Первичные культуры взрослых Миоциты сердца крысы

В этой статье мы описали типичный способ, чтобы изолировать и культуры взрослых миоцитах сердца крысы. Коллагеназы и протеаз, которые используются, чтобы переварить и выделить одного миоцитов. Миоциты культурный следовать этому протоколу отвечает большинству требований эксперимента.

Процедура начинается с иссечения сердца у взрослой крысы и подвешивания его на перфузионной системе. Ферментным растворам дают перфузировать около 30 минут, после чего удаляют сердце. Измельченное и ферментативное пищеварение позволяет продолжить в небольшом стакане.

В конце разложения клетки диссоциируются в одноклеточную суспензию путем механического перемешивания и фильтруются в стерильную пробирку. Первичные клетки сердца трижды промывают в буферах с возрастающей концентрацией кальция, ресуспендируют в культуре в среде и наносят на посуды для культуры тканей, покрытые ламинатом. Привет, я Шахи из лаборатории Генри Коуа на кафедре физиологии и клеточной физики Колумбийского университета.

Сегодня мы покажем вам процедуру выделения и культивирования других клеток сердца крысы. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения кальциевых каналов в сердце. Итак, приступим.

За день до операции на крысах убедитесь, что все растворы готовы, но пока не добавляйте никаких ферментов. Буферы А В и промывочный буфер должны быть отфильтрованы на стерильность перед хранением при четырех градусах Цельсия. В-шестых, планшеты для культивирования тканей также должны быть покрыты раствором ламината накануне и храниться при температуре 37 градусов Цельсия в CO2-инкубаторе.

В день операции. Подготовьте хирургические инструменты, продезинфицировав зажимные ножницы и щипцы с 70% этанолом, и дайте им высохнуть на бумажном полотенце. Делается готовым шприц объемом в один миллилитр, наполненный половиной миллилитра раствора гепарина.

В настоящее время хорошей практикой является промывка перфузионного аппарата, проходящего через 70% этанол, перистальтическим насосом в обратном направлении. После завершения, промывка этанолом, ополаскивание аппарата двойной дистиллированной водой и, наконец, промывка буфером А. Проточный поток собирается в стакан и помещается на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия. Чтобы подготовить очищенный аппарат, заполните правую трубку шприца 40 миллилитрами буфера А, а левую шприц-трубку - 40 миллилитров буфера В. Подготовьте перфузионную трубку к кончику катетера, позволив буферу А протекать через аппарат.

Наполните буфер шприцем до уровня 40 миллилитров. Убедитесь, что после этого шага в трубке нет пузырьков воздуха, теперь перекройте буфер шприцем с клапаном запорного крана и повторите процесс таким образом, чтобы трубка для обильности теперь была заполнена буфером B. Аппарат для обильности окончательно готов и остается с буфером. B Запорный кран клапана открывается, но подача прекращается.

С помощью регулятора на внутривенной линии отбросьте буферный поток в сборном стакане. Последнее, что нужно сделать перед операцией, это добавить необходимые ферменты в исходный раствор, а затем отфильтровать ферментный раствор так же, как другие растворы были отфильтрованы накануне. После фильтрации этот раствор можно оставить при комнатной температуре в соответствии со стандартным протоколом.

Усыпьте крысу изофтором в газовой камере. Продезинфицируйте область разреза на грудной клетке с помощью 70% этанола. Откройте грудную клетку с помощью ножниц и обнажите сердце.

Введите в левый желудочек 0,5 миллилитра раствора гепарина. Удалите сердце с неповрежденной большой частью аорты. Немедленно введите катетер в аорту.

Типичное сердце крысы должно давать высокую долю здоровых палочковидных миоцитов и небольшое количество мертвых округлых клеток. Если следующая процедура соблюдена правильно, для начала прижмите аорту к катетеру. Кончик катетера не должен проталкиваться слишком глубоко внутрь сердца, чтобы обеспечить хорошую перфузию сердца через коронарную артерию.

