В естественных условиях Биолюминесцентный изображения опухоли молочной железы Использование ИВИС Спектра

Чтобы начать эту процедуру, линию клеток опухоли молочной железы люциферазу размораживают из замороженных стеблей, а затем расширяют в культуре до 90% беглости COF. Серийное разведение суспензионных клеток затем засевают в 96. Лунка планшетов подвергается воздействию люциферова и затем оптимальное количество клеток, генерирующих флуоресцентное излучение выше 500 фотонов, определяется с помощью планшета. Затем клетки ридера вводятся, подкожно в бок животного, а затем вводится люцифераза.

Внутрибрюшинные клетки могут быть визуализированы уже через 10 минут после введения Люцифера, а опухолевая масса может быть визуализирована до месяца in vivo до начала некроза. Здравствуйте, я Эд Лим из лаборатории визуализации в Caliper Life Sciences в Аламеде, штат Калифорния. Сегодня мы покажем вам процедуру неинвазивного мониторинга роста опухолей у мышей с помощью биолюминесценции.

Эта процедура используется в нашей лаборатории и в лаборатории IVUS во всем мире для изучения роста и развития опухолей, особенно после лечения лекарственными препаратами. Итак, приступим. Эта процедура начинается с подготовки опухолевой клеточной линии к введению в мышь.

Широкий спектр линий люцифераз, экспрессирующих раковые клетки, может быть использован для биолюминесцентных доклинических экспериментов. Эти клетки поставляются в виде свободной от патогенов замороженной культуры, которая будет легко расти в стандартных средах без необходимости использования селекционных маркеров. Для нашего эксперимента мы будем использовать линию опухолевых опухолей молочной железы 41 Luke two, которая экспрессирует ген люциферазы, служащий оптическим индикатором экспрессии генов или опухолевого генеза.

In vivo мы будем использовать экспрессию люциферазы для отслеживания роста первичной опухоли неинвазивным способом, но она также может быть использована для локализации и мониторинга метастатических поражений. Перед инъекцией необходимо проверить активность люциферазы, и для этого трипсином собирают 90%-ную колбу конфлюента, а затем подсчитывают. Затем 50 000 клеток дозируют в одну лунку микротитровального планшета и проводят серийное разведение.

Люцифер добавляют в лунки в концентрации 150 микрограмм на миллилитр и выдерживают в течение двух минут. Микропланшет может быть визуализирован в режиме ВСУЗИ или с помощью люминесцентного считывателя пластин для определения уровней экспрессии. Эта клеточная линия экспрессирует до 6 500 фотонов в секунду на клетку, но любой уровень экспрессии выше 30 фотонов в секунду на ячейку может быть успешно визуализирован in vivo.

Теперь, когда у нас есть клетки оптимальной активности, можно приступать к этапу подкожной инъекции. Для того, чтобы облегчить оптимальное обнаружение опухоли, мы используем линию голых мышей с ослабленным иммунитетом А. Перед инъекцией животных обезболивают с использованием 3% ISO фтора в течение пяти минут для глубокой анестезии.

Далее мы введем 250 000 клеток в сотню микролитров PBS подкожно в боковую область. Загрузите элементы в одномиллилитровый шприц и прикрепите иглу 26 калибра. Аккуратно приподнимите кожу с помощью щипцов, чтобы сделать палатку, и введите клетки у основания.

Вновь введенные клетки могут быть немедленно визуализированы. Затем в брюшную полость вводится в общей сложности 150 миллиграммов Люцифера на килограмм массы тела с помощью двух инъекций. В этом исследовании животные визуализировались через 10 минут после инъекции люцифериана, чтобы обеспечить постоянный поток фотонов.

Мы покажем вам это на следующем шаге. Для нашего эксперимента мы будем использовать систему визуализации спектра ВСУЗИ in vivo, в которой используется устройство с обратной связью, охлажденное до отрицательных 90 градусов Цельсия для достижения максимальной чувствительности. Для поддержки абсолютного количественного определения система измеряет темновой заряд во время простоя и выполняет самокалибровку во время инициализации.

