Анализ ДНК двухцепочечной Break (DSB) Ремонт в клетках млекопитающих

В этом видеопротоколе продемонстрирован метод измерения эффективности и точности восстановления двухцепочечного тормоза ДНК с помощью NHEJ или HR в клеточной линии млекопитающих. Процедура начинается с создания клеточной линии, содержащей хромосомно интегрированную единственную копию NHEJ или репортерной кассеты HR. Затем эти репортерные клетки трансфицируют смесью I SCE, одну из которых экспрессируют плазмиду и красный DS, и одну плазмиду.

Я сцеживаюсь. Одна эндонуклеаза вызывает двухцепочечный разрыв в репортерной конструкции, а DS RED служит в качестве трансфекционного контроля. Процентное соотношение GFP-положительных и DS-положительных эритроцитов затем анализируется по факсу для количественной оценки эффективности NHEJ или HR, если это необходимо.

Точность восстановления анализируется путем спасения продуктов репортера в кишечной палочке и секвенирования продуктов восстановления. Таким образом, эффективность и точность разрыва цепи дублета или репарации DSB в данной клеточной линии определяется на основе количественного определения событий репарации в потоке и секвенирования продуктов репарации. Этот метод имеет много преимуществ перед существующими методами анализа ремонта двухструнных тормозов.

Прежде всего, этот метод специально дифференцирует гомологичную рекомбинацию от негомологичной и присоединяющейся. Затем метод является высококоличественным, что позволяет анализировать миллионы клеток с помощью проточной цитометрии, и тогда метод не требует обширной упаковки клеток после завершения репарации для отбора устойчивых к антибиотикам cls. И последнее, за завершением ремонта можно следить в режиме реального времени, глядя на внешний вид зеленых ячеек.

И этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области репарации, такие как измерение HR и эффективности репарации HEGA в мутантных типах клеток вируса или после медикаментозного лечения. Исследуйте репарацию А на разных стадиях клеточного цикла и измеряйте скорость репарации так обще. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что важно достичь хорошей эффективности трансфекции.

В этой процедуре. Две репортерные кассеты используются для анализа на репарацию двухцепочечных разрывов ДНК. Одна кассета используется для обследования негомологичного соединения концов или ремонта N-H-E-J-D-N-A.

Другой используется для изучения гомологичной рекомбинации или репарации HR-ДНК негомологичного конца. Соединительная репортерная кассета содержит ген GFP с сконструированным трехкилобазовым интроном из гена PEM one или GFP PEM one. Короче говоря, введение P one содержит аденовирусный экзон, окруженный последовательностями узнавания для хинди три и I SCE одна эндонуклеазы для индукции двухцепочечных разрывов.

I SCE one сайты имеют инвертированную ориентацию, I SCE one имеет непалиндромную последовательность узнавания, следовательно, два инвертированных сайта генерируют несовместимость. ДНК заканчивается несовместимо. Концы ДНК лучше всего имитируют естественно встречающиеся dss.

Неупорядоченная кассета NAEJ является GFP-отрицательной, так как аденовирусный экзон разрушает G-F-P-O-R-F. При индукции двухцепочечных разрывов ДНК одним из них аденовирусный экзон удаляется, и NHEJ восстанавливает функцию гена GFP. Гомологично рекомбинационная репортерная кассета также основана на конструкции GFP PEM one в кассете HR.

Первый экзон G FP PEM one содержит делецию 22 пар оснований в сочетании с вставкой трех сайтов рестрикции. I SCE один хинди три I SCE E один. Удаление гарантирует, что GFP не может быть восстановлен событием NHEJ и здесь.

Сайты I SCE one находятся в инвертированной ориентации. Таким образом, I SCE одно пищеварение оставляет несовместимые концы. За первой копией GFP PMM следует промоутер за вычетом TG, меньше первого экзона и вступлением GFP M1. Интактная конструкция является GFP-отрицательной при индукции разрыва двухцепочечной системы с помощью I sce E одного пищеварения.

Функциональный ген GFP восстанавливается путем конверсии гена между двумя мутировавшими копиями первого GFP PMM, одним экзоном, другими типами репарации DSB, такими как скрещивание через одноцепочечное коленопреклонение. И NHEJ не будет восстанавливать ген GFP. Так как вторая копия гена GFP отсутствует

Первый кодон А TG и разрешение второго экзона при кроссинговере или одноцепочечном коленопревании не восстанавливают активность GFP. Таким образом, такая конструкция позволяет выявлять исключительное разрешение путем конверсии генов, которая является преобладающим путем HR в клетках млекопитающих. Чтобы начать эту процедуру, используйте набор endo free от Kyogen для приготовления высококачественного запаса плазмиды NHEJ или HR reporter, линеаризируйте 10 микрограммов плазмиды и очистите ДНК от раствора для пищеварения.

Обратитесь к прилагаемому письменному протоколу для получения подробной информации о подготовке плазмиды. При подготовке к трансфекции. Убедитесь, что нормальные человеческие фибробласты поддерживаются в наилучших условиях выращивания.

Если вы начинаете с замороженного флакона, разделите клетки дважды перед трансфекцией. Если начать с пластины слияния клеток расщепления, то после одного раза вырастут клетки до 70-80% слияния. На это уходит около двух дней для пяти умножить на 10 до пятой части ячеек, покрытых 100-миллиметровой пластиной.

Для достижения наилучшей эффективности трансфекции вовлекайте клетки в логарифмический рост. Активно растущая культура содержит клетки в стадии М, видимые в виде округлых клеток, прикрепленных к поверхности для трансфекционного сбора примерно в два раза 10 из шести клеток с двух 100-миллиметровых пластин. Очень важно не переборщить с трипсином: клетки прекращают прием трипсина, как только 80% клеток отделятся от пластины.

