Single-единицы В естественных условиях Записи из зрительных нервов Крысы

Сегодня мы продемонстрируем систему записи, которую мы разработали для записи in vivo из оптического хиазма крысы. Эти типы записей были очень редки у крыс, отчасти потому, что аксоны ганглиозных клеток сетчатки, составляющие зрительный нерв, очень малы, что затрудняет запись с отдельных клеток, а поскольку крысы являются распространенной животной моделью дегенерации сетчатки, эти типы записей могут дать много полезной информации. Ключом к получению этих записей были разработанные нами вольфовые витражные электроды с длинным острым наконечником, позволяющим регистрировать потенциалы действия от аксонов тонкого диаметра с высоким соотношением сигнал/шум.

Мы проведем вас через процесс изготовления этих электродов и покажем, как мы настраиваем животное на стереотаксическом аппарате, а затем покажем вам пример записи последовательностей спайков из одной ганглиозной клетки. Для изготовления электродов необходимы три основных вида оборудования, для изготовления микропипеток – стандартная стеклодувка. Для заточки вольфрама используется швейная машинка, а для объектива — стандартный микроскоп с 40-кратным увеличением.

Кроме того, необходимо графитовое кольцо с прикрепленным полюсом и оно будет помещено в концентрированный раствор гидроксида калия и нитрата натрия. Его помещают под швейную руку, а затем к швейной руке приклеивают тонкий кусок вольфрамовой проволоки, частично погружая его в раствор. Затем провода прикладываются к графитовому столбу с одного конца в швейной руке.

На других будут приложены два вольта поперек выводов и включается швейная машинка. При этом данстон погружается в раствор и электромагнитно затачивает его в течение двух минут. После того, как вольфрам заточен, его осторожно снимают со швейной руки, затем опускают в воду для удаления излишков раствора, а затем помещают под микроскоп под объективом 40 раз.

Стеклянная микропипетка имеет отверстие небольшого диаметра, примерно от одного до двух микрон в диаметре. Затем заточенный вольфрам осторожно вставляется в задний конец микропипетки и проталкивается механическим микроманипулятором. Вольфрам очень осторожно проталкивается через торец стекла.

Важно, чтобы между вольфрамом и стеклом было плотное прилегание, и обычно нажимают достаточно, чтобы небольшое количество стекла действительно откололось. Небольшое количество сумасшедшего клея можно нанести на задний конец микропипетки, чтобы прикрепить тунг к стеклу. Теперь, когда изготовление электрода завершено, его импеданс измеряется с помощью испытания импеданса металлического электрода.

Как правило, мы ищем импедансы около одного мегаома. Затем электрод убирают в футляр для безопасного хранения, так как он очень хрупкий. Визуальные стимулы представлены на мониторе, который размещен на подвижной платформе.

Одеяло с подогревом используется для контроля температуры тела животного, а стереотаксическая система позволяет осуществлять грубое движение микропривода, которое показано здесь. Металлический корпус в подкожных инъекциях направляет игольчатый щиток, записывающий электрод действует для снижения уровня шума. Направляющая игла вводится в мозг, и с помощью микропривода медленно опускается электрод через направляющую иглу.

Это показано на рисунке, где металлический корпус опускается на перекладину, которая будет опираться на череп животного. Направляющая игла будет выступать ниже перекладины, как показано на рисунке, а электрический контакт между металлическим корпусом и перекладиной снижает уровень шума. Затем животное кладут на одеяло с подогревом.

Амбушюры аккуратно вставлены. На этом этапе важно убедиться, что голова остается ровной. Затем вставляется зубной стержень, чтобы убедиться, что головка находится во всех направлениях.

Ректальный зонд вводится с помощью вазелина. При этом будет измеряться температура тела, которая затем используется для контроля температуры нагревательного одеяла. Температура тела должна оставаться в пределах от 36 до 37 градусов.

Один провод ЭКГ вставляется в кожу для контроля частоты сердечных сокращений, которая обычно составляет около 300 футов в минуту. Частота сердечных сокращений является хорошим показателем глубины анестезии. Жизненные показатели животного постоянно контролируются с помощью специального программного обеспечения.

К ним относятся артериальное давление, называемое CO2, температура тела и частота сердечных сокращений. Затем кожа удаляется с верхней части черепа, и череп обнажается. Важно тщательно очистить череп, чтобы увидеть правильные маркеры черепа, которые используются для поиска зрительного хиазма.

Затем перекладина в сборе устанавливается на место. Это используется для того, чтобы обвести пятимиллиметровый круг на черепе, который затем будет просверлен и удален. Отверстие будет просверлено вокруг маркера черепа bgma, изображенного здесь.

Обнаженный череп показан круглой карандашной пометкой вокруг bgma, которая будет просверлина перед сверлением черепа. Стереотаксическая система должна быть откалибрована торемой, и это делается путем точного выравнивания направляющей иглы на bgma и документирования положения стереосистемы. После сверления череп удаляется, а мозг обнажается.

После того, как череп просверлен, животное парализуют и вентилируют, чтобы предотвратить движения глаз. Делается это с помощью внутривенного введения гамина. Дыхание тщательно контролируется как оно есть, а когда дыхание останавливается, вентиляционная трубка вставляется в трахеальный соединитель, после чего животное искусственно дышит.

Затем направляющая игла опускается в мозг. Регистрирующий электрод будет опущен через гьял примерно на 8-10 миллиметров ниже черепа, где можно будет регистрировать потенциалы действия от зрительных клеток в зрительном хиазме. Электрод медленно загружается в мозг.

С помощью микропривода можно услышать, как зрительная клетка спонтанно прислушивается к клеточному сигналу, реагирует на присутствие ручной палочки в своем рецептивном поле. Затем представлена дрейфующая градация, и на этом этапе любые интересующие нас визуальные стимулы могут быть использованы для изучения ответных свойств ганглиозных клеток сетчатки с помощью оптического хиазма. Запись.