Рассмотрение теломер G-навес структуры в Trypanosoma brucei

Общей целью данного эксперимента является изучение структуры свеса теломер G. В ловушку попадают клетки Брюси. Нативный при гель-гибридизации использует специфичный для последовательности олигозонд для гибридизации с одноцепочечной областью теломеры в нативных условиях.

Эта одноцепочечная область является областью выступа теломеры G, и, следовательно, количество гибридизованного олигозонда представляет собой его адаптер длины. Лигирование позволяет определить конечную последовательность выступа теломер G при маркировке уникального олиго. Этот метод включает в себя лигирование специфичного для последовательности адаптера к концу структуры выступа теломер G для анализа первичного расширения, опосредованного лигированием.

Направляющая олиго помечена и анальна к уникальному олиго, прежде чем она будет перевязана к концам хромосом. После лигирования проводится первичное удлинение с помощью Т-4 ДНК-полимеразы. Длина G-выступа может быть определена, так как произведение n минус шесть нуклеотидов длиннее, чем фактический G-выступ, где N представляет собой длину направляющего олиго в адаптере.

Здравствуйте, меня зовут Би Бо, я доцент кафедры биологических, геологических и экологических наук в Кливлендском государственном университете. Привет, я Джио. Я учусь в аспирантуре в лаборатории доктора Ли, и сегодня мы покажем вам процедуру анализа структуры Гео Ханка.

Мы используем эту процедуру для изучения структуры и функций теломер в Трапассо при работе с радиоактивностью. Как и в данном эксперименте, необходимо соблюдать надлежащие меры предосторожности. Прежде чем предпринимать такие действия, следует проконсультироваться с отделом охраны окружающей среды, здоровья и безопасности учреждения.

В этом видео некоторые из этих прекурсоров отсутствуют только в демонстрационных целях. Итак, приступим. Принцип этой части процедуры заключается в том, что в нативных условиях непомеченный зонд tell C содержит четыре повтора C-C-C-T-A.

Олиго может гибридизоваться только с одноцепочечной областью выступа теломер G. Таким образом, интенсивность гибридизации пропорциональна длине выступа. После денатурации и нейтрализации один и тот же зонд сможет гибридизоваться со всей областью теломер

Интенсивность этой гибридизации представляет собой общее количество теломерной ДНК и используется в качестве контроля нагрузки. Окончательный уровень выступа G может быть рассчитан путем деления нативного сигнала гибридизации на сигнал, полученный после денатурации. Эта процедура начинается с разделения интактных хромосом с помощью прошедшего полевого гель-электрофореза или PFGE, который требует, чтобы геномная ДНК была подготовлена в агросных пробках, чтобы избежать механического сдвига ДНК для достижения этой первой растворимой низкой температуры плавления, или LMP agros в буфере L до 1,6% при сохранении его в тепле при 50 градусах Цельсия, затем собрать 200 миллионов клеток T брюси путем центрифугирования.

Удалите супинат и ресуспендируйте клеточную гранулу с L-буфером до конечной концентрации 5 миллионов клеток на миллилитр. Инкубируйте клеточную суспензию при температуре от 42 до 50 градусов Цельсия в течение 10 минут. Затем добавьте один объем 1,6%LMP на один объем клеток и быстро хорошо перемешайте 85 микролитров клеточной суспензии в каждой лунке одноразовой пробковой формы.

Как только пробки затвердеют, перенесите их в коническую трубку объемом 15 миллилитров с пятью миллилитрами L-буфера и 1% сарко-ячейкой. Добавьте щепотку порошка протеиназы К. Хорошо перемешайте и выдерживайте при температуре 50 градусов Цельсия в течение 48 часов.

После инкубации выбросьте буфер и дважды промойте пробки пятью миллилитрами L-буфера. Затем повторить расщепление протеиназы К в буфере L для удара SAR Caol в течение еще 48 часов. Снова промойте пробки свежим L-буфером и храните их при температуре четыре градуса Цельсия в L-буфере.

Эти вилки следует использовать в течение двух недель. Приготовьте гель agros с пробками ДНК, как описано в письменном протоколе. Далее запустите гель в поваре DR двух единиц.

После PFGE гель окрашивается, фотографируется и высушивается. Как только гель высохнет, поместите гель в мешок для гибридизации и добавьте 20 миллилитров буфера для предварительной гибридизации. Удалите как можно больше воздуха из пакета и закройте пакет.

Инкубируйте пакет для гибридизации на водяной бане при температуре 50 градусов Цельсия с легким покачиванием в течение не менее одного часа, предварительно гибридизуя гелевую этикетку. Олигозонды инкубируют реакцию при 37 градусах Цельсия в течение одного часа. Затем добавьте в реакционную смесь 90 микролитров буфера TNES.