Повторно суспендируйте клетки в растворе NHDF. Поскольку клетки чувствительны к раствору NHDF, сведите к минимуму время инкубации и аккуратно перемешайте клетки. Затем используйте амакса-нуклеоэффектор для трансфекции клеток 0,5 микрограммами линеаризованной репортерной конструкции для нормальных фибробластов человека.

Эти условия трансфекции приводят к интегрированию одной копии репортерной конструкции в течение большей части интегра через 24 часа после трансфекции в одном миллиграмм на миллилитр генетического или G 4 18. Чтобы отобрать клетки с хромосомно интегрированными репортерными конструкциями, продолжайте отбор в течение 7-10 дней, затем выберите либо отдельные колонии G 4 1 8, либо объедините резистентные клоны. Разверните культуру примерно до пяти 100-миллиметровых пластин.

Заморозьте три пластины впрок, а оставшиеся две пластины разверните до пяти раз по 10 до пятой ячейки на 100 миллиметровую пластину. Десяти стомиллиметровых пластин обычно достаточно для пяти трансфектов. Через два дня после осаждения клетки, содержащие репортерную конструкцию, достигли 70-80% конфлюенции со смесью пяти микрограммов I sce одной экспрессирующей плазмиды и 0,1 микрограмма красной плазмиды DS.

Для контроля эффективности трансфекции используйте нуклеоэффектор AM maxon для трансфекции примерно в два раза 10 из шести клеток из логарифмически растущей культуры. Поскольку эффективность DSP измеряется как отношение GFP-положительных и DS-положительных эритроцитов, вариации в смеси ISCE one и DS красной плазмиды могут повлиять на результаты. Качество плазмиды также может влиять на результаты, изменяя эффективность трансфекции.

Поэтому для получения согласованных измерений важно использовать одну и ту же смесь плазмид в рамках одного эксперимента. Трансфектировать примерно в два раза по 10 из шести клеток. Три контрольных элемента представляют собой пять микрограммов EGFP, экспрессирующих плазмиду, пять микрограммов DS, красную плазмиду и пять микрограммов.

Контрольная плазмида, которая не экспрессирует флуоресцентный белок. Через трое суток после трансфекции проверить эффективность трансфекции и экспрессию красных белков GFP и DS с помощью флуоресцентного инвертированного микроскопа с фильтрами для детекции GFP и DS. Красным цветом клетки выращивают еще за сутки до факсимильного анализа, через четыре дня после трансфекции забирают I SCE одну трансфицированную клетку и контрольные клетки. На этом этапе критически важно собрать все клетки и иметь клетки круглой формы.

Чтобы добиться этого, используйте более длительное время трипсина или более высокую концентрацию трипсина. Рассмотрите клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что 99% клеток отделены от пластины и имеют круглую форму. Повторно суспендируйте элементы в 500 микролитрах PBS и перенесите на факсимильные трубки.

Держите клетки на льду и защищайте их от света, пока есть возможность хранить клетки на льду в течение нескольких часов. Для достижения наилучших результатов анализируйте клетки сразу после сбора урожая. Затем откалибруйте факты с помощью TFP DS RED и отрицательного контроля.

Отрегулируйте напряжение и цветовую компенсацию, чтобы включить в анализ все флуоресцентные элементы. Следует иметь в виду, что интенсивность флуоресценции экспериментальных образцов ниже, чем у контрольных образцов. После калибровки фактов с контрольной группой, проанализируйте количество трансфицированных клеток I SCE не менее 20 000 клеток для каждого лечения, чтобы предотвратить потенциальную интерференцию между GFP и ds.

Красная флуоресценция удерживает процент GFP-положительных или DS-положительных эритроцитов ниже 25%Если процент выше, уменьшите количество DS RED или I sce E на одну плазмиду. Процент GFP-положительных клеток соответствует эффективности репарации D-N-A-D-S-P, а процент DS-положительных эритроцитов указывает на эффективность трансфекции. Рассчитайте относительную эффективность репарации D-N-A-D-S-P как отношение GFP-положительных клеток к DS-положительным эритроцитам.

Чтобы определить точность исправленных предписаний, репортер спасает конструкции, переваривая геномную ДНК с помощью циркуляризации фермента eco R one и превращая их в компетентные клетки кишечной палочки. Это спасение возможно, поскольку исходные конструкции содержат бактериальное происхождение репликации, проанализированной с помощью рестрикции, переваривания и секвенирования. Таковы типичные факты, результаты контрольных транссекций и экспериментов NHEJ и HR.

Интенсивность флуоресценции и количество флуоресцентных клеток ниже в I SCE с одной трансфицированной клеткой по сравнению с контрольной группой. Разница в сигнале флуоресценции обусловлена разницей в числе копий конструкций GFP и DS RED в этих клетках. Каждая клетка в эксперименте содержит одну копию интегрированной репортерной конструкции.

Таким образом, успешные события репарации восстанавливают ген GFP во фракции клеток. Эффективность NHEJ и HR рассчитывается как отношение GFP-положительных и положительных DS-эритроцитов. NHEA является более эффективным процессом, чем HR в клетках человека, в фибробластах человека эффективность NHEJ обычно составляет от 0,6 до 1,3, а эффективность HR составляет от 0,05 до 0,3.

Этот метод проложил путь исследователям в области репарации ДНК к изучению роли различных факторов в HEG и HR, а также к изучению кинетики и регуляции NHEG и HR в клетках млекопитающих. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как измерить эффективность и точность HR и GJ в клетках млекопитающих с помощью флуоресцентного анализа.