Выделение крипты из тонкой кишки мыши

Для выделения крипт из тонкой кишки мыши используйте правильно промытые фрагменты изолированной тонкой кишки мыши размером пять на пять миллиметров. Инкубируйте кусочки в антибиотиках PBS, содержащих два миллимоля ЭДТА, в течение 30 минут на льду, не встряхивая. Чтобы облегчить затвердевание внеклеточного матрикса, или ECM, предварительно инкубируйте 24-луночную пластину в инкубаторе для культивирования тканей при температуре 37 градусов Цельсия.

После аспирации раствора ЭДТА из фрагментов тканей добавьте 25 миллилитров свежих холодных антибиотиков PBS. Затем энергично встряхните контейнер рукой от 30 до 40 раз. Отфильтруйте суспензию один раз через сетчатый фильтр 70 микрон.

Прежде чем переходить к следующему шагу, подтвердите наличие склепов под микроскопом. Затем центрифугируйте суспензию при 390 G и четырех градусах Цельсия в течение трех минут. Затем повторно суспендируйте гранулу крипты в 20 миллилитрах DMEM, содержащего 2% сорбита, далее называемого сорбитолом DMEM.

Перелейте 10 миллилитров суспензии крипты в каждую из двух новых 15-миллилитровых пробирок. На этот раз центрифугируйте две пробирки с более низкой скоростью 80 G в течение трех минут при четырех градусах Цельсия, чтобы отделить большие клеточные массы от клеток или мусора. Аккуратно аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя около двух миллилитров надосадочной жидкости в каждой пробирке.

Затем добавьте 10 миллилитров сорбита DMEM в каждую пробирку. Снова центрифугируйте суспензию при 80 G и четырех градусах Цельсия в течение трех минут. Аспирируйте надосадочную жидкость, как показано ранее, и добавьте 10 миллилитров сорбита DMEM для повторной суспендирования.

После аспирации надосадочной жидкости добавьте 10 миллилитров полного DMEM и повторно суспендируйте гранулу путем пипетки вверх и вниз. Оставьте суспензию на одну минуту для эффективного получения плавающих склепов. Через одну минуту отфильтруйте суспензию из обеих пробирок в свежую пробирку через 70-микронное ситечко для очистки крипт.

Чтобы подсчитать чистые крипты перед посевом, капните 25 микролитровых капель в шестисантиметровую посуду в трех точках. Подсчитайте количество крипт под микроскопом при 4-кратном увеличении и рассчитайте концентрацию крипт на 25 микролитров. Затем центрифугируйте весь фильтрат при 290 г в течение трех минут при четырех градусах Цельсия.

Для посева суспендируют крипты в ECM в концентрации 100 крипт на 40 микролитров ECM. Пипеткой вверх и вниз от пяти до 10 раз, осторожно избегая пузырьков воздуха, чтобы получить однородную суспензию. Затем засейте 40 микролитров суспензии крипты на лунку в предварительно разогретую 24-луночную тарелку.

Инкубируйте 24-луночную пластину в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа для полимеризации ECM. Покройте ECM на лунку 500 микролитрами питательной среды, содержащей эпидермальный фактор роста мыши, рекомбинантный мышиный R-спондин 1 и рекомбинантный мышиный ноггин. Здесь показана окончательная концентрация материалов на скважину.

Культивируйте крипты, инкубируя при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Выполняйте визуализацию в реальном времени для записи морфогенеза органоидов с помощью микроскопа Timelapse каждые три часа в течение семи дней и получайте последовательные Z-образные изображения. Почти все изолированные крипты были немедленно запечатаны и выглядели конусообразными, когда их выдавливали из эпителиальных ниш.

Далее склепы в конечной фракции были интегрированы и пригодны для использования в культуре. Таймлапс-изображения роста органоидов показали, что активная пролиферация и дифференцировка стволовых клеток кишечника происходила в области крипты с почкованием. Почкование сочеталось с миграцией клеток, пролиферацией и дифференцировкой клеток панета.