Чтобы очистить зонд с маркировкой, установите его поверх предварительно изготовленной колонки G 25. Промойте его 700 микролитрами буфера TNAS и разбавьте зонд в 600 микролитрах. После предварительной гибридизации геля прокипятите маркированный зонд в течение пяти минут и добавьте его в 25 миллилитров свежего буфера для предварительной гибридизации.

Чтобы сделать буфер для гибридизации, снимите буфер предварительной гибридизации с рукавного фильтра. Простерилизуйте гибридизационную смесь с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм и добавьте ее непосредственно в мешок для гибридизации. Закройте пакет и положите его в неглубокую емкость с теплой водой.

Поместите всю емкость на водяную баню при температуре 50 градусов Цельсия и инкубируйте ее в течение ночи, слегка покачивая. На следующий день вырежьте небольшое отверстие в пакете для гибридизации в коническую трубку объемом 50 миллилитров. Вылейте как можно больше гибридизационной смеси.

Держите зонд в замороженном состоянии при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Достаньте гель из пакета для гибридизации и положите его в емкость, промойте и высушите гель, как описано в письменном протоколе. После высыхания оберните гель полиэтиленовой пленкой и подвергните его воздействию фосфоскопического имиджера примерно на три дня.

Через три дня просканируйте фосфоскоп для проведения гибридизации после денатурации. Начните с инкубации геля в денатурирующем буфере при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем смойте гель и нейтрализующий буфер в течение 30 минут.

Далее смойте гель в дистиллированной воде в течение трех минут. Предварительно гибридизируйте гель при температуре 55 градусов Цельсия в течение одного часа. Повторите гибридизацию с использованием того же зонда, содержащего смесь для гибридизации, что и раньше, но при температуре 55 градусов Цельсия в течение ночи после гибридизации.

Вымойте и высушите гель, как и раньше. Затем оберните гель и подвергните его воздействию фосфоскопического тепловизора примерно на два часа. Отсканируйте фосфовизор Окончательно нормализуйте сигнал гибридизации, полученный до денатурации, с сигналом, полученным после денатурации.

В этой части процедуры Т, простой терминальный нуклеотид, определяется путем лигирования адаптера. Уникальный олиго помечается анилом к направляющим олигону и лигируется к концу теломер. Только в том случае, если уникальный направляющий адаптер имеет три основных вылета, совместимый с последовательностью концевых теломер, адаптер будет лигирован.

Для Т. Брюси. Теломеры могут оканчиваться в одном из шести различных нуклеотидов ТТ, повторяется GGG. Следовательно, для начала этого процесса используются шесть различных направляющих олигон.

Обработайте уникальный олиго киназой, смешав шесть микролитров по 10 моль на микролитр уникального олиго с тремя микролитрами 10-кратного PNK-буфера, пятью микролитрами гамма-P 32 A TP, 14 микролитрами двойной дистиллированной воды и двумя микролитрами T четырех PNK. Выдерживайте смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Затем используйте набор для быстрого удаления нуклеотидов в каяке, чтобы удалить невключенный горячий A TP и элюировать.

На торце маркируется олиго с 60 микролитрами элюирующего буфера. Для получения конечной концентрации около одного Р моль на микролитр для создания адаптера необходимо вставить на колени уникальный олиго к направляющему олиго. Добавьте 10 микролитров очищенного уникального олиго к двум микролитрам каждого направляющего олиго и одному микролитру буфера для коленопреклонения.

Поместите трубки в нагревательный блок с температурой 85 градусов Цельсия и выключите нагревательный блок. Дайте трубкам и нагревательному блоку остыть до температуры RI в течение нескольких часов. Затем лигируйте адаптеры к общей геномной ДНК.

Инкубируйте смесь при температуре 16 градусов Цельсия в ПЦР-машине на ночь. После ночной инкубации проведите расщепление эндонуклеазы рестрикции, как описано в письменном протоколе. Добавьте в каждый образец три микролитра 10-кратного оранжевого красителя G.

Загрузите образцы ДНК в гель размером 20 на 20 сантиметров 0,7% агроса. Запустите гель при напряжении 30 вольт в течение 30 минут. Затем продолжайте с более высоким напряжением, поддерживая напряжение менее 120 вольт, всего 1000 вольт в течение одного часа.

После того, как гель потечет, отсканируйте бромистый гель AUM с помощью сканера тайфуна. Наконец, высушите гель agros и подвергните высушенный гель воздействию фосфо-имиджера на ночь. При лигионно-опосредованном удлинении праймера направляющее олиго помечается концом и прикрепляется к уникальному олиго, прежде чем оно перевязывается только до концов хромосомы.

