговевших плоских эпителиальных клеток) с темно окрашенными ядрами, которые имеют форму двух сосисок, соединенных вместе; 4) Во время диэструса присутствующие клетки обычно являются лейкоцитами с возникновением нескольких эпителиальных клеток с ядрами.
   2. Мазок из влагалища
      1. В качестве материала используются стерильные аппликаторы с ватным наконечником и наконечником диаметром 2 мм, предметные стекла для микроскопа из чистого стекла и стерильный физиологический раствор.
      2. Смочите аппликатор с ватным наконечником солевым раствором.
      3. Введите кончик аппликатора во влагалище сдерживаемой мыши.
      4. Аккуратно поверните и прикатите кончик к стенке влагалища. Осторожно извлеките тампон.
      5. Клетки переносят на сухое предметное стекло путем прокатывания тампона по предметному стеколу.
      6. Как только предметное стекло высохнет, его можно окрасить морилкой Райта-Гимзы.
         Взятие мазка считается стрессовой процедурой, и в состоянии стресса у мышей могут нарушиться эстральные циклы. Вагинальная и цервикальная стимуляция, вызванная взятием мазка, может вызвать ложную беременность. Повторные мазки слизистой оболочки влагалища могут привести к повреждению, если они не выполняются аккуратно, с надлежащим удержанием и с использованием ватных тампонов правильного размера. ^3,4

Рисунок 2. Цитология влагалища -- различные стадии цикла течки у грызунов

6. Визуализация копулятивной пробки

Эта пробка состоит из вагинальной жидкости и спермы и сохраняется во влагалище в течение 12-24 часов после копуляции. Наличие пробки подтверждает случку, но не гарантирует, что самка беременна. Если закупоренная самка беременна, то первым днем беременности считается день после обнаружения пробки.

1. Выньте мышь из клетки и положите ее на верхнюю часть клетки из проволочной перекладины хвостом к себе.
2. Расположите мышь, надавливая чуть выше хвоста, чтобы выгнуть спину, чтобы обеспечить лучшее представление входа во влагалище.
3. Осмотрите ее вход во влагалище на предмет белесого образования. Копулятивная пробка может быть визуально не очевидной, но может быть подтверждена с помощью тупого зонда.
4. С помощью кончика зонда аккуратно введите его во влагалищное отверстие. Наличие копулятивной пробки будет препятствовать продвижению зонда в пределах 0,5 см от входа во влагалище.
5. Щуп необходимо продезинфицировать спиртом и полностью высушить перед каждым использованием.

Поскольку у самки есть пометы, следует регистрировать дату рождения, размер помета, количество рожденных, количество отлученных от груди, соотношение котят и щенков женского пола, а также соотношение генотипов. Если генотипы в помете не соответствуют генотипам родителей, необходимо провести повторное тестирование для проверки истинного генотипа.

7. Отлучение от груди

Беременность у мышей и крыс составляет примерно 21 день. Молодняк отлучается от груди в возрасте 21-28 дней. Как мыши, так и крысы могут размножаться уже в возрасте 8 недель, поэтому крайне важно, чтобы детеныши были разделены по полу в раннем возрасте. Интенсивное разведение требует, чтобы щенки из каждого помета были отлучены от груди на 20-й день, чтобы старшие щенки не присутствовали при рождении следующего помета. Для неинтенсивного разведения детенышей можно оставлять с матерью после 20-дневного возраста, часто до 28-дневного возраста. Это может быть очень полезно для многих генетически модифицированных штаммов, так как щенки могут быть не такими энергичными, как немодифицированные или дикие животные.

Детенышей мужского и женского пола разделяют при отъеме. По возможности только что отлученных от груди щенков не следует содержать поодиночке. Если в помете есть только один щенок определенного пола, следует попытаться разместить этого щенка вместе с другими щенками того же пола. Возможные варианты содержания: 1) один щенок самки может остаться с матерью, если не в клетке для интенсивного разведения; 2) один щенок женского пола или самца может быть помещен в организм других щенков того же пола из другого помета того же возраста; 3) если родители представляют собой моногамную пару, самку можно удалить из клетки, чтобы позволить одному детенышу мужского пола содержаться вместе с отцом; и 4) один щенок мужского пола может содержаться вместе с братьями и сестрами женского пола в возрасте до 5 недель. Пол щенков должен быть проверен через неделю после отъема, чтобы предотвратить нежелательные пометы от неправильно сегрегированных щенков.