Чтобы начать визуализацию, инициализируйте систему ВСУЗИ и задайте параметры визуализации для эксперимента. Выберите поле зрения. Для числа визуализируемых животных в приборе может содержаться до пяти животных с использованием встроенного анестезирующего коллектора.

Стадия находится на постоянной 37 градусах Цельсия для поддержания температуры тела у животных. Порт ЭКГ предназначен для мониторинга здоровья животных во время стрессовых процедур в программном обеспечении для визуализации в реальном времени, время F-ступени и связывание пикселей могут быть оптимизированы на основе уровня экспрессии клеточной линии. Эти настройки можно изменить в любой момент эксперимента без влияния на количественный результат.

Ivus получает фотографическое изображение животного под белым светом в количественном биолюминесцентном или флуоресцентном сигнале, который накладывается на изображение, биолюминесцентный сигнал выражается в фотонах в секунду и отображается в виде карты интенсивности. Отображение изображения регулируется для обеспечения оптимальной контрастности и разрешения изображения без влияния на количественную оценку. Люминесценция клеток может быть измерена в месте инъекции с использованием области интереса. Инструмент.

Данные измерений отображаются в таблице вместе со всеми экспериментальными параметрами, относящимися к захвату изображения, которые можно сохранить или экспортировать. Для анализа может быть получено несколько изображений и проведено их сравнение, а также продольные исследования, охватывающие секунды или месяцы, в зависимости от характера эксперимента. Мы измерим поток фотонов от опухоли в нулевое время и будем наблюдать за ним в течение четырех недель.

При визуализации с интервалом в две недели поток фотонов из опухоли пропорционален количеству живых клеток, экспрессирующих люциферазу. Таким образом, биолюминесценция напрямую коррелирует с размером опухоли через пять дней после имплантации. Опухоль еще не пальпируется, но клетки могут быть количественно оценены с помощью биолюминесценции, и видно, что опухоль активно растет.

На этом этапе сигнал биолюминесценции намного сильнее. Время экспозиции, f-ступень и вращение пикселей можно регулировать так, чтобы изображение было четким, а камера не насыщалась. ВСУЗИ автоматически компенсирует изменения в светосборе.

Таким образом, эти измерения можно сравнить с теми, которые были собраны ранее и позже. В эксперименте. Через 15 дней после имплантации опухоли прощупываются, а измерение биолюминесценции уже дало данные за 15 дней.

На 28 день постимплантационные опухоли приобретают некротический характер, и клетки начинают отмирать. Размер опухоли, оцененный по измерению штангенциркуля, заметно не изменяется, но люминесценция опухоли уменьшается. Измерение калибра и биолюминесценции может быть продолжено до тех пор, пока не будет достигнута гуманная конечная точка.

На некроз опухоли из-за гипоксии или схем лечения будет показано снижение биолюминесценции, даже если они не уменьшают массу опухоли. Мы только что показали вам, как контролировать развитие подкожных опухолей, простую модель мыши с ксенотрансплантатом с помощью биолюминесцентной визуализации. При проведении этой процедуры важно не забывать проверять уровень экспрессии ваших клеток перед имплантацией.

Во-вторых, для максимальной воспроизводимости изображения животных в оптимальные сроки после люциферианской инъекции. Чувствительность метода позволяет контролировать развитие опухоли на ранних стадиях, поскольку опухоли могут быть измерены с помощью биолюминесценции задолго до того, как их можно будет надежно измерить с помощью штангенциркуля. Не забывайте оптимизировать параметры визуализации на каждом этапе Этот люминесцентный сигнал не насыщает, но с помощью люминесценции животных можно количественно контролировать в течение нескольких месяцев для изучения эффектов ремиссии и рецидива.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.