Цыпленок Ех ово Культура и Ех ово CAM Пробирной: как это действительно работает

Куриных chorioallantoic мембраны (CAM) является уникальным, естественно иммунодефицитных благоприятные условия для изучения культуры ангиогенеза и опухолей. Это видео статья демонстрирует различные этапы на куриных Ех ово Культура, применение потенциально ангиогенных веществ и успешной прививки опухолевых клеток и тканей на поверхности CAM.

Здравствуйте, меня зовут Сьюзан Паа. Я из Института физиологической химии, отделения биохимической эндокринологии Университета Бург-Эсен в Германии. Привет, я Даниэль Зе Басиан Доул.

Я из того же учреждения, что и Сьюзен. Здравствуйте, я Манн из Института анатомии кафедры нейротерапии в Университете Бурга. Мы покажем вам, как на самом деле работают культура CH X и сомембранное эссе.

Итак, давайте перейдем в лабораторию. В большинстве недавних экспериментальных исследований кулачок, представляющий собой мембрану Чико, обнажался путем разрезания окна в яичной скорлупе, а эксперименты проводились в ovo, что привело к значительным ограничениям в доступе к CAM и в возможностях наблюдения и фотодокументирования эффектов. Х-ово-культуры эмбрионов цыплят значительно облегчают доступ к камере и эмбриону цыпленка.

Пожалуйста, обратите внимание на бьющееся сердце, позволяющее легко in vivo документировать эффекты и экспериментальные манипуляции с эмбрионом. В нашей видеостатье мы предоставим пошаговую демонстрацию успешного применения культуры X ovo для решения большого количества научных вопросов. Яйца инкубируют в инкубаторе с движущимся лотком.

Здесь вы можете увидеть, как нагревательный элемент и движитель лотка вращают яйца 12 раз в день непрерывно. Влажность поддерживается на уровне 60% путем добавления воды в пластиковые емкости на дне инкубатора, а температура инкубации устанавливается на уровне 37,5 градусов по Цельсию перед началом инкубации. Грязь, перья и экскременты тщательно удаляют со скорлупы, механически протирая яйца этанолом или дезинфицирующим средством, однако значительно снижают показатели выживаемости зародышей.

Яйца располагаются горизонтально на движущемся лотке инкубатора. Пожалуйста, убедитесь, что расстояние между отдельными яйцами достаточно, чтобы обеспечить свободное вращение. После инкубации в течение 72 часов яйца извлекаются из инкубатора, а верхняя сторона яиц, где находится эмбрион, отмечается карандашом.

Так как эмбрион в определенной степени сопротивляется вращению и остается здесь расположенным, для лучшего самочувствия не следует использовать перчатки, чтобы разбить яйца, а руки следует продезинфицировать 70% этанолом. Яйцо держат горизонтально с отметкой карандаша сверху и трескают по краю треугольной магнитной перемешивающей планкой Для максимального контроля силы во время процедур раскалывания локти не должны упираться в столешницу. Важно, чтобы скорлупа яйца, а также яичная оболочка были открыты во время растрескивания, вытекание яичного белка является безопасным признаком того, что оболочка яйца была продырявлена.

Яйцо хранится близко ко дну блюда патриот. Чтобы избежать дальнейшей утечки яичного белка во время этой процедуры первоначального вскрытия, важно, чтобы яичный белок на дне блюд патриот все еще был соединен с остальным внутри яйца. Поскольку это приводит к возникновению вакуума внутри яйца, удерживающего желток на месте, путем мягкого надавливания на меридиан, проходящий через трещину и экватор яйца большим и средним пальцами, можно регулировать вакуум и выдавливание содержимого яйца.

Содержимое яйца затем можно переложить в чашку Петри с неповрежденным желтком. Если яйцо осторожно поднять и осторожно отделить обе половины скорлупы, то культуры ex ovo помещают на поднос, возвращают в инкубатор и выдерживают при температуре от 37,5 до 38,2 градусов по Цельсию и влажности 70%. Подача углекислого газа или кислорода не требуется.

Если используются специальные посуды-патриоты с прокладками между крышкой и чашкой и инкубаторы с вентиляционной решеткой, вентиляционную решетку следует держать наполовину открытой. Автоклавная фильтровальная бумага используется в качестве поддерживающего материала для жидких веществ, наносимых на кулачок, поскольку они, по-видимому, вызывают наименьшее раздражение кулачка. Место нанесения должно находиться на полпути между эмбрионом и границей кулачка, так как в противном случае эмбрион препятствует микроскопическому наблюдению эффектов в проходящем свете.