Отлученных от груди мышей и крыс следует проверять ежедневно, чтобы убедиться, что они процветают. Хотя в Руководстве по уходу за лабораторными животными и их использованию⁵ указано, что пищу следует давать животным таким образом, чтобы она не пачкалась фекалиями и мочой, только что отлученным мышам следует давать небольшое количество пищи (одна гранула на мышь), помещенную в стеклянную миску (чашку Петри) на полу клетки. Это побудит животных перейти на грызунов-грызунов в качестве единственного источника пищи. Даже для животных, которые содержатся на стеллажах, которые обеспечивают клетки водой через автоматическую систему поения, в клетку можно добавить бутылку с водой, если мыши кажутся обезвоженными.

Таблица 1. Обычно используются морилки для мышей и приклады.

Таблица 2. Обычно используются крысиные штаммы и поголовья.

Каждый год миллионы мышей и крыс разводятся для использования в биомедицинских исследованиях, и многие учреждения выбирают это для снижения затрат и расширения возможностей исследований. Преимущества разведения в домашних условиях заключаются в том, что: 1) исследователи могут манипулировать генетикой животных путем селекции, 2) они могут планировать беременность в соответствии с потребностями исследований, и 3) они могут работать с эмбрионами и новорожденными по мере необходимости. Однако, чтобы наладить успешную схему разведения, следует понимать эстральный цикл грызунов. Кроме того, они должны обладать знаниями о различных схемах спаривания, факторах, влияющих на поведение при размножении грызунов, и соображениях по отлучению от груди. Обо всем этом пойдет речь в этой видеопрезентации.

Начнем с обзора эстрального цикла у грызунов. И самки крыс, и мыши являются полиэстральными, что означает, что у них бывает более одного цикла течки в течение года или сезона размножения. Каждый цикл длится 4-5 дней и может быть разделен на 4 этапа: метеструс, диэструс, проэструс и течка. Течка – это овуляторная фаза, что означает, что если самка находится в проэструсе или фазе течки, она готова к зачатию.

Одним из способов определения стадии эстрального цикла является визуальный осмотр. Вручную удерживайте животное за хвост и так, чтобы передние лапы упирались в крышку клетки и внимательно осматривайте размеры входа во влагалище и окружающих тканей. Во время фазы проэструса вход во влагалище широкий и характеризуется набуханием окружающих тканей, которые имеют розовый цвет и очень влажные. Часто наблюдаются морщины или бороздки вдоль дорсального и вентрального краев отверстия. Во время течки отек вокруг входа во влагалище уменьшается, а ткани становятся не такими влажными и розовыми. Во время метеструса вход во влагалище минимален и наблюдается незначительный отек. Во время диэструса не наблюдается отека тканей вокруг области влагалища, а отверстие маленькое или закрытое.

Другим, более точным подходом к определению стадии эстрального цикла является вагинальная цитология, для которой образцы клеток собираются либо путем промывания мочи, либо взятия мазка. Для промывания поместите латексную колбу на конец стерильного наконечника объемом 200 микролитров и наберите в пипетку примерно 100 микролитров стерильной двойной дистиллированной воды. Затем поднимите мышь из клетки и поместите ее на верхнюю часть клетки из проволочной перекладины хвостом к себе. Крепко возьмитесь за хвост и поднимите задние конечности мыши так, чтобы за крышку держались только передние лапы. Поместите конец запломбированного наконечника в отверстие вагинального канала, не проникая через отверстие. Осторожно надавите на грушу, чтобы вытолкнуть примерно 25-50 микролитров воды из входа во влагалище. Жидкость будет самопроизвольно аспирироваться в канал без введения наконечника. Медленно ослабьте давление, оказываемое на грушу, и жидкость вернется в наконечник. Повторите 4-5 раз, используя одну и ту же палочку, луковицу и жидкость, чтобы получить достаточное количество клеток в одном образце. Поместите жидкость на предметное стекло и дайте мазку полностью высохнуть при комнатной температуре. После высыхания эти течные мазки можно сохранить для последующего использования, или же их можно сразу окрашивать с помощью морилки Райта-Гимзы, которая является одноступенчатой морилкой и не требует фиксации. Предметное стекло помещается в пятно на 45-60 секунд.