После пережатия перевязать аорту к катетеру с помощью шва. Затем откройте регулятор внутривенной линии, чтобы обеспечить быструю скорость капания и позволить буферной пчеле промыть сердце во время промывки буферной пчелой. С помощью маленьких ножниц и щипцов удалите предсердия и любую жировую или легочную ткань, прилипающую к сердцу.

После того как буфер B будет завершен, переключите поток на некоторое время в положение буфера. Буферу А дают течь в течение пяти минут. Подогрейте ферментный раствор на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия.

Когда буфер А исчерпан из шприца, но все еще присутствует в трубке, в шприц А аппарата для обильного питания поступает 50 миллилитров раствора фермента. Теперь необходимо отбросить весь поток из стакана на водяной бане до тех пор, пока ферментный раствор не проникнет в сердце. Как только ферментный раствор проникнет в сердце, активируйте перистальтический насос, который настроен на перенос ферментного раствора из сборного стакана в пополняемый шприц.

Дайте ферментному раствору протекать через сердце в течение 10 минут. По мере того, как сердце переваривается, оно начинает выглядеть вздутым при приеме 37,5 микролитров 0,1 молярного хлорида кальция на раствор фермента в шприце А, чтобы дать эффективную концентрацию 0,1 миллимолярного кальция. Это первое из нескольких добавлений хлорида кальция, используемых для увеличения концентрации через 10 минут, увеличения концентрации кальция до 0,2 миллимоляра путем добавления дополнительных 50 микролитров 0,1 молярного хлорида кальция в шприц А и продолжения производства в течение следующих 10 минут.

По прошествии 10 минут отрежьте желудочки и переложите сердце в небольшой стерильный стакан, содержащий в стакане 20 миллилитров раствора фермента. Увеличьте концентрацию кальция до 0,4 миллимоляра, добавив еще 40 микролитров 0,1 моляра хлорида кальция, аккуратно измельчите сердце на 10 или более кусочков с помощью пары небольших стерильных ножниц. Теперь инкубируйте стакан при температуре 37 градусов Цельсия с легким покачиванием.

После пяти минут инкубации добавьте 40 микролитров 0,1 молярного хлорида кальция, чтобы получить эффективную концентрацию 0,6 миллимоляра кальция, и аккуратно перемешайте кусочки сердца с помощью пластиковой переводной пипетки от трех до пяти раз после инкубации в течение дополнительных пяти минут при 37 градусах Цельсия, добавьте 40 микролитров 0,1 молярного хлорида кальция и аккуратно повторите, как раньше. Используйте стерильный фильтр 500 микрометров, чтобы отделить переваренные отдельные миоциты от непереваренной соединительной ткани. Дайте клеткам отстояться в 50-миллилитровой пробирке в течение 10 минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью переноса VI Осторожно восстановите клетки в промывном буфере номер один и дайте клеткам отстояться от 10 до 20 минут при комнатной температуре, пока клетки оседают.

Возьмите небольшую аликвоту и используйте это время как возможность оценить качество и жизнеспособность клеток в суспензии под перевернутым микроскопом. Хороший препарат должен иметь высокую долю стержневидных клеток с четкими бороздками. Как только клетки осядут, выбросьте снаут и аккуратно восстановите клетки в буфере для промывки.

Номер два, дайте клеткам отстояться при комнатной температуре, на что опять же должно уйти от 10 до 20 минут и выбросьте надосадочную жидкость. Осторожно ресуспендируйте клетки в 5% сывороточной среде перед переносом клеток в планшеты для культуры тканей. Вымойте пластины одним XSFM.

Перенесите клетки с желаемой плотностью и инкубируйте в инкубаторе для культур тканей CO2. В течение трех-пяти часов переключите среду на одну XSFM-клетку, которую можно культивировать в течение четырех дней и использовать по мере необходимости для экспериментов. При правильном выполнении протокола под инвертированным микроскопом должно быть более 70% живых миоцитов сердца.

Это изолированные миоциты, трансфицированные YFP REM после культивирования в течение 48 часов. Клетки этого качества обычно культивируются с помощью этой процедуры. Мы просто покажем вам, как изолировать и культивировать эти горячие клетки.

При выполнении этой процедуры важно помнить, что нужно быть как можно быстрее и аккуратнее. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.