Уникальный направляющий адаптер с тремя основными свесами, совместимый с вылетом G, будет лигирован. После удаления нелигированных олигон пар первичное удлинение может быть осуществлено с помощью Т-четырех ДНК-полимеразы, в которой отсутствует смещение нити и активность эндонуклеазы от пяти до трех прайм-три. Таким образом, конечная длина удлиненного направляющего олиго отражает длину свеса G.

Чтобы начать лигирование, опосредованное киназой удлинения праймера, обработайте уникальным олиго, и направляющее олиго инкубируйте обе смеси при температуре 37 градусов Цельсия в течение 60 минут. Анил руководящий олиго и уникальный олиго, соединив 10 микролитров фосфорилированного, уникального олиго и 10 микролитров конечного маркированного направляющего олиго в 1,5-миллилитровой пробирке эйнора, анил олиго и лигейт анил олиго. Уникальный олигоадаптер к теломере заканчивается, как описано ранее, осаждает ДНК и выполняет первичное удлинение, как описано в письменном протоколе.

Приготовьте гель из 10% акриламида, семи моляров мочевины, однократный ТПЭ для запуска средств для наращивания. Загрузите в гель по четыре микролитра каждого предварительно отваренного образца с добавлением красителя. Запустите гель при напряжении 800 вольт в одном TBE, пока синий краситель не достигнет дна геля.

Впоследствии снимите гель со стеклянной пластины. Установите сушилку для геля на уровне 65 градусов Цельсия в течение 30 минут и высушите гель, продолжайте сушить еще 30 минут после того, как сушка геля вернется к комнатной температуре, окончательно подвергшись воздействию фосфографического имиджера в течение двух часов. Показаны интактные хромосомы tbrc, разделенные с помощью PFGE.

Клетки Т. Брюси обычно содержат около 100 копий мини-хромосом, все с одинаковым размером, которые мигрируют в одно и то же положение на геле. В связи с этим фактом после гибридизации с олигозондом TC сигнал выступа теломер G наиболее заметен на минихромосомах. После денатурации и нейтрализации гибридизация с олигозондом TLC выявляет сигналы теломер на всех концах хромосом.

Гибридизация с помощью олигозонда TLG обычно не дает никакого сигнала о гибридизации, поскольку клетки T. brucey не имеют структур выступа теломер C. После денатурации и нейтрализации гибридизация с олигозондом Tel G также выявляет сигналы теломер на всех концах хромосом. Загрузка равных количеств ДНК в каждую полосу имеет важное значение для определения концевого нуклеотида теломер с помощью анализа лигирования адаптера, и это показано окрашиванием геля бромидом дия в этом протоколе, меченные концы уникального олиго и направляющие олигоадаптеры лигируются только к концам хромосомы, при этом последовательность выступа теломер g совместима с направляющим олиго.

Поскольку уникальный олиго имеет торцевую маркировку, продукт лигирования будет радиоактивным и подаст сильный сигнал. Первая полоса подает сильный сигнал, указывающий на то, что большое количество уникального адаптера TG one было перевязано к концу теломер. TG one имеет конечную последовательность C-C-C-T-A, следовательно, теломера g нависает над этим адаптером и является TT A GGG.

При использовании других направляющих олигонотидов не наблюдается значительного количества продукта лигирования, что указывает на то, что теломеры, оканчивающиеся на TT A GGG, преобладают в клетках T. brucey. При загрузке на торец маркированного направляющего олиго служит как отрицательный контроль, так и маркер размера без лигирования. Размеченное на конце направляющее олиго имеет длину 22 нуклеотида.

Полоса примерно на 44 нуклеотидах, скорее всего, является остатком неденатурированного адаптера после лигирования к концу хромосомы. Размер удлиненного изделия отражает длину конструкции со свесом G. Большинство выступов теломер G T brucey заканчиваются на TT A GGG.

Тем не менее, эти G-выступы кажутся очень короткими и составляют около 10 нуклеотидов. Поскольку продукты, отросшие от лигированного TG one guide oligo, не намного длиннее самого направляющего олиго, хотя только небольшое количество адаптера TG 4 было перевязано к концам теломер, продукты, отросшие от лигированного TG 4, намного длиннее, причем самый длинный продукт составляет около 55 нуклеотидов. Таким образом, в клетках tbrc наблюдались два типа структур выступа теломер G.

Если лигирование действительно является результатом структуры выступа теломер G, обработка геномной ДНК с помощью XO one или XOT, которые являются тремя основными нуклеазами, специфичными для выступа, должна привести к потере продуктов лигирования. Оба типа конструкций с перегрузками чувствительны к такой обработке. Мы только что показали вам, как анализировать структуру теломер giang в trapasso bru.

При выполнении этой процедуры важно помнить о загрузке равного количества образцов на каждую дорожку. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.