С другой стороны, для взятия мазка смочите 2-миллиметровый аппликатор с ватным наконечником физиологическим раствором. Введите кончик аппликатора во влагалище сдерживаемой мышки и аккуратно поверните и прикатите кончик к стенке влагалища. Затем осторожно извлеките тампон и перенесите ячейки на сухое предметное стекло, прокатив тампон по предметному стеклу. Эта процедура считается стрессовой и может привести к повреждению, если не выполнять ее мягко, с должным удержанием и ватными тампонами правильного размера. Как и при промывании, как только предметное стекло высохнет, его можно испачкать морилкой Райта-Гимзы. После окрашивания предметные стекла можно рассмотреть под микроскопом.

Если самка находится в проэструсе, клетки видны как скопления круглых, хорошо сформированных, ядросодержащих эпителиальных клеток с ядром, которое окрашивается темнее, чем цитоплазма. Если она находится в фазе течки, большинство клеток представляют собой ороговевшие клетки плоского эпителия, у которых отсутствует ядро. Они имеют угловатый вид и собраны в плотно упакованные грозди. Если самка находится в метеструсе, клетки, как правило, представляют собой белые кровяные тельца, в частности нейтрофилы, с присутствием некоторых ороговевших клеток плоского эпителия. Во время диэструса присутствующими клетками обычно являются лейкоциты с возникновением нескольких эпителиальных клеток с ядрами.

Теперь, когда у вас есть понимание эстрального цикла у грызунов, давайте обсудим, как организовать спаривание. Первым шагом является определение пола, которое осуществляется путем сравнения аногенитальных расстояний. У самок расстояние между анальным отверстием и наружными половыми органами короче, чем у самцов. Основываясь на потребностях исследований и эффективности разведения сорта, схема спаривания может быть моногамной, когда одна самка скрещивается с одним самцом, или полигамной, где две или более самки скрещиваются с одним самцом.

Что касается сроков, учитывая, что эстральный цикл у грызунов короткий – всего 4-5 дней – можно организовать спаривание случайным образом. Или они могут организовать «спаривание по времени», которое включает в себя введение самки в клетку для спаривания, когда она находится в точке максимальной восприимчивости и фертильности, то есть во время проэструса или фазы течки. В любом случае, спаривание должно быть организовано в конце дня, так как грызуны ведут ночной образ жизни и, как правило, спариваются ночью. На следующее утро самку обследуют на предмет копулятивной пробки - белесой массы, состоящей из вагинальной жидкости и спермы, которая сохраняется в течение 12-24 часов после копуляции. Если копулятивная пробка визуально не заметна, аккуратно введите кончик тупого зонда в отверстие влагалища. Наличие копулятивной пробки будет препятствовать продвижению зонда в пределах 0,5 см от входа во влагалище. При случайном спаривании появление копулятивной пробки обычно занимает три дня. Наличие пробки подтверждает случку не гарантирует, что самка беременна.

После того, как наблюдается копулятивная пробка, самку следует наблюдать на наличие признаков беременности, таких как увеличение веса. Если закупоренная самка беременна, то день, когда пробка была обнаружена, является эмбриональным нулевым днем, или Е0, а следующий день считается первым днем беременности, или Е1, и так далее, вплоть до родов, то есть родов, которые составляют от 19 до 21 дня. Примерно через 20-24 часа после родов у самок крыс и мышей наступает течка, и они могут снова забеременеть.

В интенсивной схеме разведения, которая обычно используется для животных с короткой продолжительностью жизни из-за генетической мутации, самцы животных оставляют в клетке с самкой и щенками, чтобы самка могла немедленно зачать еще один помет. Эта схема может быть стрессовой для самки, так как она постоянно лактирует и вынашивает. Напротив, схема неинтенсивного разведения включает в себя отделение самки после того, как она заметно забеременела, и не возвращать ее в клетку самца до тех пор, пока ее помет не будет отлучен от груди, что делает эту схему разведения менее требовательной.