Жидкость здесь атропин следует наносить сразу после установки фильтра на кулачок, чтобы избежать высыхания. Либо дополнительные дозы, либо буфер следует применять повторно каждый день. Когда кулачок полностью разработан, может быть применено до шести различных образцов, и их эффекты могут быть сравнены на одном кулачковом кольце, вырезанном из одного миллилитра пипетки, наконечник должен быть разрезан как можно тоньше, чтобы минимизировать вес и избежать вдавливания кулачка.

Затем кольцо прикладывается к кулачку, и клетки пипетируются в кольцо. Микролитровый шприц Hamilton промывают несколько раз 70% этанолом и, наконец, стерильным фосфатным буферным раствором или PBS, Микрошприц заполняют приготовленной клеточной суспензией осторожно, но быстро проникают в кулачковый и глазной слои с помощью иглы шприца и непрерывно вводят клеточную суспензию. Игла должна оставаться в глазу в течение нескольких секунд, чтобы избежать потери введенной клеточной суспензии путем проверки на утечку X Ovo.

В качестве доноров почек конечностей используются культуры яиц, инкубированных в течение трех дней. Эмбрион рассекается из соединенных желтковых сосудов. Разрезав круг, эмбрион переносят в чашку Петри, наполненную холодным стерильным PBS с помощью маленькой дренажной ложки и промывают путем перемешивания.

Затем эмбрион переносят в свежую чашку Петри, наполненную стерильным PBS и освобождают от окружающих оболочек, осторожно разрывая их тонкими щипцами. Почки конечностей отделяются щипцами как можно ближе к телу, захватываются и переносятся в кулачок курицы-хозяина в возрасте от 8 до 10 дней. В нужном месте применения кулачок избирательно травмируется путем аккуратного соскабливания одним куском щипцов.

Затем трансплантат захватывается и накладывается на кулачок с помощью другого куска щипцов. Жертвенная самка мышки закреплена на доске. Брюшную стенку смачивают 70%-ным этанолом, разрезают по средней линии, а кожные лоскуты фиксируют латерально булавками.

Матка удаляется из брюшной полости, отделяется и перекладывается в стакан. С холодными ПБС. Эмбриональные оболочки осторожно удаляются с помощью щипцов в демонстрационных целях.

Здесь показан эмбрион мыши в возрасте 16 дней для лучшей видимости зачатков конечностей. Оптимальные результаты прививки только получаются. Однако, если используются зачатки конечностей от 10 до 13 дней эмбрионов, то зачатки конечностей обрезают или используют тонкие щипцы как можно ближе к телу.

В желаемом месте применения КАМ избирательно травмируется путем аккуратного соскабливания щипцами. Затем почки конечностей захватываются и переносятся в КАМ восьми-10-дневного цыпленка-хозяина. Трансплантат размещается один или два раза на той стороне кулачка, где не предполагается окончательное удаление избытка PBS.

Трансплантаты идеально размещаются на кулачке рядом с Y-образной бифуркацией опухоли кровеносного сосуда. Биопсия разрезается на один-два кубических миллиметра стерильными скальпелями. Забор материала с поверхности биопсии увеличивает риск загрязнения мышечной или соединительной тканью.

В нужном месте нанесения CAM избирательно травмируется путем бережного соскабливания. Кусочек ядра биопсийного образца прививается к CAM курицы-хозяина в возрасте от 8 до 10 дней. Трансплантаты идеально размещаются на кулачке рядом с Y-образной бифуркацией кровеносного сосуда.

Затем трансплантат переносится в CAM с минимальным PBS. Легкое давление может быть приложено для маневрирования трансплантата в образовавшемся углублении кулачка. Эмбрион цыпленка-хозяина погибает путем обезглавливания.

CAM с прикрепленным графтом удаляют круговым разрезом и переносят в чашку Петри, заполненную PBS. Излишки CAM вырезаются из трансплантата, за исключением бывшего места прикрепления. Снова на нужном месте приложения.

Камеру нового эмбриона цыпленка-хозяина избирательно травмируют путем бережного выскабливания, и трансплантат переносится на камеру второго хозяина с минимальным прикреплением PBS. Мы только что продемонстрировали, как на самом деле работает CH X или культура. Я показал вам преимущества по сравнению с экспериментами с Орвалем и привел несколько примеров его применения.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.