Существует множество факторов, которые могут повлиять на производительность разведения мышей и крыс. Давайте рассмотрим некоторые из них, которые встречаются чаще всего. Энергичность самок заводчиков во многом зависит от уровня инбридинга. Животные, которые являются аутбредными, гораздо более выносливы и энергичны, поэтому из них получаются более крупные и сильные пометы. Еще одним фактором, который может повлиять на производительность племени, является агрессивное поведение. Некоторые часто используемые штаммы, такие как мыши C57BL/6, имеют тенденцию проявлять агрессию, что может помешать размножению. При разведении агрессивного штамма за всеми пометами следует внимательно следить. Животных из помета, содержащего агрессивных щенков, не следует использовать для разведения. Колебания температуры, влажности и освещения могут привести к снижению эффективности разведения. Также было доказано, что шум и вибрации в помещениях для разведения вызывают вредные последствия. Животные с генетическими модификациями, как правило, менее выносливы и фертильны, и некоторые из мутаций могут привести к летальности детенышей до или вскоре после рождения.

Теперь давайте кратко рассмотрим, как отлучать щенков от этих лабораторных животных. Время начала отлучения отличается в зависимости от схемы разведения. При неинтенсивном разведении молодняк может быть отлучен от груди в возрасте 21-28 дней. Но в случае интенсивного разведения, щенков каждого помета отлучают от груди на 20-й день, чтобы старшие щенки не присутствовали при рождении следующего помета. Поскольку грызуны могут начать спаривание уже в возрасте 8 недель, детенышей мужского и женского пола разделяют при отъеме. По возможности только что отлученных от груди щенков не следует содержать поодиночке.

Если в помете содержится только один щенок определенного пола, следует попытаться содержать этого щенка вместе со щенками того же пола из другого помета. Возможные варианты содержания щенков при отъеме перечислены в рукописи ниже. Отлученных от груди мышей и крыс следует проверять ежедневно, чтобы убедиться, что они процветают. Для подачи пищи небольшое количество корма, по одной грануле на мышь, следует размещать на полу клетки в течение первых 7-10 дней, с дополнительным кормом в верхней части клетки. Это побудит животных перейти на грызунов-грызунов в качестве единственного источника пищи. Для подачи воды следует добавить бутылку, даже если животные содержатся на стеллажах с автоматической системой поения. Это необходимо для предотвращения обезвоживания.

Наконец, давайте посмотрим, как ученые используют собственный подход к селекции в своих интересах. Одним из наиболее распространенных применений организации спаривания является выведение мышей с измененным генотипом. Чтобы изучить функцию гена, исследователи часто нарушают его генетический код. Однако эти животные, как и люди, являются диплоидными и, таким образом, имеют две копии одного и того же гена. Следовательно, для того, чтобы полностью нарушить ген, измененных мышей необходимо разводить для получения животного с дисфункциональными обеими копиями, другими словами, гомозиготным нокаутом. Мышей с одной копией неблагополучной называют гетерозиготными или хетами.

Другим преимуществом организации вязки внутри компании является тестирование эффекта пренатального воздействия тестовых соединений. Например, здесь исследователи предусмотрели беременной женщине жидкую диету, содержащую алкоголь от Е7 до Е13. Затем на E13 они препарировали беременную самку, получили мозг плода и разрезали его на тонкие срезы. Наконец, окрашивание слайдов показало, что пренатальное воздействие алкоголя увеличивает гибель клеток в нервной ткани.

Наконец, разведение в домашних условиях также позволяет изучать постнатальные расстройства, такие как послеродовая депрессия. В этом исследовании ученые впервые переместили подстилку подальше от матери в период лактации. Затем, через 60 минут, они снова запустили щенков к матери. А чтобы вызвать стресс у самки, добавили в клетку нового самца-злоумышленника. Затем исследователи наблюдали за матерью на предмет материнской агрессии, которая включает в себя нападение и укус самца-нарушителя, а также за различные виды материнской заботы, такие как уход за щенком и кормление. Полученные данные показали, что стресс оказывает существенное влияние как на послеродовую материнскую агрессию, так и на уход.

Вы только что посмотрели видео JoVE об основах разведения и отлучения от груди мышей и крыс в лаборатории. Теперь вы должны лучше понимать цикл течки у грызунов, а также знать, как определить стадию цикла и как использовать ее для создания успешных схем спаривания. Мы также рассмотрели факторы, которые могут повлиять на поведение при размножении, и объяснили, как и когда отлучать мышей и крысят. Как всегда, спасибо за просмотр!